一种利用超声波直接转化苹果属植物获得转基因苗木的方法

摘要

本发明“一种利用超声波直接转化苹果属植物获得转基因苗木的方法”属于生物工程育种领域。超声波直接转化法是将苹果属八棱海棠叶片切成小块在含有5％DMSO和20μl·ml－1质粒DNA的超声波缓冲液中用功率为80w的超声波处理后，放在再生培养基上培养进行抗性筛选，在超声波最佳处理条件下转化486个八棱海棠叶片，共得到237个抗性愈伤组织和9株抗性苗，转化率为1.85％，大大高于普通农杆菌介导法0.1～0.8％的转化效率。GUS染色、PCR及Southernblotting检测结果显示，有8个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因。

说明书

(一)技术领域

本发明“一种利用超声波直接转化苹果属植物获得转基因苗木的方法”属于生物工程育种领域，专用于提高苹果基因工程的外源基因的转化效率。

(二)背景技术

1超声波的特性和发生原理

频率超过能听到的声波范围(50～2×10⁴次/秒)的声波被称为超声波，其波长短于普通电波，可以在固体内部传播。超声波包括纵波和横波两种振动方式，质点振动方向与波的传播方向一致的称为纵波，垂直的称为横波，它们同时对物体产生影响，并很容易相互交换。

产生超声波的原理是当电压加至具有伸缩特征的材料上时，材料就会按照电压的正负和大小进行振动，产生超声波。在仪器中超声波产生的原理是一个短而持续时间的脉冲电压去激励换能器，从而产生短的超声脉冲。通常用来作脉冲激励源的电路是电容放电回路，并由换能器把电能转变成超声脉冲。

2超声波的生物学效用

一般认为超声波的生物学效应主要有机械作用、热化作用以及空化作用。

由于生物组织大多数属于软组织，因而在超声波的机械力作用下，其细微结构发生形变。这种形变将随着超声波强度的增强而增大，当增加到一定强度时，细胞就会被击穿。生物组织在超声波机械能的作用下由于黏滞吸收，将一部分超声转化为热能，使生物组织的温度上升，称为超声波的热化作用。在超声波作用下，还会产生空化作用，表现出空泡湮灭过程。小泡内部产生高温高压，甚至产生电离效应及放电，推测这可能是导致空泡周围细胞壁和质膜破损或可逆的质膜透性改变的主要机理，从而使细胞内外发生物质交换。

超声波的生物学效应根据不同的条件而会产生不同的结果。它即可以引起生物大分子甚至细胞的破坏，也可以促进生物大分子的合成和生物体的生长。这些条件包括超声波处理的频率、强度、作用时间和生物体的结构功能状态。

3超声波直接转导外源基因技术在植物遗传转化育种中的应用情况

超声波处理植物组织能在植物组织表形成大量的小孔，外源DNA分子可以以此为通道进入带壁的植物细胞，完成和植物基因组的整合，实现基因的转化。自从1990年，Joersbo和Brunstedt首次应用该方法将CAT基因转化进入甜菜基因组后，已经在诸多植物的遗传转化中得到了应用，详见下表

  转化植物  目的基因  研究人和时间  甜菜原生质体  烟草原生质体  甜菜悬浮细胞  烟草悬浮细胞  烟草叶片  小麦幼胚  玉米愈伤组织  烟草花粉  CAT  CAT  CAT  CAT  GUS  GUS  Bt  GUS  Joersbo和Brunstedt，1990  Joersbo和Brunstedt，1990  Joersbo和Brunstedt，1990  Joersbo和Brunstedt，1990  章力健等，1990  许宁等，1990  张宏等，1997  董云洲，1999

3.3超声波直接转导外源基因技术在植物遗传转化中的应用存在的问题和前景展望

将超声波技术应用于植物遗传转化中大大提高了遗传转化效率，而且超声波具有价格便宜，操作简单，不受宿主范围限制等诸多优点，因此具有巨大的应用潜力。但是超声波转化技术中也存在着一些不足之处亟待提高。

首先，诸多报道中虽然指出了超声波处理的具体参数，但是没有给出合理的指定参数的依据。而且在研究中使用的超声波仪器的型号均不同，这样就造成了实验参数没有普遍应用的价值。

其次，目前的研究仅仅限于对超声波参数研究，而很少涉及超声波参数和其它影响植物遗传转化效率的因素的互作效应的研究。

第三，超声波的应用范围还很窄，转化的植物大多是模式植物，转化的外源基因大多是报告基因。从超声波技术在果树遗传育种中的应用情况来看，目前只在番木瓜的遗传转化中得到了应用，而且所转化的外植体还是有性的胚，而不是可以可以使性状得到保持的无性外植体。

(三)发明内容

技术问题  本发明的目的是针对目前在苹果等木本植物基因工程育种中存在遗传转化效率较低的现状，提供利用超声波直接转导外源基因获得转基因株系的育种新方法。此种方法可作为商业用途的苹果外源基因转化在生产上直接使用。

技术方案

一种利用超声波直接转化苹果属植物获得转基因苗木的方法，其特征在于：

1)将苹果属八棱海棠叶片继代培养一个月左右的继代培养苗从上数第二或第三片展开叶的叶片取下，无菌条件下把叶片切成4×8mm八棱海棠叶片的小块放在50ml的三角瓶中，在含有体积比为5％二甲基亚砜、20μl·ml^-1包含目的基因rolC质粒DNA、15mmg·L^-1NaCl和1.5mmg·L^-1柠檬酸钠的超声波缓冲液中用功率为80w的超声波处理20分钟，用无菌水冲洗3次后，转移到再生培养基上，培养温度为26℃条件下暗培养3天后，在筛选培养基继续在培养温度为26℃黑暗条件下进行抗性筛选，并获得50mg·L^-1卡那霉素抗性条件下能够正常生长的抗性苗；

2)通过GUS染色、PCR及Southern blotting分子检测，获得整合了完整的外源rolC基因的转基因八棱海棠抗性苗。

有益效果

本发明针对超声波技术目前在植物遗传转化中存在的问题，在前人研究的基础上，首次将超声波技术应用到重要的经济作物苹果的遗传转化上。

在发明中首次给出了制定合理的超声波处理参数的依据，并将超声波直接转导法首次应用在对苹果叶片的遗传转化上。

该发明大大提高了苹果的遗传转化效率，具有重要的科研和生产意义。

本发明首次将超声波技术应用在苹果的遗传转化上，大大提高了苹果转基因的效率。应用超声波直接转导法转导rolC基因转化苹果砧木八棱海棠，获得了1.85％的转化效率，大大高于普通农杆菌介导法0.1～0.8％的转化效率。

(四)附图说明

图1prolC1质粒图谱

图2超声波处理对质粒完整性的影响

图3转基因八棱海棠植株 

图4gus染色结果

图5转基因八棱海棠的PCR检测

C：阴性对照，Z：阳性对照，1-8：转化株系1-8

图6转基因八棱海棠的Southern杂交检测

C：阴性对照，Z：阳性对照，1-8：转化株系1-8

(五)具体实施方法

1超声波直接转化法

1)超声波处理功率和时间对苹果叶片再生情况影响：

将苹果属八棱海棠叶片切成小块放在含有MS液体培养基的50ml三角瓶中，选择不同的超声波功率和时间组合进行超声波处理。将处理后的叶片转移到再生培养基上观察叶片生长情况和再生率。选择对叶片的生长和再生率影响较小的超声波时间和功率处理组合作为基因转化的参数。

确定超声波处理时间的上限之后，将超声波的处理功率和时间进行不同组合，研究其对八棱海棠叶片再生的影响。结果表明：不同的超声波处理组合对叶片再生率有显著的区别。(表1)

遗传转化需要再生率较高的叶片再生系统，因此我们选择八棱海棠叶片平均再生率在95％以上的14个处理组合进行后继的转化试验(T1，T5，T6，T9，T10，T11，T13，T14，T15，T16，T17，T18，T19，T20)。

                           表1不同超声波处理对八棱海棠叶片再生率的影响

  处  理  编  号  处  理  功  率   (  W  )  处  理  时  间  (  m  i  n  )                                    处理重复   叶  片  平  均  再  生  率  ％            I          II           III  叶  片  数  再  生  数  再  生  率   ％  叶  片  数  再  生  数  再  生  率   ％  叶  片  数  再  生  数   ％  再  生  数   ％  T1  T2  T3  T4  T5  T6    T7  T8  T9  T10   T11   T12  T13  T14   T15   T16  T17  T18  T19  T20  100  100  100  100  90  90    90  90  80  80   80   80  70  70   70   70  60  60  60  60  5  10  20  30  5  10    20  30  5  10   20   30  5  10   20   30  5  10  20  30  62  79  77  89  65  78    64  107  87  71   90   77  82  70   93   98  74  65  88  79  62  72  67  73  65  76    60  93  87  70   87   73  82  69   90   94  74  65  88  79  100  91  87  82  100  97    94  87  100  99   97   95  100  99   97   96  100  100  100  100  57  81  97  82  94  88    80  83  95  69   81   60  89  72   91   76  81  92  63  83  57  76  83  68  94  86    74  72  95  67   79   55  89  71   89   72  81  92  63  83  100  94  86  83  100  97    93  87  100  97   98   92  100  99   98   95  100  100  100  100  83  72  64  71  102  91    92  78  93  92   98   85  92  81   68   82  90  91  76  88  83  67  56  58  102  90    85  68  93  90   95   80  92  79   66   79  90  91  76  88  100  93  88  82  100  99    92  87  100  98   97   94  100  98   97   96  100  100  100  100  100.00Aa  92.68Ed  86.69Fe  82.21Gf  100.00Aa  97.87BC  b   92.88Ed  86.95Fe  100.00Aa  97.84BC  b  97.05CD  b  93.53Ed  100.00Aa  98.24AB  Cb  97.21CD  b  95.67Dc  100.00Aa  100.00Aa  100.00Aa  100.00Aa

2)超波处理功率和时间对转化质粒完整性的影响

选择不同的超声波功率和时间的组合对将用于转化的含有目的基因的质粒进行处理。将处理后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，观察质粒的完整性。选择对质粒的完整性没有影响的超声波功率和时间组合作为基因转化的参数。

在超声波处理功率为100w的条件下，分别处理质粒DNA 5，10，20，30，40min。结果发现质粒DNA在30min之内均能保持完整，而处理40min后发生降解(图2)。用超声波进行外源基因的直接遗传转化需要质粒的完整性，因此处理时间只能维持在30min之内。

3)确定超声波处理最佳参数

选择第1)部分和第2)部分所确定的参数组合的交集，对苹果叶片进行超声波直接转化，将转化后的叶片转移到再生培养基上预表达后，用GUS染色法对转化叶片进行染色，计算外源基因的瞬间表达率，选择瞬间表达率最高的超声波功率和时间处理组合为最佳处理组合。

                           表2不同超声波处理时间和处理功率对gus基因瞬间表达的影响

  处  理   编  号                                         处理重复  平  均  阳  性  比  率  (  ％  )  I  II  III   叶  片   数  阳  性  叶  片  数  阳  性  比  率  (％  )   叶  片   数  阳  性  叶  片  数  阳  性  比  率  (％  )   叶  片  数  阳  性  叶  片  数  阳  性  比  率  (％  )  T1  T5   T6  T9  T10  T11  T13  T14  T15  T16  T17  T18  T19  T20  36  38   33  34  40  28  34  33  39  29  34  33  38  31  11  8   13  8  13  20  7  14  20  20  2  2  3  2  30.56  21.05   39.39  23.53  32.50  71.43  20.59  42.42  51.28  68.97  5.88  6.06  7.89  6.45  41  32   36  34  37  39  33  31  30  32  32  31  30  32  11  7   13  10  13  27  5  12  13  22  1  2  2  3  26.83  21.88   36.11  29.41  35.14  69.23  15.15  38.71  43.33  68.75  3.13  6.45  6.67  9.37  30  27   32  38  42  36  31  28  36  35  32  37  36  34  8  6   13  8  16  30  6  10  19  24  1  2  2  3  26.67  22.22   40.63  21.05  38.10  83.33  19.35  35.71  52.78  68.57  3.13  5.41  5.56  8.82  28.02DEe  21.72EFf  g  38.71Cd  24.66EFe  35.25CDd  74.66Aa  18.36Fg  38.95Cd  49.13Bc  68.76Ab  4.05Gh  5.97Gh  6.71Gh  8.21Gh

14个超声波处理组合均能保持质粒的完整性，并能使八棱海棠的叶片再生率在95％以上，但是对gus基因瞬间表达的研究却发现，不同的超声波处理组合之间该基因的瞬间表达存在显著差异(表2)。

处理功率为60w的组合T17，T18，T19，T20的叶片gus染色阳性比率显著低于其它8个处理组合；处理时间为5min的组合T1，T5，T9，T13，T17的叶片gus染色阳性比率显著低于其它处理功率相同但处理时间较长的组合；处理组合T11和T16的叶片gus染色阳性比率显著高于其它的处理组合，即在保持质粒的完整性和叶片较高再生率的前提下，较长的处理时间和较高的处理功率有利于gus基因的瞬间表达。

4)确定最佳的DMSO(二甲基亚砜)浓度

选择超声波处理最佳组合对苹果叶片进行超声波处理，在超声波缓冲液(5％二甲基亚砜、20μl·ml^-1包含目的基因rolC质粒DNA、15mmg·L^-1NaCl和1.5mmg·L^-1柠檬酸钠)中加入不同浓度的DMSO，对苹果叶片进行超声波直接转化，将转化后的叶片转移到再生培养基上预表达后，用GUS染色法对转化叶片进行染色，计算外源基因的瞬间表达率，选择瞬间表达率最高的DMSO浓度处理作为最佳的DMSO处理浓度。

选择最佳处理功率和处理时间组合T11和T16，结合不同DMSO浓度处理，以筛选出最佳的超声波处理条件(表3)。

当DMSO浓度为5％时，处理T11和T16的gus基因瞬间表达率均得到显著的提高；但是当DMSO浓度提高到10％以上时，gus基因瞬间表达率反而显著降低。因

                                           表3不同DMSO浓度对gus基因瞬间表达的影响

  处  理  编   号  D  M  S  O  浓  度                                     处理重复   平  均  阳  性  比  率  (  ％  )           I             II             III    叶  片  数   阳  性  叶  片  数   阳  性  比  率  (  ％  )    叶  片  数   阳  性  叶  片  数   阳  性  比  率  (  ％  )    叶  片  数   阳  性  叶  片  数   阳  性  比  率  ％  T11  T11  T11  T11  T16  T16  T16   T16  0  5  10  20  0  5  1  0  20  28  54  57  51  29  48  52   59  20  49  30  24  20  38  25   20  71.43  90.74  52.63  47.06  68.97  79.17  48.08   33.90  39  62  54  57  32  63  51   56  27  55  27  23  22  50  27   18  69  89  50  40  69  79  53   32  36  58  60  50  35  55  61   53  30  50  29  24  24  45  30   20  83.33  86.21  48.33  48.00  68.57  81.82  49.18   37.74  74.66BCbc  88.55Aa  50.32Dd  45.14Dd  68.76Cc  80.12ABb  50.07Dd   34.59Ee

此5％为最佳的DMSO处理浓度。此外，DMSO浓度均为5％时，处理T11的gus基因瞬间表达率显著高于处理T16。

综合以上结果，可以得出：处理功率80w，处理时间20min，DMSO浓度为5％是超声波直接转导prolC1质粒转化八棱海棠的最佳处理组合。

5)超声波直接转化外源基因并获得转化苗

1)按超声波最佳参数处理组合以及最佳的DMSO浓度对苹果叶片进行直接转化，将转化后的叶片转移到再生培养基上，使抗性基因得到表达后，再转移到含有抗生素的筛选培养基上从而获得抗性苗(图3)。

将苹果属八棱海棠叶片继代培养(QU Shen-Chun，HUANG Xiao-De，ZHANG Zhen，YAO Quan-HONG，TAO Jian-Min，QIAO Yu-Shan，ZHANG Jun-Yi.

Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transportergene[J]，Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31(3)：235-240)一个月左右的继代培养苗从上数第二或第三片展开叶的叶片取下，无菌条件下把叶片切成4×8mm八棱海棠叶片的小块放在50ml的三角瓶中，在含有5％(体积比)DMSO、20μl·ml^-1包含目的基因rolC的质粒DNA((图1)见文献：孙爱君，房经贵，盛炳成。农杆菌介导rolC基因转化烟草植株的研究章镇，南京农业大学学报，2001，24(1)：25～29)、15mmg·L^-1NaCl和1.5mmg·L^-1柠檬酸钠、其余为水的超声波缓冲液中用功率为80w的超声波处理20分钟，用无菌水冲洗3次后，转移到再生培养基(MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)8.0mg·L^-1+NAA(萘乙酸)0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1)上，培养温度为26℃条件下暗培养3天后，在筛选培养基(MS+6-BA 8.0mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1+Km(卡那霉素)50mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1)上继续在培养温度为26℃黑暗条件下进行抗性筛选，并获得在该抗性条件下能够正常生长的抗性苗；

通过GUS染色、PCR及Southern blotting等分子检测，获得整合了完整的外源rolC基因的转基因八棱海棠抗性苗。

在上述条件下，对486片八棱海棠叶片进行外源rolC基因的直接转化，共得到237个抗性愈伤组织和9株抗性芽，转化率为1.85％；

对转化抗性苗的分子检测结果：

GUS染色：对得到的9株抗性芽叶片进行GUS染色，染色结果均呈阳性(图4)。

PCR检测：对9个GUS染色阳性芽进行PCR检测，其中8株的扩增结果呈阳性(图5)。

Southern blotting杂交：对8个PCR阳性转rolC基因八棱海棠株系的基因组用内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切，与含有rolC基因的探针杂交后，均显示出特异的杂交带，而对照植株无杂交条带出现，证明rolC基因已经成功转入八棱海棠基因组中(图6)。