离子液体萃取青霉素及酶促催化反应耦合制备半合成抗生素6－氨基青霉烷酸的方法

摘要

本发明涉及青霉素发酵液萃取和酶促催化反应一体化制备半合成抗药物中间体的工艺方法，特别涉及离子液体萃取青霉素及酶促催化反应耦合制备半合成抗生素6－氨基青霉烷酸的方法。利用亲水性离子液体形成的双水相，将青霉素萃取到含离子液体的上相，用疏水离子液体进行二次萃取，能使亲水离子液体被萃取到疏水相中，而萃余相的青霉素水溶液可直接进行酶促催化，酶活可达水相80％以上。本发明与传统工业用有机溶剂从水相萃取青霉素，纯化后再进行酶催化制备半合抗药物的工艺相比，不采用有机溶剂，是完全绿色化过程，同时疏水离子液体的二次萃取能将亲水性离子液体从青霉素水溶液中分离出来，保证后续水相酶催化工艺的效率。

说明书

技术领域

本发明涉及青霉素发酵液萃取和酶促催化反应一体化制备半合成抗药物中间体的工艺方法，特别涉及离子液体萃取青霉素及酶促催化反应耦合制备半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法。

背景技术

6-APA(6-氨基青霉烷酸)是制药行业重要的中间体，它采用青霉素为原料，在青霉素酰化酶的催化下水解生成目标产物6-APA与副产物PAA(苯乙酸)， 

而6-APA可以继续合成其它类型的半合成抗生素。现有青霉素的生产方法是将青霉素发酵液固液分离后，利用有机萃取溶剂从青霉素滤液中提取青霉素，经过反萃、结晶与干燥等步骤得到产品青霉素，然后溶解于水溶液进行酶促催化反应。该工艺存在三大缺点：一是萃取过程需要调低pH值，造成青霉素的效价降低以及蛋白质的乳化现象；二是有机溶剂污染环境；三是青霉素提取与酶催化步骤不连续，浪费了能量(Process Biochemistry，vol 8，146～152，1989)。

针对以上问题，人们尝试采用双水相萃取青霉素，并直接在青霉素萃取相中进行酶催化反应。实验发现，聚乙二醇(PEG)-盐体系对青霉素的分配系数可达10以上，没有环境污染，而且酶在双水相中能保证一定的活性。但PEG原料难以回收，导致纯化产物非常困难，限制了工业的实际用途(Sep.Sci.Technol.，1996，131，2589～2594.)。

离子液体是新型绿色溶剂，具有结构可调、性质多变的特点，在溶剂萃取与有机催化方面已有广泛的应用。刘庆芬等报道了用亲水性离子液体形成的双水相萃取青霉素，得到94％的萃取率(《科学通报》，Vol 50(4)，756～759，2005)。但该法没有考虑青霉素水相与亲水离子液体间的分离，导致青霉素水相中离子液体含量过高，降低了后续酶催化的活性，阻碍了青霉素萃取反应生产半合成药物中间体6-APA耦合工艺的实现。本申请提出在离子液体双水相萃取青霉素的基础上，采用疏水离子液体进行二次萃取，将青霉素萃取相中的亲水离子液体萃入到疏水离子液体相，大大减少了青霉素萃余相的离子液体的含量，保证后续酶催化反应的活性(见附图1)。如此，使青霉素萃取反应耦合一体化工艺得以实现。

发明内容

本发明的目的是实现离子液体双水相-二次萃取青霉素及酶促催化反应制备半合抗药物中间体耦合新工艺，利用亲水-疏水离子液体之间吸引作用改善青霉素水相的酶催化效率的方法，提出离子液体萃取青霉素及酶促催化反应耦合制备半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法。

本发明的离子液体萃取青霉素及酶促催化反应耦合制备半合成抗生素6-氨基青霉烷酸的方法，包括以下步骤：

(1).离子液体双水相的制备与青霉素的萃取过程

向青霉素发酵液中加入亲水离子液体和无机盐，使混合液中的青霉素质量百分含量为0.5～8％，亲水离子液体的质量百分含量为10～50％，无机盐的质量百分含量为10～30％；搅拌混合后静置出现平衡的两相，青霉素进入离子液体轻相；

(2).疏水离子液体二次萃取回收离子液体原料

取步骤(1)含亲水离子液体轻相的萃取水溶液，优选轻相中亲水离子液体的浓度为20～70wt％，加入疏水离子液体，将疏水离子液体与亲水离子液体的水溶液相比控制在1∶1～1∶30范围内。振荡离心后，90％以上的亲水离子液体会被萃入到疏水离子液体相中，而萃余相是含绝大部分青霉素与少量无机盐的水溶液。

(3).处理后的青霉素水溶液进行酶促催化反应

取步骤(2)二次萃取后含青霉素与无机盐的水溶液，加入固定化青霉素酰化酶，固定化青霉素酰化酶在混合液中的浓度控制在5～25mg/ml之间，37℃振荡反应，测定初始反应酶活，分离得到6-氨基青霉烷酸。

所述的步骤(2)得到的包含亲水-疏水两种离子液体的混合物，经纯水洗脱有68％以上的亲水离子液体分离析出，用于步骤(1)。

所述的步骤(2)得到的包含亲水-疏水两种离子液体的混合物，经升温到70℃以上有83％以上的亲水离子液体分离析出，用于步骤(1)。

所述的亲水性离子液体的阳离子包括咪唑盐、吡啶盐以及季胺盐等，亲水性离子液体的阴离子类型可为四氟硼酸盐[BF₄]^-、Br^-或Cl^-等。

所述的疏水性离子液体的阴离子类型可为六氟磷酸盐[PF₆]^-或[(CF₃SO₂)₂N]^-等。疏水性离子液体的阳离子为咪唑盐，优选疏水离子液体是[C₄mim]PF₆(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐)。

所述的咪唑盐选自1-乙基-3-甲基咪唑[C₂mim]⁺、1-丁基-3-甲基咪唑[C₄mim]⁺、1-辛基-3-甲基咪唑[C₈mim]⁺、1-乙基-2，3-甲基咪唑[C₂dmim]⁺或1-丁基-2，3-甲基咪唑[C₄dmim]⁺中的一种等。

所述的吡啶盐是1-乙基吡啶[C₂py]⁺或1-丁基-3-甲基咪唑[C₄py]⁺等。

所述的季胺盐是1，2，3，4-四丁基胺[(C₄H₉)₄N]⁺或1，2，3-三乙基-4-辛基胺[(C₂H₅)₃NC₈H₁₇]⁺等。

所述的无机盐是NaH₂PO₄、Na₂HPO₄或(NH₄)SO₄等。

本发明采用亲水离子液体与无机盐形成的双水相，将青霉素萃取到离子液体上相。而该相经疏水离子液体二次萃取后，亲水性离子液体会萃入到疏水离子液体，而青霉素保留在水溶液中，二者顺利实现分离。含青霉素的萃余水相可直接进行酶催化反应，而被萃入疏水相的亲水离子液体可经水洗循环利用。如图1所示。

从青霉素的酶催化过程可看出，萃取后水相中的青霉素经青霉素酰化酶在37℃催化3小时，得到产物6-APA与副产物PAA，产率达95％以上。

从图2含亲水性离子液体[C₄mim]BF₄与青霉素的水溶液被[C₄mim]PF₆二次萃取的效果图看出，当疏水离子液体与亲水性离子液体水溶液保持相比在1∶10，随水溶液中无机盐含量增加(离子液体双水相需要一定量的无机盐)，亲水离子液体的二次萃取率逐渐升高，从没有无机盐时的35％上升到无机盐浓度为20％盐时90％萃取率，而青霉素的萃取率不超过10％，因此，水相中亲水离子液体与青霉素实现分离。

本发明以离子液体双水相与疏水性离子液体二次萃取结合的工艺替代传统青霉素萃取工艺，实现青霉素萃取反应耦合制备半合抗药物中间体的绿色新工艺。在采用离子液体双水相萃取发酵液内青霉素的基础上，其萃取液可利用疏水离子液体进行二次萃取，将所含的大部分亲水离子液体从溶液中得以分离，而降低了离子液体含量的青霉素萃余相水溶液可直接用于酶促催化反应，其酶活可达到水相80％以上。整个过程只采用离子液体与无机盐，属于绿色化过程，优于使用挥发性有机溶剂传统工艺。

本发明二次萃取后的青霉素水溶液，在5～25mg/ml酶用量时酶活能超过纯水的80％以上。

本发明具有以下特点：

(1)疏水性离子液体对青霉素轻相的萃取作用，可实现亲水性离子液体与青霉素水溶液的分离，达到降低酶催化水相中亲水离子液体含量的目的。

(2)疏水性离子液体对水相中青霉素萃取率很低，可保证90％青霉素停留在水相。

(3)二次萃取后萃余相的青霉素水溶液可直接进行酶催化反应，酶活性可达纯水的70％以上，优化达85％。

(4)整个过程只采用离子液体与无机盐，是完全绿色化过程。

(5)可采用纯水及高温手段将亲水离子液体从疏水离子液体中洗脱出来，洗脱率可达83％，实现离子液体原料的循环再生。

(6)可根据反应需要，设计不同结构的离子液体，保证整个萃取催化过程的优化。

附图说明

图1.本发明离子液体萃取青霉素及酶促催化反应制备半合抗药物中间体耦合工艺流程示意图。

图2.本发明实施例1疏水离子液体[C₄mim]PF₆对亲水离子液体与青霉素的萃取率。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述：

1，疏水离子液体二次萃取分离亲水离子液体：

实施例1

取10ml双水相的离子液体轻相，含47％(w/w)[C₄mim]BF₄、18％(w/w)Na₂HPO₄·12H₂O及青霉素1.4％，加入2ml[C₄mim]PF₆，振荡2分钟，静置分层，可发现疏水相为5.8ml，80％的[C₄mim]BF₄被萃入疏水相，但少于4％的青霉素被萃取。上相水溶液体积6.2ml，含1.44％的青霉素以及少量Na₂HPO₄。取5ml含青霉素和Na₂HPO₄的水溶液加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为162IU/g，为纯水中190IU/g活性的85％。取5ml离子液体萃取相，直接采用1∶1相比的纯水洗涤，约52％的[C₄mim]BF₄从疏水相分离出来。

实施例2

取10ml双水相的离子液体轻相，含58％(w/w)[C₄mim]BF₄、9.3％(w/w)Na₂HPO₄·12H₂O及青霉素1％，加入1ml[C₄mim]PF₆，振荡2分钟，静置分层，疏水相为5.5ml，78％的[C₄mim]BF₄被萃入疏水相，6％的青霉素被萃取。上相体积5.5ml，含1.6％的青霉素以及少量Na₂HPO₄。取5ml含青霉素和Na₂HPO₄的萃余液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为145IU/g，为纯水中190IU/g活性的76％。取5ml离子液体萃取相，1∶1相比的纯水70℃洗涤，约93％的[C₄mim]BF₄从疏水相分离出来。

实施例3

取10ml双水相的离子液体轻相，含34.5％(w/w)[C₄mim]BF₄及21.4％(w/w)Na₂HPO₄·12H₂O，及青霉素0.8％，加入1ml[C₄mim]PF₆，振荡2min，静置分层，可发现疏水相为3.7ml，82％的[C₄mim]BF₄被萃入疏水相，但少于8％的青霉素被萃取。上相体积7.5ml，含0.9％的青霉素以及少量Na₂HPO₄。取5ml含青霉素和Na₂HPO₄的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为164IU/g，为纯水中190IU/g活性的85％。取3.5ml离子液体萃取相，直接采用1∶1相比的纯水洗涤，约56％的[C₄mim]BF₄从疏水相分离出来。

实施例4

取10ml双水相的离子液体轻相，含36％(w/w)[C₂mim]BF₄及14％(w/w)Na₂HPO₄·12H₂O，及青霉素1％，加入1ml[C₂mim]PF₆，振荡2min，静置分层，可发现疏水相为3.8ml，73％的[C₂mim]BF₄被萃入疏水相，但少于4％的青霉素被萃取。上相体积7.2ml，含1.6％的青霉素以及少量无机盐。取5ml含青霉素和Na₂HPO₄的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为132IU/g，为纯水中190IU/g活性的70％。取4ml所得的离子液体下相，采用1∶1相比的纯水，并升高温度到70℃，约91％的[C₂mim]BF₄从疏水相分离出来。

实施例5

取10ml双水相的离子液体轻相，含58％(w/w)[C₄mim]Br及24％(w/w)NaH₂PO₄·2H₂O，及青霉素1％，加入1ml[C₄mim]PF₆，振荡2min，静置分层，可发现疏水相为5.3ml，74％的[C₄mim]Br被萃入疏水相，但少于6％的青霉素被萃取。上相体积6.5ml，含1.5％的青霉素以及少量NaH₂PO₄。取5ml含青霉素和NaH₂PO₄的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为150IU/g，为纯水中190IU/g活性的80％。取5ml离子液体萃取相，直接采用1∶1相比的纯水洗涤，约72％的[C₄mim]Br从疏水相分离出来。

实施例6

取10ml双水相的离子液体轻相，含58％(w/w)[C₄mim]Br及24％(w/w)NaH₂PO₄·2H₂O，及青霉素1％，加入1ml[C₄mim][(CF₃SO₂)₂N]，振荡2min，静置分层，可发现疏水相为5.9ml，85％的[C₄mim]Br被萃入疏水相，但少于4％的青霉素被萃取。上相体积6.1ml，含1.5％的青霉素以及少量无机盐。取5ml含青霉素和NaH₂PO₄的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为172IU/g，为纯水中190IU/g活性的90％。取5ml离子液体萃取相，直接采用1∶1相比的纯水洗涤，约63％的[C₄mim]Br从疏水相分离出来。

实施例7

取10ml双水相的离子液体轻相，含43％(w/w)[C₄py]BF₄及24％(w/w)NaH₂PO₄·2H₂O，及青霉素1％，加入1ml[C₄mim]PF₆，振荡2min，静置分层，可发现疏水相为4.1ml，72％的[C₄py]BF₄被萃入疏水相，但少于8％的青霉素被萃取。上相体积6.9ml，含1.5％的青霉素以及少量无机盐。取5ml含青霉素和NaH₂PO₄的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为156IU/g，为纯水中190IU/g活性的82％。取4ml离子液体萃取相，直接采用1∶1相比的纯水洗涤，约67％的[C₄py]BF₄从疏水相分离出来。

实施例8

取10ml双水相的离子液体轻相，含52％(w/w)[(C₄H₉)₄N]Br及20％(w/w)Na₂HPO₄·12H₂O，及青霉素1％，加入1ml[C₂mim][(CF₃SO₂)₂N]，振荡2min，静置分层，可发现疏水相为5.1ml，79％的[(C₄H₉)₄N]Br被萃入疏水相，但少于7％的青霉素被萃取。上相体积5.9ml，含1.7％的青霉素以及少量Na₂HPO₄。取5ml含青霉素和Na₂HPO₄的水溶液，加入15mg固定化青霉素酰化酶，37℃反应，分离得到6-氨基青霉烷酸，测得酶活性为142IU/g，为纯水中190IU/g活性的75％。取5ml所得的离子液体下相，采用1∶1相比的纯水，并升高温度到70℃，约83％的[(C₄H₉)₄N]Br从疏水相分离出来。