含有人干扰素的药物组合物在制备预防或/和治疗呼吸道病毒感染疾病药物方面的应用

摘要

本发明涉及一种由人干扰素制备的药物组合物在制备预防或/和治疗呼吸道病毒感染药物方面的应用，属于医药领域。上述组合物含有如下重量份的组分：人干扰素1－99其它辅料1－99。上述的人干扰素可以是人干扰素α2b、α1b、β及干扰素ω、干扰素κ、干扰素λ、干扰素ε等其它I型干扰素，所述的人干扰素为重组人干扰素或/和用其他方法制备的人干扰素。上述辅料可以是磷酸缓冲液、人白蛋白、甘露醇、氯化钠、聚糖、苯甲醇其中的全部或任意部分的组合，用量为药剂学上的有效剂量，以实现缓冲、稳定、防腐作用。上述药物组合物在制备预防或/和治疗呼吸道病毒感染药物，特别是SARS病毒、副流感病毒、流感病毒等引起的呼吸道感染的药物方面有很好的应用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种含有人干扰素的药物组合物在制备预防或/和治疗呼吸道病毒感染疾病药物方面的应用，属于医药领域。

背景技术：

干扰素(interferons，IFNs)是一类至少在同种细胞上有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性和在不同途径上影响细胞的代谢、生长和分化的蛋白质，其活性的发挥需新合成RNA和蛋白质。它是一类重要的细胞素.经近30多年的临床研究和应用，说明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤治疗药物。

迄今所知，人干扰素存在多个型别：干扰素-α，β，δ，γ，ε，κ，λ，τ和ω等型别，它们的主要特点和可能的临床应用见下表：

  型别主要特点临床应用和可能的临床用途  干扰素  -α属I型干扰素；约有23个变种.较详细研究的有约13种亚型.分子量为19-26kDa，由156-166个氨基酸组成.115-151之间为保守序列.基因集中在9p22.受体位于21q22.1.世界上批准用于治疗病毒病和恶性肿瘤的主要干扰素-α有：干扰素-α1b，α2b，α2a.，约有40种治疗适应症.  干扰素  -β属I型干扰素；主要由成纤维细胞所产生，为糖蛋白，166个氨基酸.Cys31/141之间的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的.在DNA水平上与干扰素α有30％的同源性.干扰素α和干扰素-β结合于同一干扰素受体.美国FDA批准治疗多发性硬化.  干扰素  -γ属II型干扰素；由T细胞和NK细胞刺激所产生.二聚体蛋白质.有2处糖基位点.143个氨基酸，无二硫键.对酸不稳定.与干扰素α和β无明显的同源性.基因在12q24.1.受体为于6和21对染色体.FDA批准治疗慢性淋巴肉芽肿；我国FDA批准治疗类风湿性关节炎.  干扰素  -ω属I型干扰素；是人白细胞干扰素的自然成分.又称为干扰素-αII1.与干扰素-α的其它成员高度同源，与之相关的是牛滋养层蛋白质TP-1.干扰素ω结合于与干扰素-α和β同样的细胞受体.1型丙型肝炎  干扰素  -τTP-1属1型干扰素，172个氨基酸与IFN-ω相关.反刍动物滋养层在植床以前几天分泌多种形式的IFN-τ.在识别母体和建立孕体上起有重要作用.在周围血淋巴细胞中，抗HIV的能力比干扰素-α强35倍，在导源于单核细胞的巨噬细胞中比干扰素-α强100倍.可能成为潜在的抗肿瘤药物，而无一般干扰素的毒性作用。可以预防实验性变态反应性脑脊髓炎；还能预防实验性脑脊髓炎超级抗原的重新激活.  干扰素  -δ属I型干扰素，猪孕体的滋养外胚叶与干扰素-γ共同表达，149个氨基酸.  干扰素  -λ(1-3)包括干扰素-λ-1，2和3，也各称为IL-29、IL-28A和IL-28B.基因位于第19对染色体.其受体由2个亚单位组成：CRF2-12(干扰素-λR1)和CRF 2-4(IL-10R2).干扰素-λ-1，2和3均通过同一组受体系统进行信号传递.  干扰素  -κ属I型干扰素；207个氨基酸，N端27个氨基酸是信号肽，与1型干扰素的其它成员有约30％的同源性.与肝素可密切结合.在静止期的树突状细胞和单核细胞可表达干扰素-κmRNA.与干扰素-α和干扰素-β一样使用同一受体.皮肤是机体最外围的防御器官，干扰素-κ的基因可在上皮角化细胞组成性表达，可能与其功能密切相关.  人干扰  素-ε属I型干扰素.189个氨基酸，N端21个氨基酸为信号肽.3个Cys，位于53，163和175.其中有一个Cys是不参与形成二硫键的.基因在9p21.2-21.3有2个N糖基化位点，74和83位.在许多成人组织中组成性地表达动脉硬化症

目前，研究较多并用于临床治疗的有α、β、γ；其它型别干扰素的临床应用价值尚在研究之中。

干扰素目前主要用于抗病毒和肿瘤治疗方面，具有相当明显的疗效，尤其在肝炎的治疗方面被认为是首选药物。鉴于干扰素的广谱抗菌作用，很有希望用于SARS及其它呼吸道病毒感染疾病的治疗，因而，在呼吸道病毒感染疾病方面进行干扰素的应用研究十分必要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种含有人干扰素的药物组合物在制备预防或/和治疗呼吸道病毒感染疾病药物方面的用途。

所述的呼吸道病毒可以是滤泡性口腔炎病毒(VSV)，禽流感病毒，SARS冠状病毒，鼻病毒，麻疹病毒，肠道病毒，腺病毒，疱疹病毒，汉坦病毒。

所述的禽流感病毒可以是低致病性禽流感H9H2或高致病性禽流感H5N1。

所述的鼻病毒可以是鼻病毒14型。

所述的疱疹病毒可以是单纯疱疹病毒-1(HSV-1)或单纯疱疹病毒-2(HSV-2)。

所述的肠道病毒可以是肠道病毒CoxB1。

所述的腺病毒可以是腺病毒7型。

上述药物组合物含有如下重量份的组分：

人干扰素             1-99

其它辅料             1-99。

所述的重量份可以是斤、两、g、Kg等药剂学上常用的计量单位。

本发明药物组合物通过进一步的处理，可以制成药剂学上可接受的各种剂型，优选为注射剂、喷(气)雾剂、冻干粉针等。

辅料含有保护剂、缓冲溶液。

其中，为了不影响干扰素的活性发挥，组分中保护剂的含量应不高于0.2％，一般应控制在0.1-0.2％之间。

缓冲溶液的用量应在10-50mmol/L之间，优选含量为15-25mmol/L。

上述的人干扰素优选人干扰素α2b、α1b、β，还可以是其它I型干扰素，如干扰素ω、干扰素κ、干扰素λ、干扰素ε、即所有人I型干扰素。

上述人干扰素可以是重组人干扰素，也可以是用其他方法制备的人干扰素，如提取的自然人干扰素。

上述的重组人干扰素可以是采用原核表达系统、酵母表达系统或真核表达系统生产制备的重组人干扰素。

上述人干扰素优选为人干扰素α2b或重组人干扰素α2b。

上述保护剂可以是人白蛋白、牛血清白蛋白、甘露醇、氯化钠、聚糖、麦芽糖、苯甲醇、聚乙烯醇、甘油等可用的物质。

缓冲溶液优选磷酸缓冲液。

可以选择其中的全部或部分使用，用量为药剂学上的有效剂量，以实现缓冲、稳定、防腐作用。

上述人干扰素可以通过发酵工程制备得到，也可通过商购得到。

上述组合物剂型中，按照实际用量的需要，人干扰素的活性可以是0.1-500万IU/mL或0.1-500万IU/g。

干扰素喷雾剂要求干扰素必须达到一定浓度才能有好的效果，而提高干扰素的浓度却使喷雾剂的稳定性变差，因此制备高浓度的干扰素喷雾剂是一个需要突破的技术问题。

本发明研究人员发现，在辅料中选用麦芽糖可以很好的增加制剂的稳定性，特别是使喷雾剂的稳定性得以增强。

上述剂型的制备方法可以是药剂学上的通用方法。

所制得的药物制剂可以用来预防、治疗、预防和治疗呼吸道病毒感染药物，特别是用来制备预防、治疗、预防和治疗SARS病毒、副流感病毒或流感病毒等引起的呼吸道感染药物。

从实验室研究、猴体试验和较大规模的临床验证研究已经获得的大量数据证明本发明喷雾剂预防SARS病毒、副流感病毒、流感病毒等引起的呼吸道感染有较确切的流行病学效果。

本发明研究人员发现重组人干扰素α2b以及其它类型的干扰素在细胞培养上可以抑制SARS病毒的繁殖。

本发明研究人员采用经典的干扰素活性测定方法，采用SARS病毒-RDa细胞(人横纹肌瘤细胞株)系统，将生长在10％FCS的RPMI-1640培养基的RDa细胞按1×10⁵/ml接种96孔细胞培养板，每孔体积100μl，过夜培养后加入100μl系列稀释的干扰素α2b、α1b、β、ω(各三个平行孔)，作用12小时后弃培养液，重新加入用含2％FCS的RPMI-1640培养基稀释的50×TCID50的SARS病毒150μl(中国疾控中心病毒病所分离、培养)，24小时后观察病变，待病毒对照完全病变后，目测记录抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最小量，结果证实重组人干扰素a2b、a1b、β在RDa细胞培养上对SARS病毒(冠9株)有明显的抑制作用。

本发明所述的药物组合物对预防或/和治疗呼吸道病毒感染疾病有着很好的效果，而且药物的副作用小，有利于病患者使用。

附图说明：

图1：正常对照组  HE染色  10×40  鼻腔部上皮组织未见增厚，组织结构正常

图2：给药组  HE染色  10×40  上皮组织未见增生，角化不过度，组织结构正常

图3：正常对照组  HE染色  10×40  肌肉组织未见有肿胀，未见有炎症

图4：给药组  HE染色  10×40  肌肉组织未见有肿胀

图5：正常对照组  HE染色  10×40  血管内有轻度淤血

图6：给药组  HE染色  10×40  血管内有轻度淤血

图7：4种重组人干扰素抑制SARS病毒在Rda细胞系培养上50％病变的最小干扰素单位(n＝4)(各组之间显著性测定：P值均＞0.1)

图8：4种感染素抑制SARS病毒引起的50％病变的最小干扰素蛋白质量(n＝4)在rIFN-a2b、IFN-w1b与rIFN-a1b之间，P＜0.02；其余各组间P＞0.05

图9：微阵列基因芯片技术检测SARS病毒在不同条件下的RNA转录水平。

A：IFN-0表示没有预先用干扰素α2b处理的SARS病毒各个基因的RNA水平；

B：IFN-1-100和C：IFN-10000分别表示预先用干扰素α2b 100和10000IU处理细胞的条件下SARS病毒各个基因的RNA水平。

图10：重组人干扰素a2b抑制多种病毒在细胞培养上繁殖相对活性的比较(以抑制VSV引起病变的50％为1与其它病毒进行比较)

1：VSV，2：H9N2，3：H5N1，4：SARS，5：MV，6：CoxB1，7：Ad-7，8：HSV-1，9：HSV-2，10：EHFV，11：RV

图11：本发明产品抑制多种病毒在细胞培养上繁殖相对活性的比较(以抑制VSV引起病变的50％为1与其它病毒进行比较)

1：VSV，2：H9N2，3：H5N1，4：SARS，5：MV，6：CoxB1，7：Ad-7，8：HSV-1，9：HSV-2，10：EHFV，11：RV

图12：对照#0401肺组织局灶间质性炎，局灶肺间隔增厚

图13：对照组#0402肺组织间质性炎，肺间隔增厚伴炎细胞浸润

图14：试验组#0407肺组织形态基本正常

图15：试验组#0408肺间质性炎，增厚肺间隔内炎细胞浸润

图16：试验组#0409肺间质性炎，肺间隔融合伴炎细胞浸润

图17：试验组#0410肺组织形态基本正常

图18：干扰素组和对照组中和抗体滴度的几何均数

图19：SARS病毒攻击后27天干扰素组和对照组IgG抗体滴读的几何均数

图20：对照组和感染素组在SARS病毒攻击后不同时间内猴咽拭子病毒基因拷贝数的消长情况(real-timePCR结果)。纵坐标为SARS病毒攻击后天数；纵坐标为病毒基因拷贝数(log)

图21：干扰素-α2b喷雾剂对SARS接触者的预防感染效果(1,730例)(SARS-CoV-IgG抗体阳性率)

图22：第一阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(927人)

图23：第二阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(558人)

图24：第一、二阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(1485人)

图25：对照组与干扰素组免疫后阳性标本中的麻疹病毒基因拷贝数的比较

图26：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的风疹病毒基因拷贝数的比较

图27：对照组与干扰素组免疫后阳性标本中的麻疹病毒基因拷贝数的比较

图28：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的风疹病毒基因拷贝数的比较

图29：Ct值的确定

图30：荧光定量标准曲线

图31：对照组与干扰素组免疫后阳性标本中的麻疹病毒基因拷贝数的比较

图32：Ct值的确定

图33：荧光定量标准曲线

图34：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的风疹病毒基因拷贝数的比较

具体实施方式：

                                       实施例1

按照药剂学上的方法，制备喷雾剂，每瓶装量为3.65毫升，其中重组人干扰素-α2b(北京远策药业有限责任公司)活性含量为300万IU/毫升，人白蛋白含量为0.5％，苯甲醇含量为0.5％，聚糖含量为0.1％，磷酸缓冲液浓度为20mmol/L。

本实施例产品每瓶为300万IU/mL*3.65mL，一个预防疗程为1瓶，使用3-5天，既保证了干扰素局部使用的有效剂量，又可限定用量。

对动物进行了试验，其对黏膜、皮损皮肤的刺激性与生理盐水相似，未发现有严重副反应，与美国IntronA粉针剂比较，其副作用为中度，而本实施例产品副作用可忽略不计，可见本发明产品喷雾剂的具有明显的副作用小的优点。

中药研究所实验动物中心进行小鼠鼻咽给药的安全性试验，结果表明喷雾剂未见明显的鼻腔呼吸部的刺激症状，组织结构正常。

                                       实施例2

按照注射剂的制备方法，将重组人干扰素-α1a(北京远策药业有限责任公司)加入pH为7的磷酸缓冲溶液，使干扰素活性含量为100万IU/mL，加入苯甲醇作为防腐剂，重量含量为0.5％。

                                       实施例3

参照实施例2的方法，将得到的注射液分装入西林瓶中，每瓶1.5毫升，冷冻干燥，得到冻干粉针剂。

                                       实施例4

取重组人干扰素-β(北京远策药业有限责任公司)1000万IU，7.8g氯化钠，3.5g Na₂HPO₄·12H₂O，4.4g聚糖，加入注射用水，配制成1000mL溶液，使用H₃PO₄调节pH为7.0，制得水针剂，人干扰素-β活性含量为1万IU/mL。

                                       实施例5

取重组人干扰素-α2b(北京远策药业有限责任公司)1000万IU，8.5g氯化钠，1.7gNaH₂PO₄·2H₂O，5.0g聚糖，加入注射用水，配制成1000mL溶液，使用NaOH调节pH为7.0，制得水针剂，人干扰素-α2b活性含量为1万IU/mL。

                                       实施例6

按照实施例4的方法，将调节pH值后的溶液冷冻干燥，制备冻干粉针剂20支，每支人干扰素-β活性含量为50万IU/mL。

                                       实施例7

参照实施例1的制备过程，将其中的聚糖替换为麦芽糖，制得喷雾剂。

                                       比较例

将实施例1的产品和实施例7的产品进行长期稳定性测试，两者外观、澄明度、pH没有明显变化，生物活性的稳定性表明，实施例1和实施例7的喷雾剂在4-8℃放置24个月活性没有明显下降，其他各项指标均符合质量要求；在20℃下放置11个月实施例1产品干扰素效价没有改变，实施例7产品在14个月后效价没有改变，说明本发明喷雾剂稳定性很好。

                                       实验例1

本实验例通过对实施例1鼻腔喷雾剂对小白鼠的鼻粘膜刺激作用实验，进行喷雾剂安全性研究。

1、仪器：

自动脱水机：日本Sakura

切片机：德国Leitz

自动染色机：日本Sakura RSH-100

光学显微镜：日本Nikon

自动照相生物显微镜：日本Olympus BH-2

2、方法：2003年6月17日：送检鼠11只，正常对照组5只，给药组6只。动物处死后解剖，肉眼观察，立即取外鼻部、鼻粘膜，固定于10％甲醛溶液中，取材后流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲笨透明，浸蜡包埋，切片，HE染色，光学树脂封片，光学显微镜下观察，照相。各组均附显微照相彩色照片。

3、观察结果：

(1)肉眼观察结果：正常对照组5只小鼠的鼻外膜未见有充血、水肿，未见有溃烂，也未见有明显的病理形态学变化。给药组6只小鼠的鼻外膜基本同正常对照组，未见有充血、水肿，未见有溃烂，未见有明显的病理形态学变化。给药组6只小鼠的鼻外膜基本同正常对照组，未见有充血、y网中，未见有溃

(2)镜下观察结果：

5只正常对照组：小鼠的鼻上皮丈膜未见有增厚，腔呼吸部表面角化不过度，未见炎症细胞浸润。粘膜下层肌肉组织未见有肿胀，有一只小鼠上皮下血管内有淤血，组织结构正常。

6只给药组：所送小鼠的鼻腔呼吸部上皮层粘膜未见有增厚，表面角化不过度，未见炎症细脂浸润，粘膜下肌肉组织未见有肿胀，上皮下有两只小鼠血管内有淤血，其它组织结构正常。

4、结论：所送检的动物给药组与正常对照组相比，未见有明显的鼻腔呼吸部的刺激症状，组织结构正常。

5、参考资料：

(1)《实用组织学》杜卓民主编 人民卫生出版社 1998，P48

(2)《实用外科病理学》陈忠年主编 上海医科大学出版社 1997，P513-536

(3)《研究用生物显微镜》余炳生 张仪编著 1989，P53-54

7、小鼠鼻咽部给药刺激实验病理组织切片照片，见图1-6。

                                    实验例2

本发明产品抗SARS病毒的实验室研究

具体数据如下表：

4种重组人干扰素抑制SARS病毒在Rda细胞系培养上50％病变的最小干扰素单位(n＝4)

  干扰素种类  抑制SARS病毒引起细胞病变50％的最小干  扰素活性单位(IU)(国际单位/毫升)  SARS病毒对照 Rda细胞对照  rIFN-α2b  160.5±129.5  +++ -  rIFN-α1b  149.0±71.7  +++ -  rIFN-β1b  69.5±61.5  +++ -  rIFN-ω1b  87.3±47.1  +++ -

注：各型干扰素均由大肠杆菌产生，纯度均大于95％。各组之间显著性测定：P值均＞0.1

4种重组人干扰素抑制SARS病毒在Rda细胞系培养上50％病变的最小干扰素单位(n＝4)(各组之间显著性测定：P值均＞0.1)，见图7。

4种干扰素在Rda细胞系培养上抑制SARS病毒引起50％病变的最小干扰素蛋白量(n＝4)，在rIFN-a2b、IFN-w1b与rIFN-a1b之间，P＜0.02；其余各组间P＞0.05，见下表：

  干扰素种类  抑制SARS病毒引起的50％病变的最小干  扰素浓度(ng/ml)  SARS病毒对照 Rda细胞对照  rIFN-α2b  0.6±0.5(ng/ml)  +++ -  rIFN-α1b  10.6±5.1(ng/ml)  +++ -  rIFN-β1b  3.5±3.1(ng/ml)  +++ -  IFN-ω1b  0.9±0.5  +++ -

4种感染素抑制SARS病毒引起的50％病变的最小干扰素蛋白质量(n＝4)在rIFN-a2b、IFN-w1b与rIFN-a1b之间，P＜0.02；其余各组间P＞0.05，见图8。

SARS病毒全基因组cDNA微阵列生物芯片图见下表：

  A  A  A  A  A  A  A  A  A  H1  Lp  NSP2  NSP3  NSP4  NSP5  NSP6  NSP7  NSP12  H1  NSP13  X  (25268-  26092)  Y  (25689-  26153)  E  Z  (27074-  27265)  R  (27273-  27641)  N  U  28130-  28426  H1  NSP1  NSP8  NSP9  NSP10  S  M  NEG  NEG

微阵列基因芯片技术检测SARS病毒在不同条件下的RNA转录水平见图9，其中A：IFN-0表示没有预先用干扰素α2b处理的SARS病毒各个基因的RNA水平；B：IFN-1-100和C：IFN-10000分别表示预先用干扰素α2b 100和10000IU处理细胞的条件下SARS病毒各个基因的RNA水平。

                                           实验例3

本发明产品抑制多种呼吸道病毒的研究

(1)鼻病毒：

除冠状病毒外，引起感冒的病原主要是鼻病毒，所以我们采用三种人二倍体细胞，研究了重组人α2b型干扰素抗14型鼻病毒的敏感性，结果表明本发明产品抑制鼻病毒繁殖的活性十分强烈，见下表：重组人α2b型干扰素抗鼻病毒的敏感性试验

  实验次数  抑制50％病毒细胞病变所需的最小干扰素量(国际单位/ml)  VSV/WISH  RV14/WI38  RV14/MRC5  RV14/2BS  1  1  1.35  1.32  1.56  2  1  1.32  1.03  1.19  平均  1  1.34  1.18  1.38

干扰素在VSV/WISH测定系统上效价为500000IU/ml作为1计算，表中所列为2次实验的结果，每次实验的数据均为2次测试的平均数。由上表可见，鼻病毒-14(RV14)对干扰素是十分敏感的，它与对干扰素最敏感的VSV病毒相比几乎接近。

(2)11种病毒在不同细胞上对重组人干扰素α2b的敏感性比较。

采用上述同样的方法，在不同的细胞系统上，比较研究了重组人α2b型干扰素对禽流感强毒株H5N1、弱毒株H9N2，SARS病毒北京分离株，麻疹病毒，柯萨奇病毒CoxB1，7型腺病毒，单纯疱疹病毒1和II型，出血热病毒和鼻病毒等的相对抑制能力，结果见图10。

图10结果表明，本发明产品的抗病毒活性是广谱的，其中对鼻病毒、SARS病毒，禽流感病毒尤其敏感。

                                         实验例4

本发明产品对低和高致病性禽流感等11种病毒在细胞培养上的抑制病毒试验

目的：在不同细胞培养上研究干扰素α2b多种病毒的抑制作用

方法：

病毒株：滤泡性口腔炎病毒(VSV)，低致病性禽流感H9H2，高致病性禽流感H5N1，SARS冠状病毒病毒所株及香港株，麻疹病毒，肠道病毒CoxB1，腺病毒7型，单纯疱疹病毒-1，2(HSV-1，2)，汉坦病毒，鼻病毒14型均由病毒所毒种室提供。

细胞系：MDCK细胞系：检测H9N2和H5N1；

WISH细胞系：测定干扰素活性；

人横纹肌瘤(Rda)细胞系：SARS病毒；

原代地鼠肾细胞：检测汉坦病毒；

二倍体细胞株(WI38)：检测其它病毒。

敏感性比较：由于干扰素有很严格的种属特异性，同一干扰素在不同种属的细胞培养上有不同的活性，因此所有比较均以VSV病毒在所用细胞培养上的干扰素活性为1进行比较，相对活性愈小愈敏感。每次实验重复3次。

结果：11种病毒在不同细胞上对重组人干扰素α2b的敏感性比较见图11。由图11可见，人干扰素α2对SARS病毒，禽流感病毒，鼻病毒均很敏感。

                                            实验例5

本实验例为实施例1产品鼻腔喷雾剂预防和治疗恒河猴感染SARS-CoV病毒感染的效果试验。

由中国医学科学院动物研究所恒河猴作为SARS-CoV病毒感染动物模型。

本研究的试验动物来源于昆明中国医学科学院医学生物学研究所；种属品系：恒河猴；动物级别：SPF级；体重：2.4-4.2kg；年龄：3岁。共10只恒河猴，雌雄兼用，随机分为2组，每组5只。分别为试验组(实施例1)和对照组(空白干扰素喷雾剂)。病毒株为PUMC01(Sino-3)株SARS-CoV；病毒滴度为：5.08LgCCID₅₀/ml，-80℃保存，攻击病毒量为10⁵TCID₅₀，1.0ml/只，经鼻腔喷雾吸入。

分别在攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h经鼻腔不同时间经鼻腔喷雾干扰素-α2b，每次0.4ml/只。按计划定时取咽拭子做real-time PCR检测和病毒分离；取静脉血做病毒分离检测、中和抗体、IgG抗体、血常规、血生化和血凝指标以及大体解剖和组织病理检查。

10只动物随机分为2组，5只/组。分别为试验组(实施例1)和对照组(空白干扰素)。分别在攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h不同时间经鼻吸入受试物，0.4ml/只。按计划定时取咽拭子做real-time PCR检测和病毒分离；取静脉血做病毒分离检测、中和抗体、IgG、血常规、血生化和血凝指标。

结果：1.对照组：全部动物咽拭子标本经real-time PCR均检出SARS-CoV病毒，持续时间从攻毒后2天至8天。攻毒后2天3只、5天1只、7天2只，其咽拭子标本中病毒分离阳性，攻毒后，诱导产生高滴度的中和抗体和IgG，证实病毒感染。大体解剖全部动物肺脏为灰白色，有大面积出血，2只动物肺脏与胸壁有粘连。病理结果显示2只动物有肺间质性炎，其中#0402病变范围较#0401广，表现为以肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润为主要特征的肺部病变，病变较单一；其它各受检脏器均未见明显异常。2.试验组：和对照组相同时取的咽拭子等标本中，real-time PCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应很弱。3.血常规、血生化和血凝指标结果表明干扰素试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变；大体解剖动物肺脏为灰粉色，4只动物肺脏有少量出血，其中1只动物肺脏与胸壁有粘连。病理结果显示2只动物肺组织形态基本正常，2只动物有肺间质性炎，表现为以肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润为主要特征的肺部病变，病变较单一，其中1只增厚的肺间隔有局灶相互融合，这2例肺部病变与对照组的病变表现一致，而病变累及范围较模型组小；其它各受检脏器均未见明显异常。

结论：本发明实施例1可以有效阻断或减弱SARS-CoV病毒对恒河猴的感染。对恒河猴有保护作用。临床观察无不良反应。

目的：评价重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂对预防治疗SARS-CoV病毒感染恒河猴的作用受试物

1.名称：本发明实施例1腔喷雾剂用于试验组

干扰素含量：300万单位/毫升，每瓶3.65毫升，共1095万单位

制备方法：大肠杆菌生产，高度纯化(＞95％)

保存条件：4℃

溶剂：磷酸缓冲液、人白蛋白、甘露醇、氯化钠、苯甲醇

2.名称：空白干扰素鼻腔喷雾剂，用于对照组

干扰素含量：无

制备方法：以生理盐水替代干扰素

保存条件：4℃

溶剂：磷酸缓冲液、人白蛋白、甘露醇、氯化钠、苯甲醇

3.攻击用毒种

名称：PUMC01(Sino-3)株SARS-CoV

提供单位：中国医学科学院实验动物研究所

病毒滴度：5.08LgCCID₅₀/ml

保存条件：-80℃

动物

来源：中国医学科学院医学生物学研究所

种属品系：恒河猴

动物级别：SPF级

合格证号：滇实动证第2003006

体重：2.4-4.2kg

年龄：3岁

每组动物数：5只

性别：雌雄兼用

饲养条件：动物饲养在BSL-III实验室内，隔离柜单笼饲养，压差-20Pa，温度20±1℃，换气次数为14-17次/小时，每日饲喂2次混合颗粒饲料。试验前动物适应1周，检查动物的血常规、血凝指标、血生化、抗SARS抗体等各项指标，择其正常，健康，雌性无孕的动物作为受试动物。

饲料

种类：猴膨化饲料

供给单位：军事医学科学院动物中心

合格证号：SCXK-(军)2002-001

动物分组及剂量

  组别  动物数  剂量  给予受试物  时间(攻毒为0时)  安乐处死时  间  试验组  (本发明鼻腔喷雾  剂)  5只  0.4ml/只  (0.2ml/鼻孔)  -19h、-1h、7h、23h、31h、47h、  55h、71h、95h、119h  攻毒后  27天  对照组  (空白干扰素)  5只  0.4ml/只  (0.2ml/鼻孔)  -19h、-1h、7h、23h、31h、47h、  55h、71h、95h、119h  攻毒后  27天

分组方法：随机分组

动物攻毒剂量：10⁵TCID₅₀，1.0ml/只

动物攻毒途径：经鼻吸入

给受试物途径

与临床拟用途径一致：经鼻吸入

实验室：中国医学科学院实验动物研究所生物安全三级防护实验室(BSL-III)。

许可证号：SYXK(京)2003-0004

试验方法：10只动物随机分为2组，5只/组。分别为试验组(重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂)和对照组(空白干扰素)。共给予10次受试物，分别为攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h。经鼻吸入受试物，0.4ml/只(0.2ml/鼻孔)。攻毒后1-8天每天取咽拭子做real-timePCR检测；攻毒后2天、5天、7天咽拭子和血浆做病毒分离；攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天取血测血常规、血生化和血凝指标；攻毒后11天、19天和27天取血测IgG；攻毒后19、27天取血测中和抗体。

观察指标：

1.一般状态的观察。

2.中和抗体：攻毒后19、27天。

3.IgG：试验前及攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。

4.real-time PCR检测咽拭子：攻毒后1-8天。

5.病毒分离(咽拭子和血浆)：攻毒后2天、5天、7天。

6.血常规：攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。

7.血生化：攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。

8.血凝：攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。

9.脏器系数。

10.大体解剖。

11.组织病理。

结果

一.一般状态的观察

对照组动物攻毒后1-2天时体温一过性升高，第3天全部动物出现精神欠佳、活动减少、摄食量减少，3只动物出现呼吸短促等临床症状，到攻毒后第7天有所缓解。干扰素试验组动物未见异常。

试验组体温在攻毒后7天和11天与对照组比较有显著性降低，P＜0.05，对照组攻毒0天、3天和11天与试验前比较有显著性升高，P＜0.05。结果见下表：动物体温结果，n＝5，单位：℃

  对照组  试验组 试验前  38.6±0.3  38.5±0.4 攻毒0天(4h)  39.0±0.2#  38.6±0.4 攻毒1天  38.9±0.1  38.8±0.5 攻毒2天  38.8±0.3  38.8±0.5 攻毒3天  39.2±0.4#  38.9±0.5 攻毒4天  38.9±0.3  38.9±0.4 攻毒5天  38.7±0.3  38.5±0.4 攻毒6天  38.7±0.3  38.5±0.2 攻毒7天  38.9±0.1  38.4±0.4^* 攻毒8天  38.7±0.2  38.5±0.4 攻毒9天  38.4±0.2  38.4±0.3 攻毒11天  39.0±0.1#  38.1±0.6^* 攻毒13天  38.4±0.04  38.4±0.3 攻毒15天  38.6±0.2  38.2±0.6 攻毒17天  38.6±0.1  38.2±0.5 攻毒19天  38.5±0.1  38.1±0.4 攻毒21天  38.6±0.1  38.3±0.4 攻毒23天  38.5±0.1  38.3±0.4 攻毒27天  38.7±0.4  38.4±0.7

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。

二.中和抗体

动物攻毒后19天，试验组动物中和抗体水平很低，1∶5-10，GMT为7.6，与对照组比较有非常显著性差异，P＜0.01；对照组动物中和抗体滴度1∶20-80，GMT为45.9。攻毒后27天，试验组动物中和抗体仍然处于低水平，滴度为1∶5-10，GMT为10.0，与对照组比较有显著性差异，P＜0.05；对照组动物中和抗体滴度1∶10-80，GMT为40.0。中和抗体结果见下表：

  猴号  攻毒19天  攻毒27天  对  照  组  #0401  1∶80  1∶80  #0402  1∶80  1∶10  #0403  1∶20  1∶40  #0404  1∶80  1∶40  #0405  1∶20  1∶80  GMT  45.9  40.0  试  验  #0406  1∶10  1∶20  #0407  1∶5  1∶5  #0408  1∶5  1∶10  组  #0409  1∶10  1∶10  #0410  1∶10  1∶10  GMT  7.6^**  10.0^*

血清1∶5开始对倍稀释，终浓度到1∶640，GMT为几何均数。

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05；^**表示试验组与对照组比较有非常显著性差异，P＜0.01。

三.IgG

试验组动物从攻毒后15天到第27天，产生低水平抗体或未有抗体产生；此期间对照组动物产生较高抗体，并持续到27天安乐死。结果见下表：

 猴号  试验前 攻毒3 天 攻毒7 天  攻毒  11天  攻毒  15天  攻毒  19天  攻毒  23天  攻毒  27天  对  照  组 #0401  0 0 0  10  40  80  160  160 #0402  0 0 0  0  80  80  80  20 #0403  0 0 0  0  20  20  20  20 #0404  0 0 0  10  20  40  40  40 #0405  0 0 0  0  0  10  10  10  试  验  组 #0406  0 0 0  0  0  0  0  0 #0407  10 10 0  0  10  10  10  10 #0408  0 0 0  0  0  0  0  0 #0409  0 0 0  0  0  0  0  0 #0410  10 10 0  0  0  10  10  10

四.real-time PCR

对照组全部动物咽拭子均检出SARS-CoV病毒，持续时间从攻毒后2天至8天。试验组动物咽拭子未检出病毒。拷贝数目见下表：

 猴号 攻毒2天 攻毒3天 攻毒4天 攻毒5天 攻毒6天 攻毒7天  攻毒8天  对  照  组 #0401 3.303 ×10³ 3.118 ×10³ 2.252 ×10³ 4.791 ×10² 2.652 ×10² 4.310 ×10²  7.162×    10² #0402 - 2.299 ×10² 2.639 ×10² 5.134 ×10¹ - -  7.696×    10¹ #0403 - 4.277 ×10² 9.453 ×10¹ 3.696 ×10¹ 1.173 ×10³ 1.348 ×10²  - #0404 - 1.834 ×10² 1.918 ×10² 5.778 ×10¹ 4.073 ×10² 1.573 ×10²  1.820×    10³ #0405 - - - - - 3.692 ×10¹   -  试  验  组 #0406 - - - - - -   - #0407 - - - - - -   - #0408 - - - - - -   - #0409 - - - - - -   - #0410 - - - - - -   -

五.病毒分离

对照组动物咽拭子攻毒后2天3只为阳性，5天1只为阳性，7天2只为阳性。试验组动物咽拭子和所有动物血浆均为阴性。病毒分离结果见下表：

  猴  号           咽拭子           血浆  对  照  组 攻毒2天 攻毒5天 攻毒7天 攻毒2天 攻毒5天 攻毒7天  #0401 + + + - - -  #0402 + - - - - -  #0403 + - + - - -  #0404 - - - - - -  #0405  试  验  组  #0406 - - - - - -  #0407 - - - - - -  #0408 - - - - - -  #0409 - - - - - -  #0410 - - - - - -

六.血常规

动物攻毒后3天、7天，试验组与对照组比较RBC、HgB有显著性升高，P＜0.05；攻毒后11天、15天和19天试验组和对照组与攻毒前比较有显著性降低，P＜0.05。结果见表6～表13。

表6：试验前血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  8.5±5.2  8.3±2.4  中性(％)  48.0±25.9  41.9±13.0  嗜酸(％)  2.4±1.8  1.4±0.5  嗜碱(％)  0.0±0.0  0.0±0.0  淋巴(％)  49.4±25.7  56.7±13.5  单核(％)  0.2±0.4  0.0±0.0  RBC(10¹²/L)  5.0±0.4  5.2±0.2  HgB(g/L)  102.6±10.9  108.2±8.6  HCT(L/L)  0.3±0.03  0.3±0.02  MCV(fL)  62.4±2.1  59.2±2.1  MCH(pg)  20.2±2.1  20.7±1.1  MCHC(g/L)  325.4±39.3  349.6±15.0  RDW(％)  9.8±1.1  9.4±0.6  PLT(10⁹/L)  314.8±139.7  244.0±64.2  PCT(ml/L)  1.76±0.72  1.35±0.31  MPV(fL)  5.6±0.3  5.6±0.4  PDW(％)  39.8±3.4  42.6±8.3

试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表7：攻毒3天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  4.3±1.6  6.6±3.6  中性(％)  44.2±25.3  42.4±13.9  嗜酸(％)  8.6±14.8  1.2±2.2  嗜碱(％)  1.4±1.5  1.0±1.2  淋巴(％)  43.4±11.4  54.8±13.3  单核(％)  2.4±1.8  0.6±0.9  RBC(10¹²/L)  4.7±0.5^*  5.4±0.3^*  HgB(g/L)  95.0±8.6^*  106.6±6.2^*  HCT(L/L)  0.3±0.05  0.3±0.02  MCV(fL)  62.4±1.9  59.8±2.6  MCH(pg)  30.1±22.5  19.9±1.4  MCHC(g/L)  322.0±5.1  332.6±11.9  RDW(％)  9.3±0.5  10.4±1.8  PLT(10⁹/L)  253.6±116.0  221.7±115.7  PCT(ml/L)  1.47±0.55  1.40±0.22  MPV(fL)  6.3±1.8  5.3±0.1  PDW(％)  43.6±5.3  39.4±5.3

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05。

表8：攻毒7天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  6.0±3.8  8.7±4.9  中性(％)  44.4±16.7  45±25.8  嗜酸(％)  2.0±2.0  2.2±3.3  嗜碱(％)  1.2±1.6  0.8±1.1  淋巴(％)  51.8±15.8  51.0±24.6  单核(％)  0.6±0.9  1.0±0.0  RBC(10¹²/L)  3.6±0.5##  4.3±0.3^*##  HgB(g/L)  76.8±10.3##  88.8±7.4##  HCT(L/L)  0.2±0.03##  0.3±0.02##  MCV(fL)  66.9±11.6  60.5±2.1  MCH(pg)  21.2±1.1  20.9±0.9  MCHC(g/L)  337.2±12.2  345.4±9.0  RDW(％)  8.9±0.8  9.7±1.5  PLT(10⁹/L)  290.4±72.9  376.0±177.8  PCT(ml/L)  1.76±0.47  2.15±0.98  MPV(fL)  6.4±1.0  5.7±0.3  PDW(％)  49.2±7.7^*#  39.4±2.9^*

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05；#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。

表9：攻毒11天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  6.0±2.6  8.7±1.3  中性(％)  51.8±8.9  49.2±20.5  嗜酸(％)  3.8±4.8  2.2±3.2  嗜碱(％)  0.6±0.9  0.2±0.4  淋巴(％)  43.6±10.0  47.8±20.6  单核(％)  0.2±0.4  0.6±0.5#  RBC(10¹²/L)  3.7±0.4##  4.4±0.5#  HgB(g/L)  80.4±7.7##  91.8±10.9#  HCT(L/L)  0.2±0.01##  0.3±0.03##  MCV(fL)  64.4±5.7  59.5±2.7  MCH(pg)  21.6±0.6  21.0±1.5  MCHC(g/L)  337.2±22.0  353.4±11.5  RDW(％)  10.8±1.5  9.7±0.9  PLT(10⁹/L)  367.2±103.4  332.8±138.9  PCT(ml/L)  2.11±0.53  1.88±0.79  MPV(fL)  5.9±0.8  5.7±0.4  PDW(％)  40.3±4.6  42.1±7.2

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。

表10：攻毒15天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  6.1±1.9  10.0±3.6  中性(％)  47.4±8.7  41.9±14.9  嗜酸(％)  3.8±5.3  2.2±2.9  嗜碱(％)  0.8±1.3  0.2±0.4  淋巴(％)  47.0±7.0  55.1±14.5  单核(％)  1.0±1.7  0.6±0.5#  RBC(10¹²/L)  4.3±0.3#  4.1±0.9#  HgB(g/L)  89.4±6.3#  85.6±9.1##  HCT(L/L)  0.3±0.02#  0.2±0.1#  MCV(fL)  67.8±10.9  60.2±2.2  MCH(pg)  20.8±0.8  21.7±5.3  MCHC(g/L)  326.4±4.8  359.6±74.5  RDW(％)  9.9±1.2  9.5±0.6  PLT(10⁹/L)  528.2±200.5  669.2±523.3  PCT(ml/L)  2.7±0.87  4.22±3.78  MPV(fL)  5.5±0.2  6.2±1.5  PDW(％)  40.5±3.7  40.9±3.1

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。

表11：攻毒19天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  7.0±2.3  9.1±3.0  中性(％)  43.2±16.6  37.6±24.0  嗜酸(％)  6.6±6.3  4.8±5.0  嗜碱(％)  0.2±0.4  0.2±0.4  淋巴(％)  48.8±13.6  57.0±21.7  单核(％)  1.2±1.6  0.4±0.5  RBC(10¹²/L)  4.3±0.4#  4.4±0.2##  HgB(g/L)  129.6±81.9  91.6±5.5##  HCT(L/L)  0.3±0.03#  0.3±0.01##  MCV(fL)  62.8±2.7  60.0±2.0  MCH(pg)  31.6±23.7  20.9±0.7  MCHC(g/L)  465.0±298.6  348.8±6.0  RDW(％)  8.5±1.9  9.2±2.2  PLT(10⁹/L)  373.6±98.4  295.8±48.7  PCT(ml/L)  2.22±0.80  1.65±0.31  MPV(fL)  5.7±0.6  5.5±0.3  PDW(％)  43.4±7.4  38.8±5.1

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。

表12：攻毒23天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  9.2±4.1  9.7±4.3  中性(％)  49.4±12.7  34.8±22.9  嗜酸(％)  6.4±6.8  2.2±1.9  嗜碱(％)  0.0±0.0  0.6±0.9  淋巴(％)  43.8±13.8  62.2±22.6  单核(％)  0.4±0.5  0.2±0.4  RBC(10¹²/L)  4.3±0.4#  4.6±0.5#  HgB(g/L)  106.0±18.1  96.8±12.8  HCT(L/L)  0.3±0.03  0.3±0.04  MCV(fL)  62.8±2.2  62.0±2.8  MCH(pg)  38.5±34.5  21.1±1.5  MCHC(g/L)  496.0±285.9  341.0±8.8  RDW(％)  9.8±0.9  7.8±5.3  PLT(10⁹/L)  510.2±273.1  379.3±111.1  PCT(ml/L)  2.86±1.49  2.14±0.54#  MPV(fL)  5.5±0.3  5.6±0.2  PDW(％)  41.7±3.2  42.7±2.3

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。

表13：攻毒27天血常规，n＝5

  项目  对照组  试验组  WBC(10⁹/L)  6.0±1.0  6.2±1.1  中性(％)  48.0±8.0  40.6±15.6  嗜酸(％)  3.8±3.3  1.8±0.8  嗜碱(％)  0.8±0.8  0.0±0.0  淋巴(％)  46.8±7.8  57.0±15.1  单核(％)  0.6±0.5  0.6±0.5  RBC(10¹²/L)  4.2±0.2##  4.3±0.7#  HgB(g/L)  91.8±8.3  89.6±15.4#  HCT(L/L)  0.3±0.02##  0.3±0.04#  MCV(fL)  62.7±2.9  60.4±2.8  MCH(pg)  21.8±1.0  20.8±0.7  MCHC(g/L)  348.0±10.2  346.0±15.7  RDW(％)  9.6±1.4  9.8±2.6  PLT(10⁹/L)  645.6±579.4  706.6±501.5  PCT(ml/L)  3.51±2.99  4.08±3.26  MPV(fL)  5.6±0.6  5.6±0.4  PDW(％)  42.1±8.5  40.9±4.7

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。

七.血生化

对照组动物攻毒后ALT、AST、CK、UREA、ALP与试验前比较显著性升高，P＜0.05。试验组动物ALP、LDH、CK与试验前比较显著性升高，P＜0.05。结果见表14～表21。

表14：试验前血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  15.6±7.1  26.2±26.8  AST(u/L)  42.2±10.3  43.8±13.3  LDH  446.8±208.5  432.0±153.3  CK  146.8±65.2  100.8±28.8  TP(g/L)  74.1±6.3  71.6±3.1  ALB(g/L)  35.3±4.6  34.1±5.0  GLU(mmol/L)  2.4±0.7  2.4±0.7  ALP(u/L)  198.0±66.5  319.0±42.5  UREA(mmol/L)  4.9±0.3  5.9±1.1  CHO(mmol/L)  2.6±0.4  2.9±0.3  TBIL(mg/dl)  0.2±0.04  0.1±0.03  CRE(μmol/L)  17.4±7.4  21.4±8.6

试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表15：攻毒3天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  37.6±14.0#  27.8±4.1  AST(u/L)  94.6±30.3##  69.4±30.7  LDH  677.0±198.7  611.4±198.1  CK  639.6±387.9#  898.8±932.4  TP(g/L)  78.0±5.2  75.0±5.0  ALB(g/L)  38.0±4.4  36.1±4.7  GLU(mmol/L)  1.8±1.0  2.5±0.4  ALP(u/L)  256.2±95.5  356.8±100.0^**  UREA(mmol/L)  5.1±1.7  5.0±0.7  CHO(mmol/L)  2.7±0.9  3.1±0.7  TBIL(mg/dl)  0.2±0.03  0.2±0.05  CRE(μmol/L)  26.2±6.8  19.4±16.2

^**表示试验组与对照组有非常显著性差异P＜0.01。#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。

表16：攻毒7天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  34.8±11.8#  32.2±13.3  AST(u/L)  50.6±10.7  45.2±6.2  LDH  685.2±162.2  642.6±116.4#  CK  164.6±97.7  245.0±64.7##  TP(g/L)  75.5±5.0  75.4±3.7  ALB(g/L)  36.6±3.0  36.9±3.9  GLU(mmol/L)  2.3±1.4  2.1±0.8  ALP(u/L)  347.8±162.6  441.0±136.0  UREA(mmol/L)  7.9±1.9##  7.7±2.6  CHO(mmol/L)  3.0±0.5  3.5±0.5  TBIL(mg/dl)  0.2±0.06  0.2±0.1  CRE(μmol/L)  22.2±7.6  25.6±9.4

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表17：攻毒11天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  35.8±22.5  70.6±86.4  AST(u/L)  47.0±8.6  52.0±9.8  LDH  550.6±138.6  600.4±220.2  CK  180.4±113.9  320.2±277.7  TP(g/L)  78.7±3.4  79.0±6.5#  ALB(g/L)  38.5±3.2  37.7±2.8  GLU(mmol/L)  3.3±0.6  2.7±0.5  ALP(u/L)  418.8±76.8##  382.8±104.9  UREA(mmol/L)  7.5±1.3##  8.0±1.8  CHO(mmol/L)  3.5±0.4##  3.4±0.6  TBIL(mg/dl)  0.2±0.05  0.2±0.04  CRE(μmol/L)  26.0±8.5  22.4±6.3

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表18：攻毒15天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  23.6±11.7  14.0±1.4  AST(u/L)  47.4±5.9  51.0±19.0  LDH  622.8±195.9  597.0±189.8  CK  171.6±95.6  148.0±95.0  TP(g/L)  63.0±5.7#  66.7±2.6#  ALB(g/L)  38.0±4.5  41.0±2.5#  GLB(g/L)  48.4±13.4##  57.8±13.4##  GLU(mmol/L)  1.7±1.1  3.0±0.9  ALP(u/L)  271.8±62.1  359.6±67.6  UREA(mmol/L)  7.7±1.8##  7.0±0.9  CHO(mmol/L)  3.0±0.6  3.1±0.2  TBIL(mg/dl)  0.2±0.02  0.2±0.03  CRE(μmol/L)  24.9±2.0  25.7±3.0

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表19：攻毒19天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  20.8±5.8  18.4±7.3  AST(u/L)  36.2±6.8  38.2±4.6  LDH  336.0±88.1  331.6±77.6  CK  213.0±79.1  218.4±207.2  TP(g/L)  67.5±4.6  67.0±3.5  ALB(g/L)  40.2±3.6  41.7±1.2#  GLB(g/L)  49.0±8.3##  59.2±13.0##  GLU(mmol/L)  2.7±0.7  3.0±1.1  ALP(u/L)  314.2±80.6#  386.4±65.0  UREA(mmol/L)  8.0±1.0##  7.8±0.9#  CHO(mmol/L)  3.4±0.4#  3.4±0.4  TBIL(mg/dl)  0.2±0.03  0.2±0.04  CRE(μmol/L)  27.3±2.9  25.3±3.9

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表20：攻毒23天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  25.0±9.4  24.0±6.5  AST(u/L)  44.2±4.1  49.6±6.4  LDH  726.8±91.7#  676.4±122.6#  CK  180.4±52.7  276.8±123.4#  TP(g/L)  63.8±6.0#  65.4±3.6#  ALB(g/L)  39.1±4.2  41.7±2.0#  GLB(g/L)  37.2±6.4##  46.4±9.3##  GLU(mmol/L)  1.9±0.6  1.6±0.7  ALP(u/L)  312.8±94.3  373.8±47.4  UREA(mmol/L)  7.4±1.9#  7.4±1.4##  CHO(mmol/L)  3.1±0.4  3.4±0.5  TBIL(mg/dl)  0.2±0.05  0.2±0.03  CRE(μmol/L)  24.6±2.8  23.7±2.6

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表21：攻毒27天血生化，n＝5

  项目  对照组  试验组  ALT(u/L)  26.8±12.4  25.6±5.0  AST(u/L)  60.6±19.2  69.4±19.3#  LDH  682.4±92.0#  754.2±137.4##  CK  828.0±874.4  1987.2±888.2##  TP(g/L)  65.7±6.1  60.6±2.7##  ALB(g/L)  42.3±2.3#  39.7±1.3#  GLB(g/L)  26.4±3.0#  26.2±10.7  GLU(mmol/L)  1.3±1.2  1.1±0.6#  ALP(u/L)  342.2±91.5#  376.2±57.6  UREA(mmol/L)  7.4±1.0##  7.7±0.6#  CHO(mmol/L)  3.0±0.5  3.3±0.6  TBIL(mg/dl)  0.3±0.1#  0.3±0.04##  CRE(μmol/L)  23.4±4.1  20.9±2.6

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05.##表示与试验前自身比较有非常显著性差异，P＜0.01。试验组与对照组比较，未见显著性改变。

八.血凝指标

攻毒后19天试验组与对照组比较，APTT显著性升高，P＜0.05；攻毒后23天试验组与对照组比较，TT显著性降低，P＜0.05；但与试验前比较，均无显著性改变。试验组APTT与攻毒前比较有显著性下降，P＜0.05。结果见表22～表29。

表22：试验前血凝指标，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  12.8±0.9  12.9±0.9  TT(s)  12.9±0.9  13.2±1.0  Fib(s)  16.2±5.9  10.4±2.3  aPTT(s)  21.0±1.9  24.9±3.2^*

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05；^**表示试验组与对照组有非常显著性差异P＜0.01。

表23：攻毒3天血凝指标，n＝5

 项目  对照组  试验组 PT(s)  11.9±1.6  12.1±0.2 TT(s)  12.3±1.5  12.6±0.8 Fib(s)  19.2±18.7  10.5±2.2 aPTT(s)  20.2±2.3  23.1±1.9

试验组与对照组比较，未见显著性改变。

表24：攻毒7天血凝指标，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  12.8±0.7^*  11.4±0.8^*#  TT(s)  11.8±0.6  12.0±1.0  Fib(s)  11.1±1.9  9.4±1.1  aPTT(s)  19.0±1.7  20.0±0.7##

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05；#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示有非常显著性差异P＜0.01。

表25：攻毒11天血凝指标，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  12.1±1.2  11.6±0.6#  TT(s)  12.2±0.5  11.9±0.5  Fib(s)  15.2±9.6  10.5±0.8  aPTT(s)  17.7±1.5#  19.2±1.2##

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示有非常显著性差异P＜0.01。

表26：攻毒15天血凝指标，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  12.0±0.4  11.4±0.6#  TT(s)  14.4±1.6  13.3±1.0  Fib(s)  15.1±9.6  11.0±2.5  aPTT(s)  18.8±1.3  19.2±0.7##

#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。##表示有非常显著性差异P＜0.01。

表27：攻毒19天血凝指标，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  12.9±0.5  12.0±0.6^*  TT(s)  13.1±0.7  12.3±0.8  Fib(s)  12.3±1.2  11.4±1.7  aPTT(s)  21.5±0.7  23.6±0.9^*

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05；

表28：攻毒23天血凝指标，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  12.6±1.7  12.6±1.0  TT(s)  14.1±1.1  12.6±0.4^*  Fib(s)  14.8±2.1  15.6±4.7  aPTT(s)  20.4±0.6  20.9±2.0#

^*表示试验组动物明显低于对照组动物，且经t检验，与对照组有显著性差异，P＜0.05；#表示与试验前自身比较有显著性差异，P＜0.05。

表29：攻毒27天血凝，n＝5

  项目  对照组  试验组  PT(s)  13.4±0.9  13.1±0.2  TT(s)  14.0±0.7  13.6±1.1  Fib(s)  15.0±1.5  13.2±2.5  aPTT(s)  20.5±1.0  20.2±0.8

试验组与对照组比较，未见显著性改变。

九.脏器系数

表30：脏器系数结果，n＝5

  项目  对照组  试验组  体重  3.660±0.677  3.840±0.677  心脏  0.494±0.050  0.496±0.190  肝脏  2.097±0.149  1.764±0.711  脾脏  0.097±0.016  0.118±0.076  肺脏  0.725±0.157  0.692±0.196  肾脏  0.452±0.023  0.435±0.148  脑  2.475±0.462  2.217±0.782  膀胱  0.096±0.069  0.131±0.082  肾上腺  0.031±0.005  0.033±0.012  胸腺  0.053±0.022  0.078±0.054  胰腺  0.154±0.028  0.207±0.231  睾丸  0.094±0.012  0.137±0.126  子宫  0.062±0.033  0.110±0.124

试验组与对照组比较，未见显著性改变。

十.大体解剖

对照组：全部动物肺脏为灰白色，有大面积出血，其中2只动物肺脏与胸壁有粘连。

试验组：动物肺脏为灰粉色，4只动物肺脏有少量出血，其中1只动物肺脏与胸壁有粘连。

十一.组织病理

对照组恒河猴#0401、#0402有肺间质性炎，其中#0402病变范围较#0401广，表现为以肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润为主要特征的肺部病变，病变较单一；其它各受检脏器均未见明显异常。

试验组恒河猴#0407、#0410肺组织形态基本正常，#0408、#0409有肺间质性炎，表现为以肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润为主要特征的肺部病变，病变较单一，#0409增厚的肺间隔有局灶相互融合，#0408、#0409肺部病变与对照组的病变表现一致，而病变累及范围较模型组小；其它各受检脏器均未见明显异常。

见图12-17。

病理结果显示对照组恒河猴2例动物肺病理变化显示肺间质性炎改变，说明模型成立。受试物干扰素α2b可使试验组动物的病变范围减少或不发病。

研究结论如下：

1.PCR检测、病毒分离结果表明：实施例1喷雾剂可以有效阻断SARS-CoV病毒对恒河猴的呼吸道感染。

2.中和抗体和IgG检测结果表明：实施例1喷雾剂能有效抑制了病毒的感染和复制，导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的水平降低，对照组动物由于没有干扰素保护，病毒感染机体后，在体内大量复制，诱导产生高滴度的中和抗体和IgG抗体，证实病毒感染。

3.血常规、血生化和血凝指标结果表明试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变，证明重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂对恒河猴无不良反应。

4.病理结果显示对照组恒河猴2例动物肺病理变化显示肺间质性炎改变，与建立SARS动物模型时的结果一致，说明模型成立。受试物干扰素-α2b可使试验组动物的病变范围减少或不发病。

本实验例的主要数据见图18-20。

猴体试验结果表明，本发明鼻腔喷雾剂预防和治疗恒河猴SARS冠状病毒感染的效果是明显的。

                                                实验例6

本发明喷雾剂预防SARS及其它呼吸道病毒感染的流行病学效果评价研究

经过SFDA批准，并由科技部SARS公关组立项委托广州第一军医大学流行病教研室由俞守义教授负责承担观察和验证本发明喷雾剂预防SARS病毒感染的安全性和流行病学效果评价研究。采用实验流行病学的方法，总观察对象为15,611人；为分两个阶段开展评价研究。第一阶段在2003年5-6月期间进行，在高危人群中采用多中心、整群抽样和分组同期平行的方法进行实验，对照为空白对照。第二阶段在2003年12月-2004年2月进行，在人群中采用双盲、安慰剂对照和随机分组的方法进行实验。在预防SARS病毒感染的流行病学效果评价研究的同时，经SFDA批准，还对几种常见呼吸道病毒感染的预防效果同时进行了流行病学预防效果的观察。

2003年5月下旬至6月中旬在6个现场同时铺开工作，研究对象共14391人，分布于六个省(直辖市市)21个单位。其中8881人为用药组，5510人为对照组(空白对照)，收集调查表13254份，脱落1137人，完成研究应答率92.1％，共采血约6892人份(双份血清)。

2003年12月～2004年2月又选择对SARS易感、随访观察研究对象共1220人，其中实验组545人，对照组675人。共采血约共271人份(双份血清)。

1、本发明喷雾剂(实施例1)的安全性

共观察14472人。实验组用药的第二天，观察到一些较轻的流感样不良反应，发生的高峰在第三天(个别在第二天或第四天)但所有症状均为可逆性反应，停药后消失。未见有其它严重不良反应的发生。

用药组出现的常见不良反应有：头痛、头晕、乏力、肌肉酸痛、咽干、咽痛、等，但主要出现在用药的前3天；不良反应在停药后显著下降，其发生率甚至显著低于对照组。在观察期间始终未发现在接受干扰素喷雾剂的人员中出现有血涕副反应。

2、对SARS发病的保护效果观察

(1)两个阶段两组观察人群均没有发生SARS病例，故未能评价本药物对SARS发病的直接保护效果。

(2)对SARS病毒感染的保护率

抽取了接触SARS病人机会相等的1,730人的双份血清，其中试验组930人；对照组800人，同时间内进行SARS病毒IgG抗体检测，结果表明试验组的总抗体阳性率为2.15％，对照组为3.50％，对照组较试验组高，但未达到统计学的显著性要求(p＞0.05)。另一方面，在当时SARS流行的特定情况下，研究组无法保证对照组人员不私下使用其它免疫制剂、干扰素或其它的抗病毒药物。

实施例1喷雾剂对SARS接触者的预防感染效果(1,730例)(SARS-CoV-IgG抗体阳性率)见图21。

待检的双份血清同时采用SARS-CoV-IgG抗体ELISA试剂盒进行筛检，筛检阳性者再重做一次，两次阳性者则确定为阳性。试剂盒采用北京华大吉比爱生物技术有限公司生产的“冠状病毒IgG抗体检测试剂盒”。方法按使用说明书进行。

(3)病人和接触者使用干扰素的回顾性调查结果

对2003年1月份以来在广州军队医院住院的SARS确诊病人149人以及疑似病人14人进行了流行病学回顾性调查表明，所有上述病例在发病前10天均未用过任何干扰素制剂。而这些医院接触SARS的医务人员中，使用自制的α干扰素或其他干扰素滴鼻液者共1020人，无一人发生SARS、疑似SARS和流感病例。

以上结果说明实施例1喷雾剂预防SARS病毒感染的可行性是明显的。

3、对呼吸道其它病毒感染的保护效果观察

在两个阶段的安全性试验中，尽管在用药期间实验组观察到出现咽干等症状较对照组高，但停药后有关症状消减。用药5天后停药继续观察5天，对照组的上呼吸道症状反而显著高于服药组，就已经提示本药物可能对一般上呼吸病毒道感染有一定的预防作用。为此，对2003年5月～6月和2003年12月～2月进行了两次系统的人群实验，抽取了部分人群的血清以检测常见呼吸道病毒感染情况。我们重点以1-3型副流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒(3，7型)等常见的呼吸道病毒感染为观察指标来评价本药物对病毒性呼吸道感染的保护作用。

待检血清采用酶联免疫吸附法(ELISA)对副流感病毒(1、2、3型混合)、腺病毒(3、7型)、呼吸道合胞病毒和B型流感病毒IgM抗体进行筛检，筛检阳性者再重做一次，两次阳性者则确定为阳性。试剂盒采用深圳赛尔生物技术有限公司生产的“呼吸道感染病毒IgM/抗体EIA试剂盒(96T/48T)”。方法按使用说明书进行。

第一阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(927人)见下表：

  病毒抗体        实验组          对照组  P  样本量  阳性率(％)  样本量  阳性率(％)  副流感病毒  465  6.45  462  19.48  ＜0.01  B型流感病毒  376  4.53  375  13.6  ＜0.05  呼吸道合胞病毒  465  4.30  462  7.14  ＝0.05  腺病毒  465  24.73  463  29.15  ＞0.05

第一阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(927人)见图22。

第二阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(558人)见下表：

  病毒抗体        实验组           对照组  P  样本量  阳性率(％)  样本量  阳性率(％)  副流感病毒  279  3.23  279  26.88  ＜0.01  B型流感病毒  188  3.70  162  14.9  ＜0.05  呼吸道合胞病毒  279  3.22  279  4.30  ＞0.05  腺病毒  279  28.04  279  32.26  ＞0.05

第二阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(558人)见图23。

第一、二阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(1485人)见图24。

以上结果表明，在第一阶段927例双份血清试验中，试验组的副流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的IgM阳性率显著低于对照组，P值分别为＜0.01，＝0.05和＜0.05。在第二阶段558例双份血清试验中，试验组的副流感病毒、B型流感病毒的IgM阳性率也显著低于对照组，P值分别为＜0.01和＜0.05。这说明本发明喷雾剂对副流感病毒1-3型、乙型流感病毒等常见呼吸道病毒感染有一定预防效果。

以上副流感病毒和B型流感病毒均为儿童和成年人呼吸道感染的常见病原；而呼吸道合胞病毒和3，7型腺病毒为儿童时期的呼吸道感染的常见病原。

这一情况与上述以成人为对象的研究结果是吻合的。详细资料如下：

2003年3月我国突发SARS流行，国家食品药品监督管理局(SFDA)于同年4月同意批准北京远策药业有限责任公司生产的本发明喷雾剂开展预防SARS病毒感染的流行病学效果评价研究。为了观察和验证实施例1喷雾剂预防SARS病毒感染的安全性和预防效果，我们采用实验流行病学的方法，总观察对象为15,611人：为分二个阶段开展评价研究。第一阶段在2003年5-6月期间进行，在高危人群中采用多中心、整群抽样和分组同期平行的方法进行实验，对照为空白对照。第二阶段在2003年12月-2004年2月进行，在人群中采用双盲、安慰剂对照和随机分组的方法进行实验。在预防SARS病毒感染的流行病学效果评价研究的同时，经SFDA批准，还对几种常见呼吸道病毒感染的预防效果同时进行了流行病学预防效果的观察，评估研究结果如下：

第一部分 实验现场、人群和方法

第一阶段现场工作(准实验研究)：

研究开始时正值我国2003年SARS流行的中、后期，按照临床试验的要求和规范以及当时SARS流行的严重性和特殊性以及SARS预防的实际情况(国家要求零病例措施！)开展研究，因此不可能采用评估新药效果应当采用的随机、双盲、安慰剂对照方法，只能采用准实验研究(非双盲、非随机分组对照)方法进行效果评估。

现场：河南、北京、天津、河北、内蒙和广东六省市。

研究对象入选标准：SARS发生较多地区的重点人群，能够理解并能按要求用药和填写调查表的成年人，知情同意，自愿参加。

研究对象排除标准：疑似或确诊的SARS病人，有干扰素过敏史的人，患有肿瘤、糖尿病、慢性肝炎等免疫力低下的病人，孕妇及哺乳期妇女。

剔除标准：

对已被选入本临床研究，属于以下情况之一者，作为剔除对象。

1.不符合纳入标准，或符合排除标准者

2.一次药未用者

3.无任何记录者

脱落(退出)标准：

对已被选入本临床研究，属于以下情况之一者，作为脱落者。

1.受试者依从性差，不能按时按量用药。

2.受试者不愿意继续进行临床试验，向研究者提出退出者。

用药方法：

1.药物名称和规格：

名称：本发明实施例1喷雾剂

研制单位：北京远第药业有限责任公司

规格：3.65×300万IU/ml，每喷一下0.1ml

保存：2～8℃避光保存

2.用量和方法：

每天喷两次，每次分别喷左右鼻腔、咽喉各一下(即60万IU/天)，连用五天(共1000万IU)。

观察内容和方法：

1.调查内容：调查表内容包括一般情况(姓名、年龄、性别、喷药前两周及喷药期间服用药物情况等)和使用干扰素喷雾剂后常见的不良反应(体温、咳嗽、咳痰、头痛、头晕、乏力、肌肉酸痛、鼻塞、打喷嚏、咽痛、咽干、腹泻、腹痛和皮疹等)。

方法：给每个实验对象发调查表，由其从试验的第一天开始每晚自填研究开始后十天的反应。

2.干扰素喷雾剂应用情况：

学校和战士：研究开始后，对实验组发放调查表和干扰素喷雾剂，以学员队为单位统一管理。每天中午12:30和下午19:00由班长发放干扰素喷雾剂，学员按照说明书使用，喷完后由班长统一收集，放回队部配有的专用冰箱中进行保存。

医院、宾馆和其他人群：干扰素发给每个实验对象，由其自己保存(存放于单位或家中的冰箱里)，每天中午和晚上使用。

对照组人群每天晚上填表，但不用干扰素喷雾剂。

3.观察项目和时间

观察项目：不良反应、SARS发病情况、SARS感染情况(SARS病毒IgG抗体阳性为标准)和影响实验结果的其他干扰因素。

观察时间：10天，前5天用药，停药后继续观察至第十天。

4.血清采集：

研究开始时对实验组和对照组所有人员抽血，当天分离出血清保存于4℃冰箱内，20天后抽第二次血，分离血清，双份血清均在-20℃保存。

血清学检测：

1.血清抗SARS-CoV-IgG抗体的检测

待检的双份血清同时采用SARS-CoV-IgG抗体ELISA试剂盒进行筛检，筛检阳性者再重做一次，两次阳性者则确定为阳性。

试剂盒采用北京华大吉比爱生物技术有限公司生产的“冠状病毒IgG抗体检测试剂盒”。方法按使用说明书进行。

(2)呼吸道病毒血清IgM抗体的检测

待检血清采用酶联免疫吸附法(ELISA)对副流感病毒(1、2、3型混合)、腺病毒(3、7型)、呼吸道合胞病毒和B型流感病毒IgM抗体进行筛检，筛检阳性者再重做一次，两次阳性者则确定为阳性。

试剂盒采用深圳赛尔生物技术有限公司生产的“呼吸道感染病毒IgM/抗体EIA试剂盒(96T/48T)”。方法按使用说明书进行。

安全性评价：

对用药期间出现的所有不良反应和不良事件均进行记录和分析。

预防效果评价：

对两组人群SARS发病情况进行比较，对接触SARS的高危人群(医务人员)用药前后的血清进行检测，分析SARS病毒IgG抗体阳性率的变化情况。同时观察对常见呼吸道病毒血清IgM抗体的变化情况。

统计分析：

本研究的数据处理和分析工作由暨南大学经济管理学院负责进行，用Epidata2.1软件建立数据库，所有调查表均由专人负责录入、检查错误和整理。由专人用SPSS10.0进行数据的统计分析。

质量控制：

(1)统一方法

(2)开展研究前对研究人员集中进行培训

(3)研究开始前在参试人员中开设讲座，说明重组人干扰素α-2b喷雾剂的作用、可能的不良反应、使用方法和调查表的内容及填写方式。

(4)研究期间派专人对各个现场进行监察访问，保证各现场按照研究计划进行。

(5)随访期间每天由专人督促服药和填表，确保漏服率＜5％，失访率＜10％。

2003年5月下旬至6月中旬在6个现场同时铺开工作，研究对象共14391人，分布于六个省(直辖市市)21个单位。其中8881人为用药组，5510人为对照组(空白对照)，收集调查表13254份，脱落1137人，完成研究应答率92.1％，共采血约6892人份(双份血清)。

第二阶段现场工作(双盲、安慰剂对照随机试验)；

2003年12月～2004年2月进行，选择对SARS易感、便于随访观察研究对象共1220人，其中实验组545人，对照组675人。

研究人群1：广州省军区教导大队新兵连，研究对象共221人，其中实验组111人，安慰剂组110人。血清共221人份。

研究人群2：珠海警备区新兵团，研究对象共549人，实验组234人，安慰剂组315人。血清两组共回收50人份。

研究人群3：广州市槎头野生动物市场从业人员，研究对象450人，实验组200人，对照组250人。

采用完全随机方法分组，双盲实验，对照组采用外形与药物完全相同但不含药物成分的安慰剂。

除了随机分组、双盲和安慰剂对照外，研究方法如研究对象的纳入和排除标准、服药和随访方法、评价指标和方法、资料分析和统计方法、质量控制方法均同第一阶段实验。

本阶段研究对象1220人中，脱落仅2人，完成研究应答率为99.99％。

两阶段研究合计脱落1139人，脱落率合计为7.3％。

第二部分 研究结果

1、研究对象脱落情况

本研究中，两阶段段研究合计有7.3％的研究对象脱落，其中第一阶段脱落率为7.9％，第二阶段仅为0.16％。对第一阶段广州点实验组105名脱落研究对象进行了调查，脱落的原因构成如下表：

  原因  人数  百分比(％)  忘记用药或外出未能用药  88  83.8  不想用药  12  11.4  用药后不感到不适  5  4.8  合计  105  100.0

调查表明因用药后感到不适而停止用药的人仅占很小的比例。

2、本发明喷雾剂的安全性

实验组用药的第二天，观察到一些较轻的流感样不良反应，发生的高峰在第三天(个别在第二天或第四天)但所有症状均为可逆性反应，停药后消失。未见有其它严重不良反应的发生，见下表：

  不良反应  用药组发生率(％)  对照组发生率(％)  P  两组发生率之差  发热^※  2.09  1.21  ＜0.01  0.88  头痛  6.67  3.92  ＜0.01  2.75  头晕  11.08  4.42  ＜0.01  6.66  乏力  14.32  7.19  ＜0.01  7.13  肌肉酸痛  6.69  4.45  ＜0.05  2.24  咽干  15.08  7.07  ＜0.01  8.01  咽痛^※  8.38  4.95  ＜0.01  3.43  鼻塞^※  8.59  7.77  ＞0.05  0.82  打喷嚏^※※  12.78  10.56  ＜0.05  2.22  咳嗽  4.94  4.26  ＞0.05  0.68  咳痰  4.52  4.01  ＞0.05  0.51  腹痛  5.04  1.98  ＜0.01  3.06  腹泻  5.18  2.47  ＜0.01  2.71  皮疹  0.95  1.13  ＞0.05  -0.18

两阶段用药组和对照组随访第3天(或发生率最高的时间)不良反应发生率比较(14472人)

^※第2天

^※※第4天

第一阶段实验时，与对照组比较，用药组体温未见异常；用药期间用药组出现的不良反应如头痛、头晕、乏力、肌肉酸痛、咽干、咽痛、腹痛、腹泻等的发生率虽然高于对照组，但主要出现在用药的前3天，见下表：

  不良反应  用药组发生率(％)  对照组发生率(％)  P  两组发生率之差  发热^※  2.29  1.14  ＜0.01  1.15  头痛  7.09  4.10  ＜0.01  2.99  头晕  11.63  4.38  ＜0.01  7.25  乏力  15.06  7.46  ＜0.01  7.60  肌肉酸痛  7.09  4.70  ＜0.05  2.39  咽干  15.82  7.43  ＜0.01  10.84  咽痛^※  8.72  4.98  ＜0.01  3.74  鼻塞^※  8.87  7.95  ＞0.05  0.92  打喷嚏^※※  13.38  11.07  ＜0.05  2.31  咳嗽  5.10  4.10  ＞0.05  1.00  咳痰  4.57  3.96  ＞0.05  0.61  腹痛  5.50  2.17  ＜0.01  3.33  腹泻  5.66  2.70  ＜0.01  2.96  皮疹  1.04  1.23  ＞0.05  -0.19

第一阶段实验随访第3天时(或发生率最高的时间)两组不良反应发生率比较(13,254人)

^※第2天         ^※※第4天

不良反应在停药后显著下降，其发生率甚至显著低于对照组。在观察期间始终未发现在接受干扰素喷雾剂的人员中出现有血涕副反应。

第二阶段用药期间，与对照组比较，用药组体温也未见异常，对照组体温异常率反而高于用药组；用药期间用药组的不良反应只有乏力和咽干显著高于对照组(率差分别为2.12％和3.87％，见下表：

  不良反应  用药组发生率(％)  对照组发生率(％)  P  两组发生率之差  发热^※  0  2.00  ＜0.01  -2.00  头痛  2.00  2.10  ＞0.05  -0.10  头晕  5.14  4.89  ＞0.05  0.25  乏力  6.33  4.21  ＜0.05  2.12  肌肉酸痛  2.34  1.70  ＞0.05  0.64  咽干  7.02  3.15  ＜0.05  3.87  咽痛  4.67  4.65  ＞0.05  0.02  鼻塞  5.58  5.94  ＞0.05  -0.36  打喷嚏  6.24  5.09  ＞0.05  1.15  咳嗽  3.19  6.10  ＜0.05  -2.91  咳痰  3.96  4.57  ＞0.05  -0.61  腹痛  0  0  腹泻  0  0  皮疹  0  0

第二阶段实验随访第3天时两组不良反应发生率比较(1218人)。

与第一阶段实验相同，不良反应主要出现在用药的前3天，停药后显著下降，其发生率甚至显著低于对照组。

与第一阶段一样，在观察期间始终未发现在接受干扰素喷雾剂的人员中出现有血涕副反应。

上述第一、二阶段现场安全性研究结果表明：重组人干扰素α-2b喷雾剂(远策素喷雾剂)的安全性是良好的，使用者是可以耐受的。始终未发现在接受干扰素喷雾剂的人员中出现有血涕副反应。

2、对SARS发病的保护效果观察

(1)对SARS发病的保护率

两个阶段两组观察人群均没有发生SARS病例，故未能评价本药物对SARS发病的保护效果。

(2)对SARS病毒感染的保护率

抽取了接触SARS病人机会相等的1,730人的双份血清，其中试验组930人；对照组800人，同时间内进行SARS病毒IgG抗体检测，结果表明试验组的总抗体阳性率为2.15％，对照组为3.50％，对照组较试验组高，但未达到统计学的显著性要求(p＞0.05)。另一方面，在当时SARS流行的特定情况下，研究组无法保证对照组人员不私下使用其它免疫制剂、干扰素或其它的抗病毒药物。

(3)病人和接触者使用干扰素调查情况

对2003年1月份以来在广州军队医院住院的SARS确诊病人149人以及疑似病人14人进行了流行病学调查表明，所有上述病例在发病前10天均未用过任何干扰素制剂。而这些医院接触SARS的医务人员中，使用自制的α干扰素或其他干扰素滴鼻液者共1020人，无一人发生SARS、疑似SARS和流感。

根据以上结果，可以认为，重组人干扰素α-2b喷雾剂(远策素喷雾剂)可能对SARS病毒感染有保护作用。

3、对呼吸道其它病毒感染的保护效果观察

(1)两个阶段的实验均表明，尽管在用药期间实验组出现咽干等症状较对照组高，但停药后有关症状消减。用药5天后停药继续观察5天，对照组的上呼吸道症状反而显著高于服药组，提示本药物可能对一般上呼吸病毒道感染有一定的预防作用。

(2)对2003年5月～6月和2003年12月～2月两次的人群实验，抽取了部分人群的血清以检测常见呼吸道病毒感染情况。。我们重点以1-3型副流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒(3，7型)等常见的呼吸道病毒感染为观察指标来评价本药物对病毒性呼吸道感染的保护作用。

第一阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(927人)见下表：

  病毒抗体         实验组           对照组  P  样本量  阳性率(％)  样本量  阳性率(％)  副流感病毒  465  6.45  462  19.48  ＜0.01  呼吸道合胞病毒  465  4.30  462  7.14  ＝0.05  腺病毒  465  24.73  463  29.15  ＞0.05  B型流感病毒  376  4.53  375  13.6  ＜0.05

第二阶段实验两组血清三种呼吸道病毒IgM检测情况(558人)见下表：

  病毒抗体        实验组          对照组  P  样本量  阳性率(％)  样本量  阳性率(％)  副流感病毒  279  3.23  279  26.88  ＜0.01  呼吸道合胞病毒  279  3.22  279  4.30  ＞0.05  腺病毒  279  28.04  279  32.26  ＞0.05  B型流感病毒  188  3.70  162  14.9  ＜0.05

以上结果表明，在第一阶段927例双份血清试验中，试验组的副流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的IgM阳性率显著低于对照组，P值分别为＜0.01，＝0.05和＜0.05。在第二阶段558例双份血清试验中，试验组的副流感病毒、B型流感病毒的IgM阳性率也显著低于对照组，P值分别为＜0.01和＜0.05。

这说明本发明喷雾剂对常见呼吸道病毒感染有一定预防效果。

以上副流感病毒和B型流感病毒均为儿童和成年人呼吸道感染的常见病原；而呼吸道合胞病毒和3，7型腺病毒为儿童时期的呼吸道感染的常见病原。这一情况与上述结果也是吻合的。

                                       实验例7

本发明喷雾剂预防SARS及其它呼吸道病毒感染的人体安全性

2003年4月24日SFDA批准重组人干扰素a2b喷雾剂进行预防SARS的临床研究，主要由由广州第一军医大学负责，评估远策素喷雾剂预防SARS及其它呼吸道病毒感染的效果和安全性；与此同时，北京远策药业有限责任公司也组织力量，就药物的安全性和效果进行临床研究。远策药业已发放约10万瓶，用于下列人群：

1.北京地区专收SARS病人的医院的一、二线人员：包括中日友好医院；中国医学科学院整形医院；

2.宁夏疾病预防和控制中心的一、二线人员；

3.内蒙古呼而浩特一线人员；(广州俞守义教授提供，用以对比)

4.华南某高校一线人员；(广州俞守义教授提供，用以对比)

5.北京SARS高流行区的重点人群；

6.2004年4月病毒所实验室SARS病毒泄露的一、二线人员。

获得如下结论：

(1)连续使用1-2瓶无严重副反应，使用者主诉有鼻、咽干燥、打喷嚏、鼻塞、乏力、头晕等副反应，基本上与广州研究组的结果一致，实施例1喷雾剂是安全的，未发现有血涕副反应。

在SARS流行期间使用实施例1喷雾剂的副反应见下表统计：

  人群性质  观察人数  无任何不良反  应百分比％  因不良反应而  停药的人数  1.一线(内蒙呼和浩特)(2)^*(患者自写)  479  53.44  4  2.一线(华南某高校)(2)^*(患者自写)  2610  39.20  0  3.一线(宁夏CDC)(2)(有医务人员的详  细调查表)  142  73.94  0  4.二线(医科院、宁夏CDC)(1)(有医务  人员的详细调查表)  167  85.63  0  5.一线(中日友好医院(1)(单位报告，盖  章)  1080  100  6.二线(中日友好医院)(1)(单位报告，  盖章)  920  100  7.一般人群(北京)(3)(单位报告，盖章)  12580  97.54  0  8.一般人群(北京)(1)(电话调查)  74226  100  0  9.泄露SARS病毒的研究所  400  100  0  总计  92604人  97.49％  4

注：一线：直接接触SARS病人：二线：间接接触SARS患者；一般人群：SARS流行区流行期间的人群。

(1)使用1瓶喷雾剂；(2)使用2瓶喷雾剂；(3)每人1-3瓶(47人：使用3瓶，3610人使用2瓶，其余使用1瓶)。

^*数据来源于广州俞教授，用以对比。

(2)回顾性流行病学调查表明，凡接受用药的人群未发现发烧病例、疑似病例或可能病例。

(3)2004年4月病毒所发现实验室泄露SARS病毒后，全所所有人员约400人(隔离前和隔离后)使用了2瓶实施例1喷雾剂，在用药后18天后检测受试者的血清SARS病毒IgG抗体和IgM抗体均未发现阳性者；也未发现有SARS可能病例。

                                            实验例8

本发明喷雾剂干预麻疹、风疹和腮腺炎病毒减毒活疫苗鼻腔接种后的免疫效果的初步研究(江苏省疾病预防和控制中心(JS-CDC)。

2004年初经过SFDA批准由江苏省疾病预防和控制中心承担初步探讨重组人干扰素a2b干预麻疹、风疹和腮腺炎病毒减毒活疫苗(原为注射用)鼻腔接种后免疫效果的干预作用，以期间接说明重组人干扰素a2b预防麻疹、风疹和腮腺炎病毒感染有无预防效果。

在江苏省CDC的组织下，选择计划免疫较差的地区，麻疹抗体水平低于800者约100余人，参加研究。

使用的疫苗为麻疹、风疹减毒活疫苗，由北京生物制品研究所产品。麻风腮三联减毒活疫苗由法国Aventis Pastuer公司生产，均使用注射的同样剂量，但改为滴鼻接种。

随机分为对照组和干扰素组.干扰素组使用实施例1喷雾剂(3.65ml：1095MIU)。对照药使用不含重组人干扰素α2b，但含其它成份的喷雾剂。

干扰素组在疫苗接种前2天，开始喷干扰素，连续用药10天；第三天进行疫苗接种。每日喷2次，每次每个鼻孔各喷一下、咽喉一下，每喷一下为0.1ml。

在活疫苗接种后第3天取咽拭子测定干扰素组和对照组人群病毒基因的拷贝数；在疫苗接种后21天、28天各采取三份血清，以备检测抗体水平之用。

1.应用实时定量PCR技术评估本发明喷雾剂在人群中对麻疹病毒减毒活疫苗的干预作用

对照组共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子标本共7份，4份检测为阳性；阳性率为57.1％；干扰素组也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子标本共7份，3份标本检测结果阳性，阳性率为42.9％。由于样本数量小，无统计学意义。但是，在病毒基因阳性标本中，两组病毒基因的拷贝数的比较却有明显的差别，见图25和下表：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的麻疹病毒基因拷贝数的比较：

  样品编号  Copies/reaction  对照组  314-2  67300  483-2  132000  493-2  77700  干扰素组  18-2  23000  21-2  32800  22-2  7800

上述有限样本初步说明，干扰素组麻疹病毒基因拷贝数比对照组的病毒基因拷贝数要低4.4倍，可以初步看出人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上可以抑制麻疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。

接种风疹疫苗的对照组共有22人，其中男5人、女17人，平均年龄19.4岁，疫苗鼻腔免疫后72小时每人采集咽拭子标本共22份，仅3份检测为阳性；干扰素组共有8人，全为女性，平均年龄为21.4岁，疫苗鼻腔免疫后72小时每人采集咽拭子标本共8份，仅2份检测为阳性。两组阳性标本中病毒基因拷贝数的比较见图26和下表：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的风疹病毒基因拷贝数的比较

  样品编号  Copies/reaction  疫苗组  403-2  110238  484-2  162857  428-2  195000  干扰素组  465-2  5070  467-2  4000

从上表和图26中，可以发现干扰素组病毒拷贝数比对照组的要低两个数量级，初步说明人重组干扰素a2b在一定程度上是可以抑制风疹病毒的繁殖。

2.重组人干扰素a2b喷雾剂在人群中对风疹、麻疹和腮腺炎减毒活疫苗鼻腔接种后免疫效果的干预作用

(1)实施例1喷雾剂干预麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

ELISA测定结果见下表：干扰素喷雾剂干预麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

  组别  免前与免后21天平均P/N值的  差数  免前与免后28天平均P/N值  的差数  对照组(4)  1.34  3.58  干扰素组(6)  0.08  0.62  干扰素干预效果(组差)  1.26  2.96  显著性测定  P＝0.025  P＝0.068

比较免前与免后21天和28天平均P/N值的差数，两组有显著差异，从有限样本来说，初步表明实施例1喷雾剂能干预麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后加腔免疫的免疫反应。

(2)实施例1喷雾剂干预风疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

风疹病毒血凝抑制反应测定结果见下表：干扰素喷雾剂干预风疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

  组别  免前与免后21天血清血凝抑  制滴度平均增加倍数  免前与免后28天血清血凝抑  制滴度平均增加倍数  对照组(4)  2.28(20)  2.03(20)  干扰素组(6)  1.33(6)  1.66(6)  干扰素干预效果(组差)  0.95  0.37

比较免前与免后21天和28天血清风疹病毒血凝抑制滴度平均增加倍数，两组有差异，从有限样本来说，初步表明干扰素鼻腔喷雾在一定程度上干预风疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后加腔免疫的免疫反应。

(3)重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂干预风风腮三联病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

风疹血凝抑制反应测定结果见表5.比较免前与免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍数，两组有差异，但是28天结果无差别；腮腺炎血凝抑制反应测定结果见下表：干扰素喷雾剂干预麻风腮病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

  组别  免前与免后21天血清血凝抑  制滴度平均增加倍数  免前与免后28天血清血凝  抑制滴度平均增加倍数  风疹病毒/对照组  2.36(25)  1.3(15)  风疹病毒/干扰素组(4)  1.75(16)  1.3(6)  干扰素干预效果(组差)  0.61  0  腮腺炎病毒/对照组(28)  1.28(18)  1.64(11)  腮腺炎病毒/干扰素组(6)  1.28(7)  1.50(6)  干扰素干预效果(组差)  0  0.14

比较免前与免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍数，两组无差异，但是28天结果有轻微差别；从有限样本来说，初步表明干扰素鼻腔喷雾干预麻风腮三联疫苗鼻腔接种加腔免疫的免疫反应不如单价疫苗明显。

3.研究结论及分析

1.有限样本数的初步结果表明，使用干扰素喷雾剂组的风疹病毒和麻疹病毒阳性标本中病毒基因拷贝数均比对照组要低，麻疹组低4.4倍，风疹组低两个数量级。因此可见，人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上可以抑制麻疹病毒和风疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。但是，在麻疹和风疹的对照组和干扰素组中，在病毒活疫苗接种后第3天采取的咽拭子样本中，病毒检出阳性率均太低：麻疹喷雾免疫组的对照组病毒阳性率仅为57.1％；干扰素组的阳性率仅为42.9％；风疹喷雾免疫组的病毒阳性率更低；可能的原因是所选择的对象均曾经感染过麻疹和风疹，均不是初次免疫，上呼吸道已经有低水平抗体存在，这些低水平的特异性抗体可以掩盖干扰素非特异性抗病毒活性，所以，病毒攻击后的病毒检出率太低。

2.由于选择的人群是麻疹抗体低水平人群，虽然样本小，但已经可以看到重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂对麻疹减毒活疫苗鼻腔接种后的再次免疫效果确有一定的干预作用，在免疫后第21天，干扰素组与对照组的平均P/N值的差异有显著诧异(P＝0.025)；这与病毒基因拷贝数的减少是相吻合的。

3.麻疹和风疹减毒活疫苗原为注射免疫接种，现在改为鼻腔喷雾接种，这次研究虽然没有同时比较注射免疫与鼻腔免疫的效果，但是，从有限的初步的结果来看，鼻腔喷雾1次加强免疫后，血清抗体水平平均增加2.28(血凝抑制抗体)-3.58倍(ELISA)，这说明进行鼻腔喷雾加强免疫有一定作用。但是麻风腮三联疫苗鼻腔接种的效果不明显，可能的原因是，麻风腮三种病毒在上呼吸道同时繁殖相互有干扰作用。

4.鉴于很难选择麻疹低抗体人群；关于选择风疹低抗体人群，因无试剂无法选择。所以，这一技术路线拟不再继续，改为在双盲、随机的人群中使用干扰素喷雾剂和不含干扰素的喷雾剂，在一定期间内检测呼吸道病毒IgM抗体差异的方法来评估干扰素喷雾剂的抗病毒效果。

                                             实验例9

本实验例初步探讨本发明喷雾剂干预麻疹、风疹和腮腺炎病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫效果的作用，间接说明重组人干扰素a2b喷雾剂预防麻疹、风疹和腮腺炎病毒感染的效果。

目标：

1.验证原为皮下注射的风疹和麻疹减毒活疫苗改为鼻腔接种的毒副反应；

2.检验该地区上述人群对接种该病毒疫苗的血清抗体的本底情况和鼻腔接种加强免疫后的反应性；

3.初步探讨干扰素喷雾剂干预病毒减毒活疫苗的作用。

地区选择：

江苏省计划免疫较差的地区。

人群的入选标准：

(1)年龄：20-25岁，男女不限；

(2)非过敏体质的健康人；

(3)无慢性呼吸道疾病；

(4)体温正常；

(5)选择麻疹抗体水平低于800者。

人群排除标准

(1)对干扰素和疫苗中任何成份有过敏史者；(2)慢性呼吸道疾病患者，鼻咽部黏膜有病理改变者；

(3)妊娠期或哺乳期妇女；或在近几个月内有可能怀孕的妇女；

(4)患有心、肾等重要脏器严重器质性疾患；

(5)患有血液病、糖尿病等疾病；

(6)患有严重的神经、精神病、癫痫病史者；

(7)入组前3个月内参加过其他临床试验者；

(8)拒绝合作者。

中止临床研究的标准

(1)因严重不良反应不能完成观察者，应纳入不良反应统计，但不计入疗效统计；

(2)在试验过程中违背研究计划或者使用不利于观察药物疗效的药物者；

(3)拒绝在知情同意书上签字者；

(4)违约或失防的病人，拒绝抽血者；

(5)依从性差者。

研究方法

(一)药品及来源：

1.试验用药：实施例1产品，其质量已经中国药品和生物制品研究所检定。

2.对照药：使用不含重组人干扰素α2b，但含其它成份的喷雾剂。

3.疫苗：麻疹、风疹减毒活疫苗：北京生物制品研究所产品。麻风腮三联减毒活疫苗(Aventis Pastuer)均使用同样剂量，改为滴鼻接种。

(二)试验方法：

1.预防人群数：共用2种疫苗，检测2种呼吸道病毒，每种疫苗用药组和对照组各20例。

2.疗程：疫苗接种均为滴鼻接种，在疫苗接种前2天，开始喷药，连续用药10天；第三天进行疫苗接种。

3.给药途径：每日喷2次，每次每个鼻孔各喷一下、咽喉一下，每喷一下为0.1ml。

4.每位观察者在病毒疫苗接种前和接种后21天、28天各采取三份血清，以备检测抗体水平之用。

观察指标

1.对2种病毒抗体的检测：在开始用药之日和在病毒活疫苗接种后21天和28天各采血1次，分离血清，检测2种病毒抗体的增长幅度。

2.病毒检测：

在病毒疫苗接种后5天，取咽拭子.采用定量RT-PCR技术检测2种病毒基因的拷贝数。

3.副反应观察：

在使用A或B药期间，每日记录可能产生的副反应，包括症状和体征(体温)。

在用药前后由耳鼻喉科医生对试验者进行鼻粘膜检测各1次。

疗效评价

1、用干扰素组的疫苗病毒血清抗体滴度比对照组有显著性降低为有效。

2、用干扰素组的咽拭子疫苗病毒定量PCR检测，试验组量与对照组相比有显著性降低为有效。

药物安全性评价

1、参加试验的医生认真观察及记录不良事件，及时填写不良事件报告表，并由主管医生签字。

2、对不良事件应及时处理，对危及患者生命的不良事件应立即进行抢救，对患者不能耐受的不良事件应及时停药，并进行处理，轻度不良事件可继续观察。

3、不良事件与药物的关系分析：

(1)肯定有关：在用药的相应期间出现明显的药物反应，停药后反应消失，再次用药反应再现。

(2)可能有关：明显的药物反应，停药后反应消失，但不能用病人本病的症状作出相应的解释。

(3)可能无关：与用药有密切的时间关系，但存在其他有关的因素。

(4)肯定无关：疾病本身的反应、或用药前即存在的症状、或伴随疾病的表现。

(5)无法判定。

研究结果

(一)应用实时定量PCR技术评估人重组干扰素a2b喷雾剂在人群中对麻疹病毒减毒活疫苗的干预作用

对照组共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子标本共7份，4份检测为阳性；阳性率为57.1％；干扰素组也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子标本共7份，3份标本检测结果阳性，阳性率为42.9％。由于样本数量小，无统计学意义。但是，在病毒基因阳性标本中，两组病毒基因的拷贝数的比较却有明显的差别，见图27和下表：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的麻疹病毒基因拷贝数的比较

  样品编号  Copies/reaction  对照组  314-2  67300  483-2  132000  493-2  77700  干扰素组  18-2  23000  21-2  32800  22-2  7800

上述有限样本初步说明，干扰素组麻疹病毒基因拷贝数比对照组的病毒基因拷贝数要低4.4倍，可以初步看出人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上可以抑制麻疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。

(二)应用实时定量PCR技术评估人重组干扰素a2b喷雾剂在人群中对风疹病毒减毒活疫苗的干预作用

对照组共有22人，其中男5人、女17人，平均年龄19.4岁，疫苗鼻腔免疫后72小时每人采集咽拭子标本共22份，仅3份检测为阳性；干扰素组共有8人，全为女性，平均年龄为21.4岁，疫苗鼻腔免疫后72小时每人采集咽拭子标本共8份，仅2份检测为阳性。两组阳性标本中病毒基因拷贝数的比较见图28和下表：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的风疹病毒基因拷贝数的比较

  样品编号  Copies/reaction  疫苗组  403-2  110238  484-2  162857  428-2  195000  干扰素组  465-2  5070  467-2  4000

可以发现干扰素组病毒拷贝数比对照组的要低两个数量级，初步说明人重组干扰素a2b在一定程度上是可以抑制风疹病毒的繁殖。

(三)人重组干扰素a2b喷雾剂在人群中对风疹、麻疹和腮腺炎减毒活疫苗鼻腔接种后免疫效果的干预作用

1、重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂干预麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

ELISA测定结果见表3.比较免前与免后21天和28天平均P/N值的差数，两组有显著差异，从有限样本来说，初步表明重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂能干预麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后加腔免疫的免疫反应。

干扰素喷雾剂干预麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果见下表：

  组别  免前与免后21天平均P/N值的差  数  免前与免后28天平均P/N值的  差数  对照组(4)  1.34  3.58  干扰素组(6)  0.08  0.62  干扰素干预效果(组差)  1.26  2.96  显著性测定  P＝0.025  P＝0.068

2.重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂干预风疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

风疹病毒血凝抑制反应测定结果见表4。比较免前与免后21天和28天血清风疹病毒血凝抑制滴度平均增加倍数，两组有差异，从有限样本来说，初步表明干扰素鼻腔喷雾在一定程度上干预风疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后加腔免疫的免疫反应。

干扰素喷雾剂干预风疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果见下表：

  组别  免前与免后21天血清血凝抑  制滴度平均增加倍数  免前与免后28天血清血凝抑制  滴度平均增加倍数  对照组(4)  2.28(20)  2.03(20)  干扰素组(6)  1.33(6)  1.66(6)  干扰素干预效果(组差)  0.95  0.37

3.重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂干预风风腮三联病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

风疹血凝抑制反应测定结果见表5。比较免前与免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍数，两组有差异，但是28天结果无差别，腮腺炎血凝抑制反应测定结果见下表：干扰素喷雾剂干预麻风腮病毒减毒活疫苗鼻腔接种后免疫反应的结果

  组别  免前与免后21天血清血凝抑  制滴度平均增加倍数  免前与免后28天血清血凝抑制  滴度平均增加倍数  风疹病毒/对照组  2.36(25)  1.3(15)  风疹病毒/干扰素组(4)  1.75(16)  1.3(6)  干扰素干预效果(组差)  0.61  0  腮腺炎病毒/对照组(28)  1.28(18)  1.64(11)  腮腺炎病毒/干扰素组(6)  1.28(7)  1.50(6)  干扰素干预效果(组差)  0  0.14

比较免前与免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍数，两组无差异，但是28天结果有轻微差别；从有限样本来说，初步表明干扰素鼻腔喷雾干预麻风腮三联疫苗鼻腔接种加腔免疫的免疫反应不如单价疫苗明显。研究结论及分析：

1、限样本数的初步结果表明，使用干扰素喷雾剂组的风疹病毒和麻疹病毒阳性标本中病毒基因拷贝数均比对照组要低，麻疹组低4.4倍，风疹组低两个数量级。因此可见，人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上可以抑制麻疹病毒和风疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。但是，在麻疹和风疹的对照组和干扰素组中，在病毒活疫苗接种后第3天采取的咽拭子样本中，病毒检出阳性率均太低：麻疹喷雾免疫组的对照组病毒阳性率仅为57.1％；干扰素组的阳性率仅为42.9％；风疹喷雾免疫组的病毒阳性率更低；可能的原因是所选择的对象均曾经感染过麻疹和风疹，均不是初次免疫，上呼吸道已经有低水平抗体存在，这些低水平的特异性抗体可以掩盖干扰素非特异性抗病毒活性，所以，病毒攻击后的病毒检出率太低。

2、由于选择的人群是麻疹抗体低水平人群，虽然样本小，但已经可以看到重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂对麻疹减毒活疫苗鼻腔接种后的再次免疫效果确有一定的干预作用，在免疫后第21天，干扰素组与对照组的平均P/N值的差异有显著诧异(P＝0.025)；这与病毒基因拷贝数的减少是相吻合的。

3、麻疹和风疹减毒活疫苗原为注射免疫接种，现在改为鼻腔喷雾接种，这次研究虽然没有同时比较注射免疫与鼻腔免疫的效果，但是，从有限的初步的结果来看，鼻腔喷雾1次加强免疫后，血清抗体水平平均增加2.28(血凝抑制抗体)-3.58倍(ELISA)，这说明进行鼻腔喷雾加强免疫有一定作用。但是麻风腮三联疫苗鼻腔接种的效果不明显，可能的原因是，麻风腮三种病毒在上呼吸道同时繁殖相互有干扰作用。

4、鉴于很难选择麻疹低抗体人群；关于选择风疹低抗体人群，因无试剂无法选择。所以，这一技术路线拟不再继续，改为在双盲、随机的人群中使用干扰素喷雾剂和不含干扰素的喷雾剂，在一定期间内检测呼吸道病毒IgM抗体差异的方法来评估干扰素喷雾剂的抗病毒效果。

                                          实验例10

应用实时定量PCR技术评估本发明喷雾剂在人群中对麻疹病毒减毒活疫苗的干预作用

本实验例的目的在于研究人重组干扰素a2b喷雾剂在人群中对麻疹病毒减毒活疫苗的抑制作用，通过实时定量PCR的方法，对实验组和对照组所采集的咽拭子样本进行检测，判断麻疹病毒阳性标本并得出阳性标本的病毒拷贝数。结果的有限样本初步说明，干扰素组麻疹病毒拷贝数比对照组的病毒的拷贝数要低4.4倍。结论：人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上可以抑制麻疹病毒在上呼吸道的繁殖。

麻疹病毒(Measles virus)是一种导致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒属的单股负链RNA病毒。麻疹是儿童最常见一种急性呼吸道传染病。临床上以发热、上呼吸道炎症、结膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹为特征。麻疹病毒的实验室检测包括病毒分离、分子杂交直接检测病毒RNA、RT-PCR、血清学诊断等。

重组人干扰素a2b喷雾剂是用于鼻腔喷雾的一种干扰素剂型。干扰素具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性的蛋白质，在经过近半个世纪的临床研究和应用，说明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤治疗药物，并且有研究表明干扰素a2b在细胞水平上抑制病毒的复制。

实时定量PCR技术是体外酶促核酸扩增的一项技术革命，在近年来发展迅速。特别是在微生物的检测上，具有高灵敏度、高特异性、高效快速、防污染以及易于标准化的特点。它可以分为探针法和荧光掺入法，其中探针方面可供选择的有TaqMan探针、FRET探针以及分子信标(molecular beacon)，这种方法存在特异性高的优点，但是设计合成困难、成本高、价格贵。而荧光掺入法是利用DNA结合染料SYBR GreenI可以特异性结合双链DNA的特性进行荧光检测，它价格低廉，可以发展成一种能广泛应用于临床检测价格低廉的病毒定量诊断方法。

本实验例的目的是采用实时定量PCR技术评估本发明喷雾剂在人群中对麻疹病毒减毒活疫苗的干预作用。

材料与方法

1、人群选择和临床方案

江苏省徐州市唯唯豆奶集团20-25岁的初次筛选麻疹低抗体的人群，共30人，分为两组。一组为对照组：喷鼻接种麻风腮三联减毒活疫苗(美国默沙东公司)一次，喷鼻接种量为说明书疫苗的接种量。接种前采集一次咽拭子(免前标本)，接种后三天再采集一次咽拭子(免后标本)。另一组为干扰素组：先连续使用重组人干扰素a2b喷雾剂(北京远策药业有限责任公司)喷鼻10天，第二天接种同样剂量的麻风腮三联减毒活疫苗。接种前采集一次咽拭子(免前标本)，接种后三天再采集一次咽拭子(免后标本)。

2.重组人干扰素a2b喷雾剂：由北京远策药业有限责任公司生产。每瓶3.65毫升，每毫升含300万国际单位重组人干扰素a2b。干扰素组每日喷鼻、咽2次，每次左右鼻腔和咽部各1下，每喷雾1下为0.1毫升。

3.病毒RNA的提取

病毒RNA提取采用Invitrogen公司的TRIZOL提取试剂盒，具体操作根据试剂盒说明书。

4.病毒标准品RNA的确定

用分光光度计测定疫苗中的麻疹病毒RNA的纯度和浓度，共测定五次，求出平均值。通过一定的数学公式，将病毒的浓度换算成病毒的拷贝数。再将标准品病毒RNA进行一系列的10倍稀释，用于real-timePCR中标准曲线的确定。

5.Real-time PCR法

靶序列的选择在麻疹病毒保守的matrix基因区。正链引物序列为：5’-ATAGT

TGTTAGACGTACAGCAGGG-3’；负链引物序列为5’-ACCGC ATTGC ACACT TGGTT-3’。One-stepRT-PCR试剂盒为QIGEN公司产品。SYBR Green I(20×Concentration，用于real-time PCR)购自上海开放科技公司。实验步骤按试剂盒说明书进行，包括10ul的水、5ul的buffer、1ul的Enzyme Mixture、1uldNTP、引物各为1ul、1ul的SYBR Green I、5ul的样品RNA，共25ul体系。反应条件为：反转录50℃30min，95℃ 15min，1个循环；PCR 94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s，40个循环；在50℃-99℃做溶解曲线，最后降温至37℃保存。所用仪器为Rotergene公司RG-3000荧光定量PCR仪。

6.定量结果的统计学方法

应用Rotergene Version 4.6软件对实验结果进行分析，采用对数平均值计算病毒的拷贝数。

结果：

一、麻疹病毒标准品的测定和标准曲线的建立

用分光光度计测定病毒RNA的浓度后，将其进行一系列的10倍稀释将其换算为病毒的拷贝数。在real-time PCR完成后，以每个稀释度荧光的对数值(y轴)对出现的循环数(x轴)作图，如图29。图中的水平线位于荧光背景之上，与曲线的交点可以确定每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，即Ct值。

通过图29，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，如图30。标准曲线的相关系数为0.9937，表明相关性非常高。标准曲线在10⁷-10⁴copies/reaction这一很大的范围内有很好的线性关系。并且最小可以检测到100个病毒拷贝。

二、样品中阳性样本的判断

将两组免疫前和免疫后的标本进行real-time PCR检测，在对标本结果的判断中，采用是否存在Ct值，并且结合扩增产物的Tm值进行判断。因为在实验中，使用的是SYBR Green I，它能非特异性的嵌合于双链DNA双螺旋结构的小沟中，但是存在的缺陷是SYBR Green I能与所有的双链DNA结合，包括扩增的产物、非特异产物、引物二聚体。可以通过溶解曲线分析来确定扩增产物的特异性。在PCR完成后，在50℃-99℃之间作溶解曲线，温度每秒上升0.2℃直到99℃，并且持续的进行荧光记录，得出溶解曲线，如图31。某一特定的PCR产物的Tm值由其片段长度和GC含量决定的，可以通过Tm值的不同来区分非特异产物、引物二聚体和特异性产物。麻疹病毒引物二聚体的Tm值在83.1-84.0℃之间，而特异性产物的Tm值在85.6-86.4℃之间。

三、对照组和干扰素组病毒基因拷贝数的比较

对照组共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子标本共7份，4份检测为阳性；阳性率为57.1％；干扰素组也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子标本共7份，3份标本检测结果阳性，阳性率为42.9％。由于样本数量小，无统计学意义。但是，在病毒基因阳性标本中，两组病毒基因的拷贝数的比较却有明显的差别，见图31和下表：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的麻疹病毒基因拷贝数的比较

  样品编号  Copies/reaction  对照组  314-2  67300  483-2  132000  493-2  77700  干扰素组  18-2  23000  21-2  32800  22-2  7800

所以，从对照组与干扰素组免疫后阳性标本的麻疹病毒基因拷贝数的比较上，有限样本初步说明，干扰素组麻疹病毒基因拷贝数比对照组的病毒基因拷贝数要低4.4倍，可以初步看出本发明喷雾剂在一定程度上可以抑制麻疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。

                                            实验例11

本实验例的目的是评估本发明喷雾剂在人群中对风疹病毒减毒活疫苗的干预作用。

方法：通过实时定量PCR的方法，对干扰素组和对照组所采集的减毒活疫苗免疫后的咽拭子样本进行检测，判断风疹病毒阳性标本并得出阳性标本的病毒拷贝数。结果：有限样本数的初步结果表明，干扰素组的风疹病毒阳性标本中病毒基因拷贝数比对照组要低两个数量级。结论：人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上可以抑制风疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。

风疹病毒(rubella virus，RUV)是一种能引起人类疾病的披膜病毒科风疹病毒属的单链RNA病毒。在大多数情况下，风疹病毒的感染属于一过性和无临床症状的亚临床型感染，仅有少数被感染者会发生较严重的并发症。但孕妇感染风疹病毒后，特别是怀孕3个月以内的孕妇，可以引起胎儿畸形。而且孕妇感染风疹病毒的时间越早，致畸的可能性越大。血清学研究表明，感染过风疹病毒的育龄妇女即使再被感染，怀孕后也会对胎儿造成危害^[1]。风疹病毒的实验室检测包括病毒分离、病毒特异性IgM的检测、分子杂交直接检测病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等等。

重组人干扰素-α2b喷雾剂是干扰素-α2b鼻给药的一种剂型。干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性的蛋白质，在经过近半个世纪的临床研究和应用，说明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤治疗药物。并且有研究表明干扰素a2b在细胞水平上抑制病毒的复制。

实时定量PCR技术是体外酶促核酸扩增的一项技术革命，在近年来发展迅速。特别是在微生物的检测上，具有高灵敏度、高特异性、高效快速、防污染以及易于标准化的特点。它可以分为探针法和荧光掺入法，其中探针方面可供选择的有TaqMan探针、FRET探针以及分子信标(molecular beacon)，这种方法存在特异性高的优点，但是设计合成困难、成本高、价格贵。而荧光掺入法是利用DNA结合染料SYBR GreenI可以特异性结合双链DNA的特性进行荧光检测，它价格低廉，可以发展成一种能广泛应用于临床检测价格低廉的病毒定量诊断方法。

本研究的目的是评估人重组干扰素a2b喷雾剂在人群中对风疹病毒减毒活疫苗的干预作用。材料与方法

1.群选择和临床方案：江苏省徐州市唯唯豆奶集团20-25岁的初次筛选风疹病毒抗体低下的人群，共30人，分为两组：对照组：喷鼻接种风疹减毒活疫苗(北京天坛生物制品股份有限公司)一次，喷鼻接种量为说明书疫苗的接种量。接种前采集一次咽拭子(免前标本)，接种后三天再采集一次咽拭子(免后标本)。另一组为干扰素组，先连续使用重组人干扰素a2b喷雾剂(北京远策药业有限责任公司)喷鼻10天，第二天接种风疹减毒活疫苗。接种前采集一次咽拭子(免前标本)，接种后三天再采集一次咽拭子(免后标本)。

2.重组人干扰素a2b喷雾剂：由北京远策药业有限责任公司生产。每瓶3.65毫升，每毫升含300万国际单位重组人干扰素a2b。干扰素组每日喷鼻、咽2次，每次左右鼻腔和咽部各1下，每喷雾1下为0.1毫升。

3.病毒RNA的提取：病毒RNA提取采用Invitrogen公司的TRIZOL提取试剂盒，具体操作根据试剂盒说明书。

4.病毒标准品RNA的确定：用分光光度剂测定风疹减毒活疫苗中的风疹病毒减毒活疫苗的RNA纯度和浓度，共测定五次，求出平均值。通过一定的数学公式，将病毒RNA的浓度换算成病毒基因的拷贝数。再将标准品病毒RNA进行一系列的10倍稀释，用于real-time PCR中标准曲线的确定。

5.Real-time PCR法：靶序列的选择在风疹病毒保守的E1基因区。正链引物序列为：5’-CAACACGCCGCACGGACAAC-3’；负链引物序列为5’-GGACTGCTGATTGCCGGTGTAATT-3’。One-step RT-PCR试剂盒为QIGEN公司产品。SYBR Green I(20×Concentration，用于real-time PCR)购自上海开放科技公司。实验步骤按试剂盒说明书进行，包括10ul的水、5ul的buffer、1ul的EnzymeMixture、1ul dNTP、引物各为1ul、1ul的SYBR Green I、5ul的样品RNA，共25ul体系。反应条件为：反转录50℃ 30min，95℃ 15min，1个循环；PCR 94℃1 5s，60℃ 15s，72℃ 15s，40个循环；在50℃-99℃做溶解曲线，最后降温至37℃保存。所用仪器为Rotergene公司RG-3000荧光定量PCR仪。

6.定量结果的统计学方法：应用Rotergene Version 4.6软件对实验结果进行分析，采用对数平均值计算病毒基因的拷贝数。

结果

一、风疹病毒标准品的测定和标准曲线的建立

用分光光度计测定的病毒RNA的浓度后，进行一系列的10倍稀释，将其换算为病毒基因的拷贝数。在real-time PCR完成后，以每个稀释度荧光的对数值(y轴)对出现的循环数(x轴)作图，如图32。图中的水平线位于荧光背景之上，与曲线的交点可以确定每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，即Ct值。

通过图32，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，如图33，标准曲线的相关系数为0.99885，表明相关性非常高。标准曲线在10¹⁰-10⁶copies/reaction这一很大的范围内有很好的线性关系。并且最小可以检测到100个病毒基因拷贝。

二、样品中阳性样本的判断

将两组免疫前和免疫后的标本进行real-time PCR检测，在对标本结果的判断中，采用是否存在Ct值，并且结合扩增产物的Tm值进行判断。因为在实验中，使用的是SYBR Green I，它能非特异性的嵌合于双链DNA双螺旋结构的小沟中，但是存在的缺陷是SYBR Green I能与所有的双链DNA结合，包括扩增的产物、非特异产物、引物二聚体。可以通过溶解曲线分析来确定扩增产物的特异性。在PCR完成后，在50℃-99℃之间作溶解曲线，温度每秒上升0.2℃直到99℃，并且持续的进行荧光记录，得出溶解曲线，如图34。某一特定的PCR产物的Tm值由其片段长度和GC含量决定的，可以通过Tm值的不同来区分非特异产物、引物二聚体和特异性产物。风疹病毒引物二聚体的Tm值在86.1-86.6℃之间，而特异性产物的Tm值在87.6-88.6℃之间。

三、对照组和干扰素组风疹病毒基因拷贝数的比较

对照组共有22人，其中男5人、女17人，平均年龄19.4岁，疫苗鼻腔免疫后72小时每人采集咽拭子标本共22份，仅3份检测为阳性；干扰素组共有8人，全为女性，平均年龄为21.4岁，疫苗鼻腔免疫后72小时每人采集咽拭子标本共8份，仅2份检测为阳性。两组阳性标本中病毒基因拷贝数的比较见图34和下表：对照组与干扰素组免疫后阳性标本的风疹病毒基因拷贝数的比较

  样品编号  Copies/reaction  疫苗组  403-2  110238  484-2  162857  428-2  195000  干扰素组  465-2  5070  467-2  4000

从上表和图34中，可以发现干扰素组病毒拷贝数比对照组的要低两个数量级，初步说明人重组干扰素a2b在一定程度上是可以抑制风疹病毒的扩增的。

讨论：

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，因为普通PCR在扩增完成后，必须打开试管进行样品检测，增加了污染的可能；而实时定量PCR反应和结果分析在密闭的一个试管中进行，可以减少污染，准确性更高。近年来，实时定量PCR在病毒的临床的检测上发展迅速，如HBV、SARS、HCV、HIV、细小病毒B19等等。

SYBR Green I是一种不对称的箐类荧光素，它能非特异性的嵌合于双链DNA双螺旋结构的小沟中，结合状态的荧光强度较游离状态的荧光增强千倍。与TaqMan探针和分子信标相比，其具有价格低廉、操作简便的特点。因为TaqMan探针和分子信标需要针对待测病毒设计特异性的探针，并且需要荧光标记，不仅操作麻烦，而且价格昂贵，而SYBR Green I只需在扩增体系中直接加入，即可进行实时定量检测，避免了设计、标记探针，适用任何扩增体系。非常适用于发展成一种能广泛应用于临床检测价格低廉的病毒定量诊断方法^[11]。但是存在的缺陷是SYBR Green I能与所有的双链DNA结合，包括扩增的产物、非特异产物、引物二聚体。可以通过两种方法来克服这种缺陷，一、使用热启动的Taq酶进行热启动扩增，减少非特异性扩增产物的出现。二、通过溶解曲线分析来确定扩增产物的特异性，来避免假阳性结果的出现^[8]。在实验中我们使用的QIGEN公司的One-step RT-PCR试剂盒含有热启动Taq酶；并且通过溶解曲线可以很好的区分非特异产物、引物二聚体和特异性扩增产物。

人重组干扰素a2b喷雾剂在人群中对风疹病毒减毒活疫苗的抑制的研究中，由于所选取的人群均为低抗体人群，所以活疫苗接种后72小时，PCR检测出的病毒阳性率很低，虽在统计学上无意义，但是在有限的病毒基因阳性的标本中，我们发现干扰素组病毒基因拷贝数比对照组的要低两个数量级，初步说明人重组干扰素a2b喷雾剂在一定程度上是可以抑制风疹病毒减毒活疫苗在上呼吸道上皮细胞内的繁殖。