人癌来源的Ig轻链可变区序列和CDR3序列以及它们的用途

摘要

本发明公开了一种人癌细胞来源的Ig分子轻链可变区及其CDR3区的cDNA序列。并进一步公开了这些序列在癌症治疗药剂上的用途。本发明的方案在提高肿瘤基因治疗的靶向性方面具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及Ig轻链可变区核苷酸序列和该轻链可变区的CDR3核苷酸序列，尤其是癌细胞来源的Ig分子轻链可变区及其CDR3区的cDNA序列，还涉及这些序列在癌症治疗药剂上的用途。

背景技术

传统的免疫学理论认为免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中进行选择性重排，故免疫球蛋白是B淋巴细胞的特征性产物。但1996年，邱晓彦等通过免疫组化、Western Blot等发现在多种上皮性恶性肿瘤细胞的胞浆中存在与免疫球蛋白抗原性相同且分子结构相似的蛋白分子，而其它正常上皮细胞均为阴性反应(中国免疫学杂志；1996，5：296)；随后邱晓彦等又分别从蛋白水平和mRNA水平证实Ig分子在非B细胞来源的肿瘤细胞中表达；并且发现应用Ig特异的反义寡核苷酸以及抗Ig抗体都可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其生长(CANCER RESEARCH 63，6488-6495，October 1，2003)。2000年汪泱等用免疫组化方法对多种肿瘤组织用抗人IgG、IgA、IgD及IgM抗体进行了检测，结果显示多数的肿瘤细胞呈阳性反应，其中以IgG、IgA及IgD阳性率最高(中国肿瘤临床，28(3)：169，2001)；继之黎明等用Western blot方法发现在多种肿瘤传代细胞中存在着IgA分子(中华肿瘤杂志，2001，23(6)：451-453)；杨少波等的免疫组化结果提示胃癌细胞中可能同时存在两种免疫球蛋白轻链表达(中华肿瘤杂志，2002，24(5)：465-466.)。以上结果提示，就Ig分子来源和功能来看，已经不再是目前免疫学理论所界定的：即其来源仅限于B淋巴细胞/浆细胞和其功能仅限于B细胞发育及介导体液免疫应答。Ig分子同样在非B淋巴细胞性肿瘤细胞表达，且在肿瘤发生发展过程中可能起重要作用。

在我们研究非B淋巴细胞性肿瘤细胞来源的轻链结构发现，多种不同类型的肿瘤所表达的轻链可变区序列极其相似，特别是CDR3序列，并且这种轻链在正常组织中不表达或弱表达。这一结果提示，肿瘤细胞表达的Ig轻链可作为多种肿瘤共有的靶分子在肿瘤的生物治疗中具有很好的应用前景；并且，作为肿瘤来源的Ig分子的标记，在肿瘤的特异性诊断过程中具有潜在的应用前景。

目前已有Ig基因作为靶分子用于免疫系统肿瘤的基因治疗研究，例如用于bcl/BCR阳性淋巴瘤的治疗研究，即研究人员将bcl/BCR融合蛋白中的IgM分子作为靶点，用与IgM恒定区互补的反义寡核苷酸抑制bcl/BCR阳性淋巴瘤在SICD小鼠体内的生长，并观察到了肿瘤细胞明显的凋亡(Clinical CancerResearch Vol.7，400-406，February 2001)。但是用Ig基因，特别是轻链作为靶分子用于非免疫系统肿瘤的基因治疗研究及肿瘤特异性诊断的研究还没有相应的报道。

发明内容

本申请的发明人发现，人肿瘤细胞所表达的Ig可变区序列与B细胞来源的有所不同。免疫球蛋白是由两条重链和两条轻链组成的，其中轻链又存在κ和λ两种类型，在B淋巴细胞编码Ig过程中，κ链的使用频率往往较高。并且κ链也同重链一样，在Ig分子中存在多样性，这是因为κ链基因存在40个V片段，这些片段可随机与5个J片断重组形成完整的κ链可变区编码序列，故不同的B淋巴细胞表达的κ链呈现不同的Vκ与Vj组合，同样，由部分Vκ片段与部分Vj片断编码的高变区(CDR3区，抗体的特异性主要由该区决定的)也不相同(医学免疫学教材，第四版，人民卫生出版社，2004年8月)。然而，我们的研究结果发现，不同类型肿瘤细胞之间有着完全相同或极为相似的轻链可变区序列，即呈现出Vκ4-1/J3组合特异性序列；并且Vκ4-1/J3组合中的CDR3序列在肿瘤细胞来源的Ig轻链可变区中具有极高的保守性，它和B淋巴细胞来源的CDR3相比具有特异性，表现为肿瘤细胞与B淋巴细胞之间的不同。

本发明在前期研究的基础上，利用非免疫系统来源的肿瘤特异性的轻链可变区Vκ4-1/J3组合序列作为靶点，探讨了针对该序列的反义序列、抗体等在诱导肿瘤细胞的凋亡作用，发现本发明的方案能有效提高肿瘤基因治疗中的靶向性。

因此，本发明的目的在于提供一种癌细胞来源的免疫球蛋白轻链可变区Vκ4-1/J3组合序列，具有SEQ ID NO：1所示的结构。

本发明的另一目的在于提供免疫球蛋白轻链可变区Vκ4-1/J3组合序列中的CDR3序列，具有SEQ ID NO：2所示的结构。

本发明进一步提供了一种癌细胞来源的Vκ4-1/J3组合序列在制备诱导肿瘤细胞凋亡的药剂上的用途。

所述的诱导肿瘤细胞凋亡的药剂优选为，包含Vκ4-1/J3反义序列的药剂；更优选Vκ4-1/J3的反义序列为针对CDR3的反义序列。由于CDR3是Vκ4-1/J3组合序列中高度保守的区域，因此本发明证明了针对CDR3的反义序列能诱导各种肿瘤细胞的凋亡。本发明上述的“针对CDR3的反义序列”可以是仅仅针对CDR3区域的反义序列，也可以是其它包含CDR3区域的反义序列。通过设计Vκ4-1/J3组合序列中其它保守片段的反义序列同样也能阻断轻链可变区Vκ4-1/J3的功能，从而实现诱导癌细胞的凋亡。诱导肿瘤细胞凋亡的药剂还可以优选为，包含Vκ4-1/J3组合序列的抗体的药剂；进一步优选该抗体与核素偶联。

本发明所述的诱导肿瘤细胞凋亡的药剂可以用来各种肿瘤细胞的凋亡，例如肝癌细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肺癌细胞等等。

本发明的方案在提高肿瘤基因治疗的靶向性方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1A为癌来源的Vκ4-1/J3核苷酸共有序列；该癌来源的Vκ4-1/J3核苷酸序列为去掉5’及3’端引物的序列，这一序列在肺癌、大肠癌及乳腺癌细胞中都存在；

图1B为癌来源的Vκ4-1/J3序列中共有的CDR3核苷酸序列；

图2A为CDR3的反义序列抑制HT-29细胞Ig的κ链的表达；其中CON为对照组。

图2B为CDR3的反义寡核苷酸诱导肿瘤HT-29细胞的凋亡；其中CON为对照组。

图3A为Vκ4-1/J3核苷酸序列特异的抗体检测正常人血清中含有Vκ4-1/J3的轻链表达；

图3B为Vκ4-1/J3核苷酸序列特异的抗体检测肿瘤患者血清中含有Vκ4-1/J3的轻链表达。

具体实施方式

实施例1.Ig的Vκ链的RT-PCR扩增

1、细胞培养和从肿瘤细胞系中提取总RNA：

HT-29(大肠癌细胞系)细胞于含有10％FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100ug/ml)的RPMI DMEM培养基，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养。

利用GIBCO-BRL公司的TRIZOL^TM试剂。取HT-29 5×10⁶，离心后收集，加入1ml Trizol^TM试剂，反复吹打破碎细胞，室温静置5分钟后，加入0.2ml氯仿，充分混匀，4℃ 12000rpm 15分钟，收集上清用异丙醇沉淀，70％乙醇洗一次，室温干燥后，总RNA重悬于DEPC处理的H₂O中，分光光度计(Beckman 640)定量后用于cDNA第一链的合成。cDNA第一链的合成按照Gibico公司SUPERSCRIPTTM说明书进行。合成cDNA后直接用于PCR反应。

2、从癌组织中提取总RNA

激光显微切割及RT-PCR：取新鲜的大肠癌、乳腺癌及肺癌组织进行冰冻切片，70％乙醇固定5分钟后，在光学显微镜引导下，对癌巢中的癌细胞进行激光显微切割。按照RNeasy Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)使用说明提取这些分离的癌细胞总RNA，进一步再按Sensiscript RT Kit(Qiagen)使用说明进行逆转录，合成cDNA。接着分别取1μl的cDNA进行PCR。所用PCR引物：

Vκ1：5’-GACATCGAGCTCACCCAGTCTCC-3’；

Vκ2：5’-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3’

Cκ1：5’-GCACCATCTGTCTTCATCTTCCC-3’。

其中Vκ1和Vκ2做为上游引物，Cκ1为下游引物，进行沉降PCR，PCR条件：95℃5分钟；95℃30秒，58℃30秒和72℃30秒，共2个循环；95℃5分钟；95℃30秒，56℃30秒和72℃30秒，共2个循环；95℃5分钟；95℃30秒，54℃30秒和72℃30秒，共2个循环；95℃5分钟；95℃30秒，52℃30秒和72℃30秒，共2个循环；95℃5分钟；95℃30秒，50℃30秒和72℃30秒，共20个循环；72℃7分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物回收、纯化，分别克隆到pGEM T-Easy Vector上，转化至大肠杆菌DH5α，PCR鉴定选取阳性克隆，测定核苷酸序列。

结果显示，分别来自乳腺癌(3例)、大肠癌(两例)、肺癌(1例)及一个大肠癌细胞系(HT-29)的35个克隆的Vκ/Jκ基因片段都呈现Vκ4-1/J3的重组方式，与检测的两例正常人外周血Vκ/Jκ基因片段呈现的多样性形成明显的对比。并且有意思的是这35个Vκ/Jκ基因片段与胚系的Vκ4-1相比已经发生了明显的高频体细胞突变，而这35个不同肿瘤类型来源的Vκ/Jκ片段相互比较发现，它们之间的同源性能够达到95％-100％(图1A)，特别是CDR3区达到100％(图1B)。说明这些肿瘤来源的Vκ4-1/J3序列可结合相同或极其相似的表位，同时也提示，这一共同的Vκ4-1/J3序列可作为不同肿瘤共有的靶点，在肿瘤的治疗和诊断中具有重要的实用意义。

实施例2.Vκ4-1/J3在多种肿瘤组织中表达

用Vκ4-1/J3反义cRNA做为探针，对含有22种肿瘤及相关正常组织的组织芯片(67例)进行原位杂交检测：首先将含有正义及反义Vκ4-1/J3序列的Teasy载体(promega公司产品)分别用SalI或NcoI进行酶切，然后分别用T7或SP6 RNA聚合酶体外合成DIG-标记的正义或反义cRNA探针。进一步对组织芯片脱蜡和水化，然后用0.2M HCl作用10分钟，再用蛋白酶K(10μg/ml in 10mM Tris，pH 8.0 and 1mM EDTA)在37℃作用20分钟，用4％多聚甲醛后固定10分钟，芯片进一步脱水、空气干燥。芯片在42℃孵育2h进行预杂交，然后各芯片用20μl的杂交液(含100ng探针)在42℃孵育18h。然后用含有50％甲酰胺的2×SSC在37℃条件下洗3分钟，再用2×SSC在37℃条件下洗15分钟，用0.1×SSC在37℃条件下洗15分钟。芯片用碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体(Boehringer Mannheim)在37℃条件下孵育1小时，PBS洗后用NBT/BCIP显色。其中正义探针和不含探针的杂交液做为阴性对照。

结果显示，98％的恶性肿瘤细胞及60％的癌旁正常组织显示阳性反应，而无恶性病变个体的正常细胞几乎为阴性反应(阳性率低于5％)(表1)。

表1：原位杂交结果显示Vκ4-1/J3在多种肿瘤细胞中表达

  病例  正义探针阳性  反义探针阳性  乳腺癌(导管癌)  10例  0  10  乳腺小叶增生    6例  0  3  乳腺纤维腺瘤    3例  0  1  正常乳腺        4例  0  1  胰腺癌          2例  0  2  胰腺            1例  0  0  肾癌            3例  0  3正常肾脏        3例02  肝癌            4例  0  4  肝硬变          3例  0  3  正常肝脏        3例  0  0  肺癌            3例  0  3  正常肺          3例  0  0  卵巢癌          3例  0  3  正常卵巢        2例  0  0  子宫内膜癌      2例  0  2  正常子宫内膜    2例  0  1  食道癌          2例  0  2  正常食道        2例  0  0  子宫颈癌        3例  0  2  神经胶质瘤      3例  0  2  室管膜瘤        2例  0  0

实施例3.Vκ4-1/J3核苷酸序列特异的反义寡核苷酸诱导肿瘤细胞的凋亡

由于Vκ4-1/J3组合序列中的CDR3序列在不同的肿瘤中高度保守，因此发明人首先分别合成了一段针对CDR3的正义及反义序列：TAT TAT AGTACT CCT TTC ACT(正义序列)及ATA ATA TCA TGA GGA AAG TGA(反义序列)，该序列可适用于所有癌细胞来源的Vκ4-1序列。培养HT-29细胞，用电穿孔法分别将正义及反义寡核苷酸转染(130V，20ms，脉冲数为1)至细胞内，电转后室温孵育15min，加至适当体积含10％FBS的完全DMEM，铺至24孔板，每组3复孔，CO₂培养箱内37℃培养。分别在12小时、24小时及48小时分别进行细胞内Ig的κ链基因的表达水平及细胞凋亡检测。细胞内Ig的κ链基因的表达水平检测方法：转染后24小时收获细胞，PBS洗，充分重悬细胞，预冷的70％乙醇固定过夜。PBS洗细胞，计数，调至每份2×10⁵，加入兔抗人Igκ链抗体(sigma公司产品)(1∶100)，室温孵育30分钟后，PBS洗两次，再加羊抗兔IgG-FITC(DAKO公司)，4℃，避光30min。PBS洗，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。细胞凋亡检测方法：按AnnenixV&PI双染凋亡检测试剂盒(购自北京宝赛生物公司)说明操作，流式细胞仪检测。

结果显示，针对CDR3的反义序列能够有效抑制HT-29细胞Ig的κ链的表达：与空白对照组及正义序列对照组比较其Igκ表达水平下降28-32％(见图2A)。进一步于转染后不同时间点收获细胞，FCM检测实验组和各对照组的凋亡率，结果显示CDR3的反义序列能够有效诱导HT-29细胞的凋亡(见图2B)，随着时间的推移，凋亡细胞从以Annexin-V单染的早期凋亡细胞为主逐渐转变为以AnnexinV和PI双染的中晚期凋亡细胞为主，最后进一步转变为以PI单染的死亡细胞为主。

采用相同的实验方法，将上述CDR3反义序列转染乳腺癌细胞，肺癌细胞，子宫颈癌细胞系也得到了类似的结果。

实施例4.Vκ4-1/J3核苷酸序列特异的抗体诱导肿瘤细胞的凋亡

Vκ4-1/J3重组蛋白100ug(由宝赛公司完成)和福氏完全佐剂混匀后，皮内多点免疫鸡，共进行四次免疫(1次/月)后，取血后分离免疫血清进行抗体滴度测定，ELISA结果显示，抗体滴度达1∶5000，经盐析法纯化IgG得到鸡抗人Igκ链的抗体，以正常鸡IgG做为对照，进行抗体诱导肿瘤细胞的凋亡实验。用24孔培养板培养几种肿瘤细胞(肺癌细胞系，A549；子宫颈癌细胞系，HeLaS3及HT-29)待对数生长期时，分别按100μg/ml的浓度加入鸡抗人Igκ抗体及正常鸡IgG，分别在36小时和48小时检测细胞凋亡。按AnnenixV&PI双染凋亡检测试剂盒(购自北京宝赛生物公司)说明操作，流式细胞仪检测。

结果显示，鸡抗人Igκ抗体与正常鸡IgG相比，能有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，肿瘤细胞凋亡率可达到50％以上(表2)。

表2.鸡抗人Vκ4-1/J3抗体诱导肿瘤细胞凋亡百分比分析

  分组  HT-29  A549  HeLaS3  36h    48h  36h    48h  36h    48h  PBS组  13％   10％  3％    6％  6％    10％  正常鸡IgG  10％   13％  3％    10％  7％    12％  抗人Vκ4-1/J3抗体  20％   58％  17％   45％  20％   44％

说明：36h及72h下列所对应的百分比数为该时间点的凋亡率。

实施例5.Vκ4-1/J3核苷酸序列特异的抗体检测肿瘤患者血清中含有Vκ4-1/J3重组方式的轻链

首先用抗人Igκ多克隆抗体(1∶1000，用pH7.4、0.01M的PBS稀释，SIGMA产品)包被ELISA检测板，4℃过夜；0.01M的PBS洗三遍后，用封闭液封闭30分钟(封闭液为0.01M的PBS中含0.25％BSA，0.05％Tween-20)；吸出封闭液后分别加入倍比稀释(从1∶20开始)的肺癌及正常人血清，每稀释度设4个复孔，室温下1小时，PBS洗后，将上述4复孔中分为两组，其中一组加入1∶1000稀释的抗人Vκ4-1/J3重组方式的轻链抗体(该抗体由实施例4制得)，另一组加入1∶1000稀释的鸡IgG(两种IgG均用封闭液稀释)，室温下1小时，PBS洗三遍后，各孔加入兔抗鸡IgG-HRP(1∶1000稀释)，室温下1小时，PBS洗三遍后，OPD(邻苯二胺)显色。

我们初步检测了肺癌及正常人血清各10例，正常人未检测到阳性(附图3A)；其中肺癌均为小细胞性肺癌，其阳性率可达5/10(附图3B)。

                                      FPI05260-sequence listing

                      SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>人癌来源的Ig轻链可变区序列和CDR3序列以及它们的用途

<130>FPI05260

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>318

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ccagactccc tggttgtgtc tctgggcgag agggcctcca tcaactgcaa gtccagtcag   60

aatgtttcac tcggctccaa caataagaac tacttagctt ggtaccagca ccaaccagga  120

cagcctccta cgctgctcat ttactgggca tctacccggg aatccggggt ccctgaccga  180

ttcagtggca gcgggtctgg gacgatttca ctctcaccat caacagcctg caggctgaag  240

atgtggcggt ttattactgt cagcaatatt atgatacccc gctcactttc ggccctggga  300

ccaaagtgga aatcaaac                                                318

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

caatattatg ataccccgct cactttcggc                                    30