结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物、其制备方法及含其的药物组合物

摘要

提供结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物，其制备方法以及含其的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物、其制备方法及含其的药物组合物。

背景技术

氯吡格雷(Clopidogrel)(甲基(+)-(S)-α-(邻氯苯基)-6，7-二氢噻吩并[3，2a]吡啶-5(4H)-乙酸盐)-化学式(II)的化合物-已知为一种有用的药物，用于治疗和预防各种血小板相关的血管疾病例如中风、脑动脉硬化、心肌梗塞、心绞痛、心律不齐、外周动脉疾病和伯格氏病(参见欧洲专利No.281,459 B1和美国专利No.4,847,265)。

然而，自身为游离碱形式的氯吡格雷是难以纯化的油，并且其酯基易于水解产生没有生物活性的化学式(III)的酸。而且，在湿热条件下，其可转变成药理活性较低的化学式(IV)的左旋异构体。因此，已经存在将氯吡格雷转换成非常稳定且容易纯化的结晶形式的需要，并且为此目的，通常利用药学上可接受的无机酸或有机酸制备酸加成盐。

欧洲专利No.281,459 B1和美国专利No.4,847,265公开了利用各种无机酸或有机酸制备的大量氯吡格雷的酸加成盐。然而，所描述的这些盐中的大部分是无定形的、吸湿的和/或低熔点的，这不适合用于药物组合物。甚至在所要求的结晶盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸氢盐和牛磺胆酸盐中也存在一些问题。牛磺胆酸盐不适合用作氯吡格雷的药学上的酸加成盐，这是因为牛磺胆酸本身具有其它药理活性，亦即胆汁分泌。而且，本发明人已经确认盐酸盐和氢溴酸盐在60℃温度和75％相对湿度的条件下高度吸湿，产生胶质型或液化形式。

此外，已知用于市售片剂组合物PLAVIX(Sanofi-Synthelabo Inc.)的氯吡格雷硫酸氢盐(参见欧洲专利No.281,459 B1和美国专利No.4,847,265)也不足够稳定(参见H.Agrawal et al，Talanta，61：581-589，2003)。例如，据报道PLAVIX在加速测试条件下(40℃，75％相对湿度，持续3个月)不稳定，产生显著量的杂质(参见Y.Gomez et al，J.Pharm.Biomed.Anal.34：341-348，2004)。此外，氯吡格雷硫酸氢盐具有两种在物理化学性质上互不相同的多晶型体，这两种形式中的一种可在其制造过程中随批次不同而被污染成另一种。这使得难以保持药学上所要求的均匀多晶型态。

因此，已经存在对更好的氯吡格雷盐的需要。本发明人出乎意料地发现结晶氯吡格雷萘磺酸盐是光学纯的、低吸湿的，并且其对水分和热比现有酸加成盐更加稳定。因此，含有结晶氯吡格雷萘磺酸盐的药物组合物对于预防和治疗血小板相关血管疾病有效。

发明内容

本发明的一个目的是提供结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物、及其制备方法。

本发明的另一目的是提供含有结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物的药物组合物，用于预防和治疗血小板相关血管疾病。

附图说明

本发明的上述和其它目的和特征将通过以下结合附图的发明描述而变得显而易见，附图分述如下：

图1：本发明的氯吡格雷2-萘磺酸盐的粉末X-射线衍射谱；

图2：本发明的氯吡格雷2-萘磺酸盐的差示扫描量热；

图3：本发明的氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物的粉末X-射线衍射谱；

图4：本发明的氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物的差示扫描量热；

图5：本发明的氯吡格雷酸加成盐与氯吡格雷硫酸氢盐的水含量依时变化(％)的比较；

图6：本发明的氯吡格雷酸加成盐与氯吡格雷硫酸氢盐的氯吡格雷量依时变化(％)的比较；

图7：本发明的氯吡格雷酸加成盐与氯吡格雷硫酸氢盐的水解杂质量依时变化(％)的比较；

图8：本发明的氯吡格雷酸加成盐与氯吡格雷硫酸氢盐的左旋异构体量依时变化(％)的比较。

具体实施方式

根据本发明的一个方面，提供化学式(I)的结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物：

其中，n为1时X是萘一磺酸根或者n为2时X是萘二磺酸根。

此外，提供一种制备化学式(I)的结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物的方法，该方法包括：使化学式(II)的氯吡格雷游离碱

与化学式(V)的萘磺酸或其水合物

(H⁺)_nX^n-    (V)在有机溶剂中反应，其中n为1时X是萘一磺酸根，或者n为2时X是萘二磺酸根。

根据本发明的另一方面，提供含有结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物的药物组合物，用于预防和治疗血小板相关的血管疾病。

根据本发明的化学式(I)的结晶氯吡格雷萘磺酸盐是一种新型氯吡格雷盐，其吸湿性低、热稳定，并且可以制备得比现有的任何盐都更加光学纯。

在本发明的优选实施方案中，化学式(I)的结晶氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物的萘磺酸基(X)衍生自2-萘磺酸、3-萘磺酸、1，2-萘二磺酸、1，3-萘二磺酸、1，4-萘二磺酸、1，5-萘二磺酸、1，6-萘二磺酸、1，7-萘二磺酸、1，8-萘二磺酸、2，3-萘二磺酸、2，6-萘二磺酸或2，7-萘二磺酸；并且最优选的是化学式(Ia)的氯吡格雷2-萘磺酸盐(根据INN的萘磺酸盐)、化学式(Ib)的氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐(根据INN的萘二磺酸盐)。

在本发明中，化学式(I)的氯吡格雷萘磺酸盐形成作为其无水或水合物形式的结晶结构。

例如，化学式(Ia)的氯吡格雷萘磺酸盐可以在无水形式下结晶，其粉末X-射线衍射(XRD)扫描显示I/I₀值大于10％(100×I/I₀＞10)的主峰位于2θ为6.7、8.2、8.5、12.4、13.0、13.5、16.8、17.2、18.9、19.6、20.2、21.2、22.3、22.9、23.2、23.6、24.7、25.0、25.3、25.8、27.0、27.5、28.0、28.6、32.1、32.5和34.7处(图1)。氯吡格雷2-萘磺酸盐的10℃/分钟的差示扫描量热(DSC)曲线显示约55.3J/g的吸收峰，其热吸收起始于约146.7℃并在约150.9℃处最大(图2)。实际观察到的氯吡格雷2-萘磺酸盐的熔点为150-151℃。

化学式(Ib)的氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐作为一水合物而结晶，其粉末XRD显示I/I₀值大于10％(100×I/I₀＞10)的主峰位于2θ为7.6、9.7、10.7、11.0、12.1、13.6、14.2、15.3、16.6、17.0、18.1、18.5、19.8、21.5、22.2、23.0、23.5、24.3、24.8、25.7、26.4、26.9、27.3、28.4和29.0处(图3)。氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐的5℃/分钟的DSC曲线显示约158.3J/g的吸收峰，其热吸收起始于约219.3℃并在约226.4℃处最大(图4)。实际观察到的氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐的熔点为223-225℃。

根据本发明，化学式(I)的氯吡格雷萘磺酸盐可通过使氯吡格雷游离碱与萘一磺酸、萘二磺酸或其水合物在有机溶剂中反应而制备。

具体而言，化学式(I)的氯吡格雷萘磺酸盐的制备是通过使化学式(II)的氯吡格雷游离碱与化学式(V)的萘磺酸或其水合物在对成盐无副反应的有机溶剂中反应，得到结晶产物，随后分离结晶产物而进行。

可用于本发明的有机溶剂包括至少一种溶剂，所述溶剂选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮、乙腈、甲醇、四氢呋喃、1，4-二氧环己烷及其混合物，最优选的是乙酸乙酯、丙酮和甲醇。

在本发明的一个优选实施方案中，有机溶剂中可含有至多15v/v％的水。在本发明中，可使用的有机溶剂的量为1-20ml，优选3-10ml，以1g重的氯吡格雷游离碱为基准。此外，可使用的萘磺酸或其水合物的量为1.0-1.2摩尔，以1摩尔氯吡格雷游离碱为基准。

在本发明中，反应可在-10℃-溶剂沸点的温度下进行。然而，反应优选在将萘磺酸或其水合物加入混合物中之后，在15-45℃下进行1-24小时，随后在沉淀形成之后，在-10-10℃下冷却并搅拌混合物1-24小时。所形成的沉淀可减压过滤并用合适的溶剂洗涤。利用惰性气体例如空气和氮气在大气压力下或减压下、在40-70℃温度下干燥。

在本发明中用作起始原料的化学式(II)的氯吡格雷游离碱可根据公开在国际专利出版No.WO 02/59128中的方法制备。由于萘磺酸是无毒性的(例如，当经口施用于大鼠时，2-萘磺酸的LD₅₀是4440mg/kg，其钠盐的LD₅₀为13900mg/kg；并且1，5-萘二磺酸的LD₅₀为2420mg/kg：参见GISAAA，39(1)，101，1974)，其可安全地用于制备药用酸加成盐(参见S.M.Berge et al，J.Pharm.Sci.66：1，1977)。

通过上述方法制备的化学式(I)的结晶氯吡格雷萘磺酸盐是非吸湿的、对于水分和热稳定，并且是光学纯的。因而，其可用于预防和治疗选自中风、脑动脉硬化、心肌梗塞、心绞痛、心律不齐、外周动脉疾病和伯格氏病的血小板相关的血管疾病。

在优选实施方案中，含有本发明的氯吡格雷萘磺酸盐作为活性成分的药物组合物可经口途径施用，因而本发明的药物组合物可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末等形式。

根据本发明的药物组合物可与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂等一起配制。

合适的载体、稀释剂或赋形剂的例子是赋形剂例如淀粉、糖和甘露醇；填充剂例如磷酸钙和二氧化硅衍生物；粘合剂例如羧甲基纤维素或羟丙基纤维素的纤维素衍生物、明胶、精氨酸盐和聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂例如滑石、硬脂酸镁或钙、氢化蓖麻油和固体聚乙二醇；崩解剂例如聚烯吡酮、交联羧甲基纤维素钠和交联聚烯吡酮；以及表面活性剂例如聚山梨醇酯、鲸蜡醇和一硬脂酸甘油酯。此外，含有特定量的活性成分、以及含有或不含有添加剂例如赋形剂、稀释剂或添加剂的药物组合物可根据任意现有方法制备(参见Remington’s Pharmaceutical Science，Mark PublishingCompany，Easton，PA，19^th Edition，1995)。

在优选实施方案中，根据本发明的药物组合物可含有0.1-95wt％、优选1-70wt％的氯吡格雷萘磺酸盐或其水合物，以总组合物重量为基准。

根据本发明的化学式(I)的氯吡格雷萘磺酸盐可采用1-1000mg/60kg体重、优选25-250mg/60kg体重的剂量经口施用于患者。

本发明将参考实施例进一步具体描述。然而，应该理解本发明并不限于特定实施例。

条件A：用于测量氯吡格雷酸加成盐的定量分析

-色谱柱：Kromasil C18，5μm(250mm×4.6mm)

-检测器：220nm

-流量：1.5ml/分钟

-移动相：Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液∶THF∶CH₃CN＝5∶2∶3(v/v)

条件B：用于测量氯吡格雷酸加成盐的水解杂质的量

-色谱柱：Capcellpak C18 MG，5μm(250mm×4.6mm)

-检测器：210nm

-流量：1.0ml/分钟

-移动相：KH₂PO₄缓冲溶液/CH₃CN(70/30)∶KH₂PO₄缓冲溶液/CH₃CN(30/70)＝0∶100-100∶0(v/v)

条件C：用于测量氯吡格雷酸加成盐的光学纯度

-色谱柱：ChiralpakAD，5μm(250mm×4.6mm)

-检测器：210nm

-流量：1.0ml/分钟

-移动相：正己烷∶异丙醇＝90∶10(v/v)

对比实施例1：氯吡格雷硫酸氢盐的制备

晶型2的氯吡格雷硫酸氢盐是根据公开在美国专利No.6,429,210中的方法，由公开在国际专利出版WO 02/59128中的方法制备的光学纯度为99.3％ee的氯吡格雷游离碱制备的。

熔点：176-177℃；水(Karl-Fisher滴定器)：低于0.1％；分析：(HPLC，条件A)：99.94％；光学纯度(HPLC，条件C)：99.3％ee。

实施例1：氯吡格雷2-萘磺酸盐(化学式(Ia))的制备

将通过类似于公开在国际专利出版WO 02/59128中的方法制备的光学纯度为99.3％ee的50g氯吡格雷游离碱溶解于100ml乙酸乙酯中，并且将含有溶于150ml乙酸乙酯和5ml水的混合物中的34.8g一水合2-萘磺酸的溶液在30分钟内逐滴加入其中。随后，室温搅拌混合物12小时，接着在0-5℃温度下搅拌4小时。将所形成的沉淀过滤、用30ml乙酸乙酯洗涤并在50℃下干燥，得到71.6g白色晶体的标题化合物(收率87％)。

熔点：151℃；水(Karl-Fisher滴定器)：低于0.1％；定量分析：(HPLC，条件A)：99.95％；光学纯度(HPLC，条件C)：99.8％ee；对C₁₆H₁₆ClNO₂S C₁₀H₈O₃S(％)(％)的元素分析：计算值，C 58.91，H 4.56，N 2.64，S 12.10；实测值，C 58.77，H 4.61，N 2.60，S 12.27。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d⁶，ppm)：δ3.08(brs，2H)，3.50(brs，2H)，3.74(s，3H)，4.25(brs，2H)，5.68(s，1H)，6.88(d，1H，J＝4.9Hz)，7.44(d，1H，J＝4.9Hz)，7.53～7.60(m，4H)，7.62～7.77(m，3H)，7.80～7.98(m，3H)，8.15(s，1H)，10.85(brs，1H)

IR(KBr，cm^-1)：3475，2967，1749，1475，1438，1326，1220，1165，1090，1031DSC(10℃/分钟)：起始点146.67℃，最低点150.94℃(吸热量55.33J/g)。

氯吡格雷2-萘磺酸盐的结晶态粉末X-射线衍射分析结果显示氯吡格雷2-萘磺酸盐是具有如图1所示的特征衍射图案的晶体。I/I₀值大于10％的主要衍射峰列于表1。

<表1>

  2θ(±2)     d  I/I₀(％) 2θ(±2)    d  I/I₀(％)    6.7    13.2    13.5    23.2    3.8    40.8    8.2    10.8    38.1    23.6    3.8    99.8    8.5    10.4    55.7    24.7    3.6    38.3    12.4    7.2    17.6    25.0    3.6    32.7    13.0    6.8    32.8    25.3    3.5    42.2    13.5    6.6    65.2    25.8    3.5    24.3    16.8    5.3    63.7    27.0    3.3    30.3    17.2    5.2    60.2    27.5    3.2    15.1    18.9    4.7    100.0    28.0    3.2    27.3    19.6    4.5    66.0    28.6    3.1    11.4    20.2    4.4    75.7    32.1    2.8    14.9    21.2    4.2    73.3    32.5    2.8    16.4    22.3    4.0    25.1    34.7    2.6    14.4    22.9    3.9    46.42θ：衍射角，d：每一结晶面内距离I/I₀(％)：峰的相对强度

实施例2：氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐(化学式(Ib))的制备

将通过类似于公开在国际专利出版WO 02/59128中的方法制备的光学纯度为99.3％ee的50g氯吡格雷游离碱溶解于300ml丙酮中，并且将含有溶于290ml丙酮和10ml水的混合物中的28.9g 1，5-萘二磺酸的溶液在30分钟内逐滴加入其中。随后，室温搅拌混合物12小时，接着在0-5℃温度下搅拌4小时。将所形成的沉淀过滤、用100ml冷丙酮洗涤并在50℃下干燥，得到66.7g白色晶体的标题化合物(收率90％)。

熔点：223-225℃；水(Karl-Fisher滴定器)：1.95％(一水合物的理论值1.90％)；

分析：(HPLC，条件A)：99.96％；光学纯度(HPLC，条件C)：99.8％ee；对(C₁₆H₁₆CINO₂S)₂ C₁₀H₈O₃S H₂O(％)的元素分析：计算值，C 53.10，H 4.46，N 2.95，S 13.50；实测值，C 53.04，H 4.52，N 2.91，S 13.49。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d⁶，ppm)：δ3.08(brs，2H)，3.47(brs，2H)，3.76(s，3H)，4.23(brs，2H)，5.66(s，1H)，6.89(d，1H，J＝5.0Hz)，7.33～7.74(m，6H)，7.93(d，1H，J＝7.0Hz)，8.88(d，1H，J＝8.5Hz)

IR(KBr，cm^-1)：3648，3462，2956，1745，1436，1338，1243，1225，1155，1026DSC(5℃/分钟)：起始点219.3℃，最低点226.4℃(吸热量158.3J/g)。

氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物的结晶态粉末X-射线衍射分析结果显示氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物是具有如图3所示的特征衍射图案的晶体。I/I₀值大于10％的主要衍射峰列于表2。

<表2>

  2θ(±2)    d  I/I₀(％)  2θ(±2)    d   I/I₀(％)    7.6    11.6    35.9    21.5    4.1    19.7    9.7    9.1    17.2    22.2    4.0    72.0    10.7    8.3    30.4    23.0    3.9    37.9    11.0    8.0    68.7    23.5    3.8    17.6    12.1    7.3    41.6    24.3    3.7    40.5    13.6    6.5    14.3    24.8    3.6    45.8    14.2    6.2    22.4    25.7    3.5    37.4    15.3    5.8    26.9    26.4    3.4    42.7    16.6    5.3    32.0    26.9    3.3    12.5    17.0    5.2    19.3    27.3    3.3    10.9    18.1    4.9    100.0    28.4    3.1    24.9    18.5    4.8    22.0    29.0    3.1    13.2    19.8    4.5    76.72θ：衍射角，d：每一结晶面内距离I/I₀(％)：峰的相对强度

实施例3：氯吡格雷酸加成盐在湿热条件下的稳定性测试

将对比实施例1值得到的氯吡格雷硫酸氢盐和在实施例1和2中得到的氯吡格雷2-萘磺酸盐和氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物分别经受60±2℃、75±5％相对湿度条件30天以上，以测试其稳定性。具体而言，利用HPLC测量在7、14、21、28和35天残留的活性化合物的量与起始日(0)的量之比利用HPLC、条件A测量氯吡格雷酸加成盐的定量分析，利用HPLC、条件B测量氯吡格雷酸加成盐的水解杂质的量，利用HPLC、条件C测量氯吡格雷酸加成盐的光学纯度(即左旋异构体的量)，利用Karl-Fisher滴定器测量氯吡格雷酸加成盐的水含量。结果分别示于表3-6和图5-8。

<表3>氯吡格雷酸加成盐吸湿性比较

氯吡格雷酸加成盐水含量(％)0天 7天 14天21天28天35天硫酸氢盐0.1 0.1 0.1 0.4 2.0 4.82-萘磺酸盐0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1一水合1，5-萘二磺酸盐1.8 1.8 1.9 1.9 1.8 1.9

<表4>氯吡格雷酸加成盐的量的比较

氯吡格雷酸加成盐与初始量相比的相对量(％)0天 7天 14天 21天 28天 35天硫酸氢盐100 99.6 98.7 97.7 94.4 87.02-萘磺酸盐100 99.1 99.3 99.1 99.0 99.2一水合1，5-萘二磺酸盐100 100 100 100 99.9 99.9

<表5>氯吡格雷酸加成盐的水解杂质(化学式(III))的比较

氯吡格雷酸加成盐氯吡格雷酸加成盐的水解杂质的量(％)0天 14天 28天 35天硫酸氢盐0.0 0.63 2.0 4.82-萘磺酸盐0.0 0.12 0.16 0.18一水合1，5-萘二磺酸盐0.0 0.02 0.04 0.05

<表6>氯吡格雷酸加成盐的左旋异构体(化学式(IV))的比较

氯吡格雷酸加成盐氯吡格雷酸加成盐的左旋异构体量(％)0天 7天 14天 21天 28天 35天硫酸氢盐0.35 0.35 0.40 0.49 0.67 1.082-萘磺酸盐0.10 0.10 0.10 0.10 0.11 0.13一水合1，5-萘二磺酸盐0.10 0.10 0.10 0.09 0.11 0.10

如表3-6所示，本发明的氯吡格雷萘磺酸盐吸湿性低并且对湿热更加稳定。因而，在严苛条件下长时间储存之后，光学纯的氯吡格雷的量没有明显下降，并且氯吡格雷萘磺酸盐的水解杂质的量远低于对硫酸氢盐所观察到的。这些结果确认根据本发明的含有本发明的氯吡格雷萘磺酸盐的药物组合物对于预防和治疗血小板相关的血管疾病要比现有的酸加成盐更为有效。

实施例4：在氯吡格雷盐形成期间提高光学纯度的效果

分别制备光学纯度为约90％ee和95％ee的氯吡格雷游离碱，并且分别利用对比实施例和实施例1和2中的描述的步骤制备氯吡格雷硫酸氢盐、氯吡格雷2-萘磺酸盐和氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物。在HPLC、条件C下测量所得酸加成盐的光学纯度，光学纯度的提高程度示于表7。

<表7>

起始原料所得的氯吡格雷酸加成盐氯吡格雷游离碱 硫酸氢盐 2-萘磺酸盐 一水合1，5-萘二磺酸盐90.0 89.4 98.3 97.494.9 94.7 98.8 98.797.7 97.7 99.5 99.4单位：％ee(对映异构体超出量)

如表7所示，根据本发明的氯吡格雷萘磺酸盐的光学纯度在其制备过程中明显提高，与此同时，氯吡格雷硫酸氢盐的光学纯度并未改善。

氯吡格雷易于部分外消旋化成左旋异构体，因此需要多个纯化步骤来得到药学可接受的光学纯度。然而，本发明的制备萘磺酸盐的方法提供满足药学上的光学纯度要求的产物，使得可以省略分离光学纯化步骤。

测试实施例1：氯吡格雷萘磺酸盐抗血小板凝集的抑制作用

根据标准方法(参见Born G.V.R&Cross，J.Physiol.168：178-195，1963；O.Takahashi，Food& Chemical Toxicology 38：203-218，2000)，利用大鼠血液，分别对对比实施例1得到的氯吡格雷硫酸氢盐和实施例1和2得到的氯吡格雷2-萘磺酸盐和氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物的预防血小板凝集的药理活性进行测试。血小板凝集抑制测试在体外进行，测量酸加成盐对于分别由二磷酸腺苷(ADP)、胶原蛋白和凝血酶引起的血小板凝集的抑制活性。

将20只11-12周大的雌性大鼠(平均重量270±25g)分成四组，每一组有5只大鼠，每一组的大鼠经口喂服20.0mg/kg的氯吡格雷硫酸氢盐(15.3mg/kg氯吡格雷)、25.2mg/kg的氯吡格雷2-萘磺酸盐和溶于1％DMSO中的22.6mg/kg氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物，以10ml/kg体重为基准。对于对照组的大鼠，则仅喂服1％DMSO。

麻醉下，利用预装有3.8％柠檬酸溶液的注射器从动物腹腔动脉抽取血液样本，并将该血液样本在4℃和1000rpm下离心10分钟以分离富集血小板的血浆(PRP)。将分离的血浆进一步在4℃和1000rpm下离心4次，以得到测试用PRP。部分PRP进一步在4℃和3000rpm下离心10分钟以制备沉淀血小板，所得沉淀血小板用缓冲液(138mM NaCl，2.7mM KCl，12mM NaHCO₃，0.36mM NaH₂PO₄，5.5mM葡萄糖，1mM EDTA：pH6.5)洗涤。随后，将血小板悬浮于缓冲液(138mM NaCl，2.7mMKCl，12mM NaHCO₃，0.36mM NaH₂PO₄，0.49mM MgCl₂，0.25％明胶，5.5mM葡萄糖：pH7.4)中，使得260nm处的光学密度(OD)值对应的血小板数为约1×10⁸。

为了引起血小板凝集，向上述PRP值加入ADP标准溶液以确定ADP最终浓度达到5mM的浓度。此外，向上述洗涤的血小板溶液中加入胶原蛋白标准溶液(最终浓度5μg/ml)和凝血酶标准溶液(最终浓度0.1U/ml)以引起血小板凝集。每一样本在37℃和900rpm下搅拌，以利用血小板凝集计(Chrono-log血小板凝集计)测量血小板凝集量。血小板凝集和抑制程度利用公式1和2计算，结果示于表8。

<公式1>

凝集度(％)＝[(测量的凝集高度)/(100％凝集时的凝集高度)]×100

<公式2>

抑制度(％)＝[(对照组的凝集高度)-(服药组的凝集高度)]/(对照组的凝集高度)×100

<表8>氯吡格雷酸加成盐的抑制效果

施用药物  凝集诱导物质和浓度ADP(5μM)    胶原蛋白(5g/ml)  凝血酶  (0.1U/  ml)凝集比(％)^*抑制比(％)  凝集比  (％)^*抑制比(％) 凝集比 (％)^* 抑制比 (％)对照35.88±2.43 -  80.31±2.  80 - 82.78±2. 11 -氯吡格雷硫酸氢盐5.00±0.60 86.1  12.19±1.  70 84.8 27.22±1. 52 67.1氯吡格雷2-萘磺酸盐2.94±0.21 91.8  1.88±0.2  5 97.9 15.00±1. 71 81.9氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐水合物4.12±0.14 88.5  3.75±0.4  0 95.3 23.61±1. 43 71.5^*p＜0.001^**对应于20mg硫酸氢盐的2-萘磺酸盐和1，5-萘二磺酸盐一水合物的量分别为25.2mg和22.6mg，其对应于15.3mg的氯吡格雷

测试实施例2：氯吡格雷萘磺酸盐对于流血时间的影响

根据标准方法(参见Dejana E&Villa S，Thromb.Haemostas.4-8：108-111，1982)，利用大鼠分别对对比实施例1得到的氯吡格雷硫酸氢盐和实施例1和2得到的氯吡格雷2-萘磺酸盐和氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物对流血时间的影响进行测试。流血时间是通过血小板凝集形成的血栓程度的代表性指数并且利用雄性和雌性大鼠进行测试。

将40只11-12周大的雄性和雌性大鼠(平均重量270±25g)分成四组，每一组有5只雄性大鼠和5只雌性大鼠，第一组的雄性大鼠分别经口喂服5.0mg/kg的氯吡格雷硫酸氢盐(3.83mg/kg氯吡格雷)，第一组的雌性大鼠分别经口喂服2.5mg/kg的氯吡格雷硫酸氢盐(1.92mg/kg氯吡格雷)。对于第二组，雄性和雌性大鼠分别经口喂服6.3mg/kg和3.15mg/kg的氯吡格雷2-萘磺酸盐，而对于第三组，雄性和雌性大鼠分别经口喂服5.65mg/kg和2.83mg/kg的氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物。药物以1％DMSO溶液的形式、10ml/kg体重的量经口喂服。作为对照，仅对最后一组大鼠经口喂服1％的DMSO。

在将未麻醉的大鼠固定在手术支架上之后，使用26G×1/2、0.45×13mm的针头刺入距尾部末端1.5cm处的大鼠尾部1mm深。测量流血停止时间，同时每10秒钟将流出的血液吸附在滤纸上。结果示于表9。

<表9>氯吡格雷酸加成盐对流血时间的效果

  施用药物   雌性  雄性   施用药物的量   (mg/kg)   流血时间   (秒)^*  施用药物的量  (mg/kg) 流血时间 (秒)^*  对照   -   85±7.1  - 105±5.0  氯吡格雷硫酸  氢盐   2.50^**   127.5±10.6  5.00^*** 135±8.7  氯吡格雷2-萘  磺酸盐   3.15^**   157±10.6  6.30^*** 190±5.0  氯吡格雷1，5-  萘二磺酸盐  一水合物   2.83^**   152.5±3.5  5.65^*** 163±5.8  ^*p＜0.001  ^**2.50mg硫酸氢盐、3.15mg 2-萘磺酸盐和2.83mg 1，5-萘二磺酸盐一水合物  对应于1.92mg氯吡格雷  ^***5.00mg硫酸氢盐、6.30mg 2-萘磺酸盐和5.65mg 1，5-萘二磺酸盐一水合物对应于  3.83mg氯吡格雷

从表8和9可见，本发明的氯吡格雷萘磺酸盐抑制由ADP、胶原蛋白或凝血酶引起的血小板凝集，并且与现有的酸加成盐例如硫酸氢盐相比明显延长流血时间。因此，根据本发明的氯吡格雷萘磺酸盐比任何现有的酸加成盐在预防和治疗血小板相关的血管疾病方面都更为有效。

本发明的氯吡格雷萘磺酸盐可根据用于制备软或硬胶囊和片剂的任意现有方法单独配制或与药学上可接受的添加剂组合配制。

以下制备实施例原来进一步说明本发明，而非限制其范围。

制备实施例1：软或硬胶囊1

利用以下成分制备明胶胶囊：

                                      量(mg/胶囊)

氯吡格雷2-萘磺酸盐                        120

乳糖                                      100

玉米淀粉                                  25

二氧化硅胶体                              3

硬脂酸镁                                  2

总计                                      250

制备实施例2：软或硬胶囊2

利用以下成分制备明胶胶囊：

                                      量(mg/胶囊)

氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐一水合物           110

乳糖                                      110

玉米淀粉                                  25

二氧化硅胶体                              3

硬脂酸镁                                  2

总计                                      250

制备实施例3：片剂1

利用以下成分制备片剂：

                                   量(mg/片)

氯吡格雷2-萘磺酸盐                     120

无水乳糖                               90

微晶纤维素                             30

羟丙基纤维素                           5

聚山梨醇酯                             2

氢化蓖麻油                             1

硬脂酸镁                               1

固体聚乙二醇                           1

总计                                   250

制备实施例4：片剂2

利用以下成分制备片剂：

                                   量(mg/片)

氯吡格雷1，5-萘二磺酸盐                110

无水乳糖                               100

微晶纤维素                             30

羟丙基纤维素                           5

聚山梨醇酯                             2

氢化蓖麻油                             1

硬脂酸镁                               1

固体聚乙二醇                           1

总计                                   250

如上所述，根据本发明的氯吡格雷萘磺酸盐很容易简单通过进行本发明的过程而满足药物配方所要求的光学纯度。氯吡格雷萘磺酸盐对于湿热非常稳定，使得高纯度的活性成分可保持更长时间。此外，氯吡格雷萘磺酸盐在使用大鼠的动物实验中的药物效果方面优于现有的盐。因此，根据本发明的氯吡格雷萘磺酸盐比任何现有的酸加成盐在预防和治疗血小板相关的血管疾病方面都更加有用。

尽管本发明已经相对于上述特定实施方案进行描述，但是应该认识到本领域技术人员可以对本发明进行各种修改和变化，所述修改和变化也落入由所附权利要求所限定的本发明范围之内。