一种葡萄酒添加剂酿酒酵母甘露糖蛋白的制作方法

摘要

本发明涉及一种葡萄酒添加剂酿酒酵母甘露糖蛋白的制作方法，其将从葡萄酒酿造产生的废物酒泥酵母中提取的天然产物甘露糖蛋白，再添加到葡萄酒中以提高葡萄酒的质量，工艺设计合理，操作方便，可规模化生产酒泥酵母甘露糖蛋白。本发明包括以下步骤：(1)葡萄酒泥酵母的收集；(2)储存；(3)酶解；(4)热解；(5)分离；(6)酒精沉淀(7)分离浓缩；(8)干燥制粉。

说明书

一、技术领域：

本发明涉及一种葡萄酒添加剂的制作方法，尤其是涉及一种葡萄酒添加剂酿酒酵母甘露糖蛋白的制作方法。

二、背景技术：

在橡木桶中与酒泥一起储存较长时间的白葡萄酒，其酒石稳定性很高，一般不需要冷稳定性处理。在法国勃艮第地区生产的霞多丽(Chardonnay)干白葡萄酒，通常是在橡木桶中发酵，然后在酒泥上陈酿数月，并且在陈酿过程中每周搅拌1-2次。研究表明，如果在第二年3月份就将酒与酒泥分离，则大部分葡萄酒酒石不稳定，但如果到第二年的7月份再将酒与酒石分离，则酒的酒石稳定性非常好。大部分波尔多干白葡萄酒与酒泥储存到了来年3月时并不稳定，但到了6-7月，就变得稳定了。与此相反，相同的酒如果不与酒泥同时储存，则必须经冷稳定性处理才能达到酒石稳定。直到近年才从理论上将这一现象加以研究证实，用上述方法酿造的葡萄酒，通常含有丰富的由酵母自溶释放的细胞壁多糖，其中主要是甘露糖蛋白。甘露糖蛋白主要来源于酒精发酵后死酵母细胞壁。酵母细胞壁是由甲壳素(1-2％)，β-1，3葡聚糖(25％)，β-1，3葡聚糖结合甲壳素(35％)，β-1，6葡聚糖(5％)，甘露糖蛋白(35％)组成的。在酵母细胞壁上的甘露糖蛋白通过共价键和非共价键连接在葡聚糖上，甘露糖蛋白完全定位于细胞壁上，它们与葡聚糖网状结构相连，作为一个细胞壁层存在。在酒与酒泥储存过程中，由于死酵母的自溶作用，酵母细胞壁中的甘露糖蛋白溶解进入了葡萄酒中，保护了酒石晶核，阻止了晶核的长大，使酒石达到稳定。甘露糖蛋白的分子量约为42KDa，含碳水化合物70-90％，蛋白质10-30％。其中碳水化合物中98％是甘露糖，2％是葡聚糖，甘露糖主链是通过2，3-糖苷键连接的。一些物质作为侧链连接到甘露糖主链的6-C位上。蛋白质以N-糖苷键或O-糖苷键连接在甘露糖主链上。蛋白质部分主要由丝氨酸，甘氨酸，苏氨酸和丙氨酸构成。

葡萄酒中的甘露糖蛋白有两个来源：酒精发酵期间，有生长活力的酵母细胞能够释放甘露糖蛋白到葡萄汁中，这一部分甘露糖蛋白的量很少，而且与葡萄汁的陈情度、酵母的种类及其生长情况有关；酵母自溶过程中释放甘露糖蛋白，葡萄酒在带酒泥陈酿过程中。为了将甘露糖蛋白释放到介质中，细胞壁首先应必须降解。这个过程由酵母内源酶来促进完成，如β-1，3葡聚糖酶，这些酶由酵母产生并存在于酵母细胞内。

研究发现，甘露糖蛋白具有以下功能：促进乳酸菌的生长；有利于白葡萄酒中蛋白和酒石的稳定；对红葡萄酒中香气和多酚物质有影响，削弱单宁的收敛性和尖刻感，提高酒的饱满肥硕感；对起泡葡萄酒的瓶内发酵，静止葡萄酒的桶内陈酿和雪利酒的生产有促进作用。此外，作为还是一种生物乳化剂，甘露糖蛋白还能广泛应用于食品工业。

传统的带酒泥陈酿方法主要在橡木桶陈酿中应用，现在也逐渐被应用到大罐的葡萄酒陈酿中。但如果在大罐中带酒泥陈酿时间过长，葡萄酒很容易产生还原味(硫化氢味)，给葡萄酒的储存管理也带来了很多的不便，使带酒泥陈酿增加葡萄酒中甘露糖蛋白、提高葡萄酒质量的工艺受到了很大的局限。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种葡萄酒添加剂酿酒酵母甘露糖蛋白的制作方法，其将从葡萄酒酿造产生的废物酒泥酵母中提取的天然产物甘露糖蛋白，再添加到葡萄酒中以提高葡萄酒的质量，工艺设计合理，操作方便，可规模化生产酒泥酵母甘露糖蛋白。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种葡萄酒添加剂酿酒酵母甘露糖蛋白的制作方法，其特殊之处在于包括以下步骤：(1)葡萄酒泥酵母的收集；(2)储存；(3)酶解；(4)热解；(5)分离；(6)酒精沉淀(7)分离浓缩；(8)干燥制粉。

在葡萄酒泥酵母的收集过程中，将白葡萄汁澄清，澄清后浊度为50-70NTU，再将白葡萄酒清汁酒精发酵，酒精发酵结束后，酒底分离，将酒泥集中，再加入两倍酒泥体积的纯净水，用氢氧化钠或柠檬酸调整pH值至6.5-7.0。

在酶解过程中，加入β-1，3-葡聚糖苷酶A30-35g/hL，β-1，6-葡聚糖苷酶8-10g/hL，壳聚糖酶5-8g/hL，温度保持在50℃-55℃。

在热解过程中，蒸气加热至120℃压煮2h

热解后入罐澄清3-5d，4000r/min连续式离心机离心分离上清液，再用过滤机过滤，得甘露糖蛋白沉淀，在甘露糖蛋白沉淀中加入两倍体积95％酒精和1％体积冰乙酸，4℃以下自然沉淀10d，将沉淀物干燥后得甘露糖蛋白成品。

热解后入罐澄清3-5d，错流过滤得甘露糖蛋白沉淀，在甘露糖蛋白沉淀中加入两倍体积95％酒精和1％体积冰乙酸，4℃以下自然沉淀10d，将沉淀物干燥后得甘露糖蛋白成品。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明提供了一种全新的提高葡萄酒中甘露糖蛋白含量的解决方法——新型葡萄酒添加剂-酿酒酵母甘露糖蛋白，用酶解-热解法从葡萄酒酒泥酵母中提取酵母细胞壁甘露糖蛋白，经分离、纯化、干燥后，根据葡萄酒工艺要求再加入葡萄酒中。

2、本发明根据酵母细胞壁的结构特点，参考前人所作的研究成果，设计并验证使用不同酶制剂、在不同温度条件下和利用不同方法，处理新鲜的干白葡萄酒酒泥酵母，提取酵母甘露糖蛋白，经定量分析，最终确定了最佳的制取酒泥酵母甘露糖蛋白的方法，制定了合理的工业化生产工艺流程，可规模化生产酒泥酵母甘露糖蛋白。

四、附图说明：

图1为本发明中无错流过滤机时的工艺流程图。

图2为本发明中有错流过滤机时的工艺流程图。

五、具体实施方式：

本发明的工艺流程：

(1)葡萄酒泥酵母的收集；(2)储存；(3)酶解；(4)热解；(5)分离；(6)酒精沉淀(7)分离浓缩；(8)干燥制粉。

1、酒泥酵母的收集：用白葡萄酒酒发酵后产生的酒泥酵母。酒精发酵前，葡萄汁澄清要好，这样可以减少酒泥酵母中的杂质，但也不能太清，如果浊度小于50NTU，则有可能引起发酵困难或发酵不彻底。酒泥收集过程中要尽可能少接触氧气并避免微生物污染。

酶解：加入酶A30-35g/hL，B8-10g/hL，C5-8g/hL以后，温度保持在50℃-55℃，在这个温度范围内，酶的活性最强。温度不能超过55℃，否则会使一部分酶失活。酶制剂A为β-1，3-葡聚糖苷酶，酶制剂B为β-1，6-葡聚糖苷酶，酶制剂C为壳聚糖酶。

酶解设备：一般罐式香槟酒发酵罐都具有搅拌装置、加热装置、外加热系统、保温系统及自控系统，且一般抗压强度都在8kg/cm²，经过适当的改造及可以满足工艺需求。如果没有香槟酒罐式发酵罐，则可购置可满足要求的密闭式发应釜。

热解：酶解结束后再加热进行热解，以提高甘露糖蛋白的产率。

澄清：澄清温度在10℃以下，5-10d后分离，清夜倒出离心分离。由于沉渣和离心后的残渣里有一部分甘露糖蛋白，所以可经水洗后再分离，以提高回收率。清夜作为稀释水加入酒泥中，残渣中含有大量的蛋白质、核酸等具有较高营养价值的酵母残余物，经简单处理后即可用于生产饲料。

分离：经离心分离的清夜仍会有一定的颗粒物质，须经过硅藻土过滤机过滤除去。硅藻土选用粗土，否则会比较难过滤。

酒精沉淀：加入酒精后，多糖和糖蛋白会沉淀下来，而其他的物质(氨基酸、多肽、核酸、无机物等)则不会沉淀，这样就可以不多糖和糖蛋白从酵母提取液中分离出来。

沉淀物经过喷粉干燥或直接干燥即可成为成品多糖和糖蛋白。酒精沉淀后的上清液中仍会有少量的可沉淀物质，可用过滤设备(板框过滤机、硅藻土过滤机等)过滤后收集并干燥。

酒精回蒸：过滤后的清夜含有大量的酒精，可经过蒸馏后重复使用。

酒精蒸馏后的残夜中，含有大量的氨基酸、多肽、核酸等物质，这些物质作为高档呈味添加物，在现代食品工业中具有广泛的应用价值，所以残留也有很高的利用价值，可用于提取高品质的食品风味添加剂。

用此工艺提取的多糖和糖蛋白混合物中，总糖部分占总重的80-93％，其中葡聚糖占2-10％，甘露糖占90-98％；蛋白质部分占7-20％。甘露糖蛋白的产率可以达到干酵母重量的6-10％。

甘露糖蛋白能促进乳酸菌的生长；有利于白葡萄酒中蛋白和酒石的稳定；对红葡萄酒中香气和多酚物质有影响，削弱单宁的收敛性和尖刻感，提高酒的饱满肥硕感；对起泡葡萄酒的瓶内发酵，静止葡萄酒的桶内陈酿和雪利酒的生产有促进作用。

甘露糖蛋白其理化性质为：经喷粉干燥后的酵母胞壁甘露糖蛋白为略带黄色的白色粉未，加热至85℃以上样品易褐变；易溶于热水，微溶于低浓度的乙醇，不溶于高浓度乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂；暴露在空气中易吸湿，其水溶液呈粘稠状，pH值为中性。在浓硫酸存在下可与儿茶酚作用，在界面处呈紫色环，与苯酚-浓硫酸反应后，呈橙黄色，其特征峰的吸收波长为190nm；水解前与斐林试剂呈阴性反应，水解后与斐林试剂呈阳性反应。

甘露糖蛋白在葡萄酒生产中的应用工艺：

葡萄酒泥酵母甘露糖蛋白已被证实对葡萄酒的酒石稳定性、蛋白质稳定性、苹果酸-乳酸发酵、葡萄酒的香气和葡萄酒口感等有影响，这就涉及到了在葡萄酒实际生产中如何使用酒泥酵母甘露糖蛋白的问题。基于酒泥酵母甘露糖蛋白对葡萄酒作用的特点，其使用方法也不可以千篇一律，要根据不同葡萄酒的特点，不同的使用目的，选择不同的使用方法和添加时机以及添加量。

1、在干白葡萄酒中的使用

在干白葡萄酒中，甘露糖蛋白可用于减少皂土用量、提高蛋白质稳定性、提高酒石稳定性和改善香气质量等目的。

不带酒泥陈酿的干白葡萄酒为了减少香气的损失，降低皂土的下胶量，并保证蛋白质稳定性，可以添加适量的甘露糖蛋白。添加量在100-200mg/L之间，添加时间是在冷冻结束、趁冷过滤后。由于甘露糖蛋白不能完全取代皂土下胶的作用，所以干白葡萄酒还必须进行皂土下胶处理。下胶量应经下胶试验确定。具体方法是：待处理的葡萄酒酒样按传统的皂土下胶试验进行梯度下胶，澄清过滤后加入预定量的甘露糖蛋白，充分溶解并过滤后，放入80℃恒温水浴锅中保持40min，自然降温后室温下静止24h，观察蛋白质稳定性，将能保证蛋白质稳定的最低下胶量定为最终下胶量。

甘露糖蛋白对干白葡萄酒酒石稳定性具有很好的效果，但不主张只使用甘露糖蛋白来保证所有干白葡萄酒的酒石稳定。

对于可以在市场上很快被消费掉的干白葡萄酒，可以采用甘露糖蛋白达到酒石稳定的目的。在调配过滤后，酒样分不同梯度加入甘露糖蛋白，采用与葡萄酒罐装前一致的终极过滤方法(如膜过滤)过滤，然后进行冷冻试验确定甘露糖蛋白的添加量。

经过较长期桶或罐储的干白葡萄酒，由于在储存过程中已有较大部分酒石沉淀析出，也可只用甘露糖蛋白来保证干白葡萄酒的酒石稳定。方法同上。

对普通的干白葡萄酒，尤其是含钙量较高的葡萄酒，可以先进行冷冻处理(包括用酒石离析机连续冷稳处理)，趁冷过滤后加入50-150mg/L甘露糖蛋白，即可保证葡萄酒的酒石稳定性。甘露糖蛋白加入的时间必须在冷冻处理以后进行，提前加入会降低冷冻处理效率。

干白葡萄酒中添加甘露糖蛋白的几种目的可以综合考虑，统筹安排。值得注意的，一是添加时机，一般应在灌装过滤前添加；二是微生物稳定性的的问题，对于未经过苹果酸-乳酸发酵的干白葡萄酒要特别注意防止装瓶后乳酸菌破败，因为甘露糖蛋白可以促进苹果酸-乳酸发酵。

2、在干红葡萄酒中的使用

在干红葡萄酒中，甘露糖蛋白可用于启动和加速葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵，降低年轻干红葡萄酒苦、涩味，改善葡萄酒口感，改善香气质量等目的。

葡萄酒中添加一定量的甘露糖蛋白，可以有效地加快葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的启动和促进苹果酸-乳酸发酵的进程。在温度较低情况下，甘露糖蛋白可以促进苹果酸-乳酸发酵快速启动，并可有效地缩短葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的时间。在pH值较低情况下，甘露糖蛋白对葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的促进作用也很明显。甘露糖蛋白也可以有效地促进高单宁含量葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵。对由于温度较低、pH值较低、单宁含量较高等不利因素的存在，导致苹果酸-乳酸发酵困难的干红葡萄酒，可以考虑添加一定量的甘露糖蛋白，以促进苹果酸-乳酸发酵。添加的方法是，在酒精发酵结束以后，在接入乳酸菌中的同时，加入150-200mg/L甘露糖蛋白。

在酒中加入甘露糖蛋白，可以使口感更加丰满是发酵实践中得到证明的，虽然作用机理还不太清楚，但似乎甘露糖蛋白可以包裹住单宁分子，降低它们与蛋白质的作用，减轻品尝时的苦涩感，若酒中的多糖含量较高时，可以提高红葡萄酒的品质，增加酒体结构和圆润感。要用添加甘露糖蛋白降低年轻干红葡萄酒苦、涩味改善葡萄酒口感，可以在葡萄酒冷冻处理结束、趁冷过滤后加入50-150mg/L甘露糖蛋白。甘露糖蛋白加入的时间必须在冷冻处理以后进行，提前加入会降低冷冻处理效率。

干红葡萄酒中添加甘露糖蛋白应值得注意的是添加时机，一般应尽可能在灌装过滤前添加，以免降低冷冻处理效率。如果在冷冻处理前添加(如为促进苹果酸-乳酸发酵而添加)，就应特别注意冷冻处理的效果，加强冷稳定性检测。

实施例1：

工艺流程：参见图1，图1所示为无错流过滤机时的工艺流程图。

1、将白葡萄汁澄清，澄清后浊度50-70NTU；

2、白葡萄酒清汁酒精发酵；

3、酒精发酵结束，酒底分离，得白葡萄酒；

4、将酒泥集中，加入两倍酒泥体积的纯净水，用氢氧化钠或柠檬酸调整pH值至6.5-7.0；

5、加入酶A30-35g/hL，B8-10g/hL，C5-8g/hL，其中酶制剂A为β-1，3-葡聚糖苷酶，酶制剂B为β-1，6-葡聚糖苷酶，酶制剂C为壳聚糖酶；

6、进入密闭式反应釜(具有搅拌或旋转、加温、保温系统)，抗压强度6kg，50℃保温48h，每1h搅拌20min；

7、蒸气加热至120℃压煮2h，入罐澄清，残渣加入1.5倍体积纯洁水，充分搅拌后离心机分离，清液按水量加入步骤4的酒泥中，残渣可综合利用；

8、4000r/min连续式离心机离心分离上清液，残渣加入1.5倍体积纯洁水，充分搅拌后离心机分离，清液按水量加入步骤4的酒泥中，残渣可综合利用；将上清液用硅藻土过滤机过滤，得甘露糖蛋白沉淀；

9、在甘露糖蛋白沉淀中加入两倍体积95％酒精和1％体积冰乙酸，4℃以下自然沉淀10d，将沉淀物干燥后经含量检测得甘露糖蛋白成品。

10、上清液板框过滤，滤出物干燥后经含量检测得甘露糖蛋白成品。滤出液经蒸馏塔蒸馏得酒精，用于步骤9中在甘露糖蛋白沉淀中加入；馏出废液可综合利用。

实施例2：

工艺流程：参见图2，图2所示为有错流过滤机时的工艺流程图。

1、将白葡萄汁澄清，澄清后浊度50-70NTU；

2、白葡萄酒清汁酒精发酵；

3、酒精发酵结束，酒底分离，得白葡萄酒；

4、将酒泥集中，加入两倍酒泥体积的纯净水，用氢氧化钠或柠檬酸调整pH值至6.5-7.0；

5、加入酶A30-35g/hL，B8-10g/hL，C5-8g/hL，其中酶制剂A为β-1，3-葡聚糖苷酶，酶制剂B为β-1，6-葡聚糖苷酶，酶制剂C为壳聚糖酶；

6、进入密闭式反应釜(具有搅拌或旋转、加温、保温系统)，抗压强度6kg，50℃保温48h，每1h搅拌20min；

7、蒸气加热至120℃压煮2h，入罐澄清3-5d，残渣加入1.5倍体积纯洁水，充分搅拌后离心机分离，清液按水量加入步骤4的酒泥中，残渣可综合利用；

8、错流过滤得上清液和甘露糖蛋白沉淀，残渣加入1.5倍体积纯洁水，充分搅拌后离心机分离，清液按水量加入步骤4的酒泥中，残渣可综合利用；

9、在甘露糖蛋白沉淀中加入两倍体积95％酒精和1％体积冰乙酸，4℃以下自然沉淀10d，将沉淀物干燥后经含量检测得甘露糖蛋白成品。

10、上清液错流过滤，滤出物干燥后经含量检测得甘露糖蛋白成品。滤出液经蒸馏塔蒸馏得酒精，用于步骤9中在甘露糖蛋白沉淀中加入；馏出废液可综合利用。