抑制人Ezrin基因表达的siRNA及其表达载体

摘要

本发明涉及一种siRNA，公开了一种抑制人Ezrin基因表达的siRNA及其表达载体。本发明设计、合成了靶向人Ezrin基因的两对siRNA，并成功构建了它们在哺乳动物细胞内的表达载体。同时，运用这些siRNA可以有效、特异地干扰Ezrin的表达，建立了食管癌Ezrin低表达细胞株，为深入研究食管癌及其它Ezrin相关肿瘤中Ezrin的功能打下了坚实的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，具体地说，涉及一种抑制人Ezrin基因表达的siRNA及其表达载体。

背景技术

RNAi是由双链RNA介导的同源靶基因转录后沉默的过程，RNAi可以通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因mRNA降解，从而达到减少基因表达的目的。RNAi技术作为新兴的基因阻断技术，具有明显的优势，它具有高度的特异性，干扰效率高而且操作简单。因此以及广泛的应用于基因功能研究以及抗病毒感染、肿瘤治疗等热点领域。

食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，严重影响人类健康。全世界食管癌患者术后5年生存率仅为20％-30％。造成食管癌预后差的一个重要原因是其转移性强，有些病人甚至在确诊时已经发生了局部组织浸润和淋巴结的转移。

侵袭和转移是多因素参与的、多步骤完成的分子生物学变化过程。肿瘤细胞具有很强的迁移能力，使得它能克服细胞与细胞间以及细胞和基质间的粘附作用侵入周围组织。侵袭性强的细胞通常都有细胞突触多、细胞间粘附减弱以及通讯连接丧失等特点。现在普遍认为肿瘤细胞的这些恶性征是由于肌动蛋白结合蛋白以及一些相关的连接蛋白引起的细胞骨架重组所致。

在这些骨架相关蛋白中，我们研究的是Ezrin。Ezrin基因又称VIL2，定位于染色体6q25.2～q26，其表达产物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成员之一，主要参与细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接粘附分子及调节信号转导等功能。

越来越多的证据表明Ezrin调控肿瘤发展。转移与非转移肿瘤细胞系及组织样品中基因表达的对比结果显示，来自啮齿动物乳腺、人胰腺和结肠的癌转移细胞中Ezrin的表达显著提高；同时，Ezrin在多种人类肿瘤中强烈表达，这些肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌等；进一步的研究显示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科动物横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞，Ezrin很可能是恶性肿瘤的关键调节分子。现有的研究还提示Ezrin参与肿瘤细胞的粘附、凋亡尤其是移动侵袭等生物学过程，并与肿瘤的发生发展密切相关。

食管癌中Ezrin的表达情况最近才得到了初步的阐明，在我们以往的研究中发现在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化过程中Ezrin发挥着重要的作用。我们最近对食管癌临床组织样本的研究也揭示食管癌中Ezrin的表达模式发生了改变。然而，Ezrin在食管癌及其它肿瘤中的功能及其表达改变的机制至今仍未得到很好的阐明。如能应用RNAi技术来抑制食管癌细胞中Ezrin基因的表达，从而探讨Ezrin在食管癌细胞中的功能，这将有助于从分子水平阐明Ezrin在这些上皮来源的肿瘤组织细胞表达改变的机制，从而为揭开食管癌的发病机制及治疗提供有用的线索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制人Ezrin基因表达的siRNA。

本发明的另一目的是提供上述抑制人Ezrin基因表达的表达载体。

本发明的上述目的可以通过以下措施实现。

设计抑制Ezrin基因表达的双链siRNA片段：依据Dharmacon公司在网上提供的设计软件设计了两组siRNA。其碱基序列及作用部位如下：

E1：(SEQ ID NO：1)

5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATA

GTGGATTTTTGGAAA3’

5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATC

CACATAGTGGAGGG3’

作用于人Ezrin mRNA的第274-292；

E2：(SEQ ID NO：2)

5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGC

CAAAGTTTTTTGGAAA3’

5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAG

TGGAGGCCAAAGTGGG 3’

作用于人Ezrin mRNA的第265-283。

本发明的可以产生抑制人Ezrin基因表达的siRNA的载体，其具有以下的基本结构：由启动子、Ezrin编码区、终止密码、DNA序列顺序连接而成的环状双链DNA分子；

启动子为可启动产生siRNA的序列，它是启动它的下游紧邻之基因的表达的元件；启动子优选polymerase-III H1-RNA基因启动子。

Ezrin编码区为表达权利要求1所述的siRNA的编码区，由19个核苷酸组成，可采用双向结合或以发夹状结构在细胞内形成双链RNA；

终止密码为5～6个T；

DNA序列为任何真核质粒载体和/或病毒的介于RNA编码区和启动子之间的DNA序列，含有质粒载体DNA的复制起始位点，或含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对抗某种抗生素的抗性的基因或使真核细胞获得某种抗生素的抗性的基因。所述任何真核质粒载体和/或病毒优选pSUPER.neo载体。所述抗生素抗性基因优选抗生素G418抗性基因neo。

上述载体pSUPER.neo(Oligoengine)具有以下优点：(1)具有polymerase-IIIH1-RNA基因启动子，可以产生一个不含多聚腺苷酸尾的小RNA转录子；(2)可以很精确的启动转录；(3)终止信号包含有T5；(4)在第二个尿嘧啶的后面终止转录，可以产生和合成的siRNA相类似的末端，即3’端含两个不配对的胸腺嘧啶或尿嘧啶。这个载体能在哺乳动物细胞里面稳定的表达siRNA，而且还含有neo基因，可以用G418筛选转染成功的细胞，建立细胞系，适合于做长期的研究。

根据pSUPER.neo载体图，我们在线性化载体时采用依次酶切法。同时由于插入siRNA后的载体其Bgl II的酶切位点将被破坏，因此我们在连接后转化之前重新用Bgl II处理半小时，把自身环化的载体重新酶切成线性，以降低平板克隆生长背景，大大提高阳性质粒的筛选的效率。阳性质粒经EcoR I和Hind III酶切后可获得一287bp的片断，而空载体则可切出一227bp的片断，因此我们采用了更为敏感的非变性聚丙烯电泳加银染鉴定的办法进行重组子的筛选。

将构建好的表达载体转染进食管癌细胞系EC109。为获得稳定表达质粒的细胞，我们首先使用浓度较高的G418进行药物筛选。转染空白质粒PSC和转染以上siRNA的细胞(分别称为PSE1和PSE2)的EC109细胞，由于质粒载体上有neo基因，具有G418抗性，因此得以存活；而相比之下，未转染上述质粒的对照EC109细胞则因G418的毒性作用而被杀死。为防止连续传代培养过程中，表达质粒的丢失，仍将细胞置于药物浓度相对较低的生长环境中培养，如果质粒丢失，细胞仍会因G418的毒性作用而被杀死。在上述条件下，细胞能够持续生长，表明稳定转染空白质粒和干扰质粒的EC109细胞株已被成功建立。

筛选出来的细胞株首先进行干扰效果的分析。本发明用RT-PCR和Western blotting分别从转录和翻译水平进行分析。结果显示无论是在转录水平还是在翻译水平，干扰后的细胞Ezrin表达均明显降低，而且转染空白质粒的细胞Ezrin基因的表达未受影响，结果同时还显示干扰效果的比较为PSE1＞PSE2。此外，连续几代的细胞总蛋白中Ezrin表达的检测也显示干扰的效果非常的稳定。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明设计、合成了靶向人Ezrin基因的两对siRNA，并成功构建了它们在哺乳动物细胞内的表达载体。同时，运用这些siRNA可以有效、特异地干扰Ezrin的表达，建立了食管癌Ezrin低表达细胞株，为深入研究食管癌及其它Ezrin相关肿瘤中Ezrin的功能打下了坚实的基础。

附图说明

图1为siRNA发夹结构示意图；

图2载体构建示意图；

图3为Ezrin基因siRNA哺乳动物内表达载体PSE的酶切鉴定图；

图4为阳性质粒的测序鉴定图；

图5为Ezrin干扰效果的检测；

图6为pSUPER.neo载体图。

图3中，1、2泳道为阳性质粒，3泳道为阴性对照，第4泳道为100bp DNA marker。图5中，(A)干扰效果的Western blotting检测；(B)干扰稳定性的检测；(C)干扰效果的RT-PCR检测；β-actin和GAPDH分别作为的Western blotting和RT-PCR的上样对照。

具体实施方式

实施例1靶向Ezrin基因的siRNA设计、合成和退火。

依据Dharmacon公司在网上提供的设计软件设计了两组siRNA序列，如表1：

表1

siRNA Target Sequence  编号  Region  Start5′T C C A C T A T G T G G A T A A T A A 3′(SEQ ID NO：3)  PSE1  ORF  2745′A C T T T G G C C T C C A C T A T G T3′(SEQ ID NO：4)  PSE2  ORF  265

设计的原则如下：

(1)从mRNA的AUG起始密码开始，寻找5’AA(N19)TT，

其中N是任意碱基，结构长度为19bp的序列(如表1)；

(2)目标序列上不能连续出现3个或者三个以上的G或者C；

(3)干扰序列避免在靶基因的首末端；

(4)选择GC含量在30％-52％之间的序列；

(5)靶向ORF区；

(6)挑选的序列在公共数据库中进行同源性比较；

克隆入siRNA表达载体中的DNA片段包括两个短的反向重复序列，中间由发夹序列分隔，随后接上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子；片段的5’端加Bgl II的酶切位点，而3’端则含有HindIII的酶切位点(见图1)。整理好的序列送上海基康生物技术有限公司合成。

合成的寡核苷酸序列(2OD)加入66μl的无核酸酶水中(终浓度为1μg/μl)，充分溶解。退火时，在一新的离心管中依次加入下列试剂(总体积50μl)：siRNA正反义链各3μl，加上44μl的退火缓冲液(10Mm NaCl，50mM Hepes，pH7.4)，充分混匀后在PCR仪上完成以下操作：94℃4min，80℃4min，75℃4min，然后是70℃10min，37℃ 20min，最后冷却到25℃。产物可以直接用于连接或者保存于4℃。

实施例2  表达载体PSE1和PSE2的构建

1.载体的线性化及回收：在离心管中依次加入下列试剂(总体积50μl)：无菌水37.5μl、pSUPER.neo载体5μl、10×缓冲液B 5μl、乙酰化BSA(10mg/ml)0.5μl和HindIII(20u/μl)2μl。混匀后，37℃水浴孵育1h后继续往混合物中加入Bgl II(20u/μl)2μl，在37℃水浴再孵育1h。取5μl电泳进行1％琼脂糖凝胶电泳，以未酶切质粒为对照，鉴定载体是否已成线性。参照Quick PCR purification kit说明书回收线性pSUPER.neo载体片段。

在酶切混合液中加入5倍体积的PB缓冲液，然后将此混合液转移至QIAquick spin柱，12000×g离心1min；弃流出液，在QIAquickspin柱加入750μl PE缓冲液，12000×g离心1min，弃流出液；将QIAquick spin柱放回原收集管，12000×g再离心1min；接着将QIAquick spin柱转移至一干净1.5ml离心管中，并加入30μlEB缓冲液于柱中心，室温下放置1min，室温下12000×g离心1min。取2μl回收液进行电泳，确定回收成功，剩余回收液-20℃冻存备用。

2.将退火后的siRNA连接进线性化的载体中：退火后的siRNA与线性pSUPER.neo载体的连接。在一新的离心管内依次加入以下试剂(冰上操作)：2×T₄ DNA连接酶缓冲液5μl、线状pSUPER.neo载体1μl、siRNA 3μl和T4DNA连接酶1μl，混匀，25℃循环水浴1h。转化前加入1μl Bgl II处理半小时。

3.将连接产物常规转化进感受态细胞——JM109。生长出的克隆扩增后提取质粒进行双酶切鉴定：取2μl质粒DNA，加入2μl10×buffer，2μl乙酰化BSA，8μl无菌水和3μlEcoR I和3μlHindIII限制性内切酶。37℃水浴4～5h。8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行银染鉴定，步骤如下：10％乙醇固定30min；1％硝酸处理8min；超纯水洗两次后用0.2％的硝酸银染色30min，然后在3％无水碳酸钠与0.1％的甲醛组成的显色液中显色数分钟，最后在10％的冰乙酸中定影。按照载体图，含有siRNA的重组子经酶切后可见287bp的片断，而空载体对照则可切出227bp的片断。筛选出的阳性克隆再进行测序获得表达质粒(图2、3、4)。

实施例3  稳定转染及干扰效果的分析

鉴定后的重组子转染进人食管癌细胞系EC109细胞，同时还转染空载体做对照。为获得稳定表达质粒的细胞，我们首先使用浓度较高的G418(400μg/ml)进行药物筛选。转染空白质粒PSC和转染以上siRNA的细胞(分别称为PSE1和PSE2)的EC109细胞，由于质粒载体上有neo基因，具有G418抗性，因此得以存活；而相比之下，未转染上述质粒的对照EC109细胞则因G418的毒性作用而被杀死。为防止连续传代培养过程中，表达质粒的丢失，仍将细胞置于药物浓度相对较低的生长环境中培养(200μg/ml)，如果质粒丢失，细胞仍会因G418的毒性作用而被杀死。在上述条件下，细胞能够持续生长，表明稳定转染空白质粒和干扰质粒的EC109细胞株已被成功建立。

转染的方法为：首先，在玻璃试管中加入97μl无血清培养基，然后直接往里加入3μl FuGENE6(Roche公司)转染试剂，轻轻混匀后室温下静置5min。取1μg质粒(PSE质粒和pSUPER.neo空载体)加入以上的混合物中，轻轻混匀。室温下静置15min后，取以上混合物加入培养皿中，置于5％CO2、湿度95％和37℃条件下培养。24h后，把培养皿中的培养液换为含有G418(400mg/L)的常规199培养液进行筛选。14天后，抗药克隆长出，换为培养液中含200mg/L G418的培养液继续培养，传代扩增。

筛选建立的细胞株用于干扰效果的分析。本发明分别用RT-PCR和Western blotting的方法从转录和翻译水平进行干扰效果的分析。提取细胞总蛋白Western blotting分析，结果提示(图5A)PSE1和PSE2在蛋白水平上对Ezrin均有不同程度的干扰效果，而转染空载体的PSC和未作处理的EC109细胞之间Ezrin表达无差异，其中PSE1较对照减弱了87％，而PSE2则为75％。提取细胞总RNA，用人Ezrin特异性的引物进行RT-PCR，结果显示在RNA水平PSE1和PSE2中Ezrin的表达均较两个对照减弱，且PSE1＞PSE2(图5C)，这与Westernblotting的结果一致。经过连续的传代，分别收获第7、8、9代细胞总蛋白进行Western blotting检测，以确定干扰的稳定性(图5B)。结果显示各代均有明显干扰效果而且程度比较稳定。

所有实验均表明，本发明所提供的siRNA表达载体能有效的在哺乳动物细胞内表达siRNA并能特异、高效的干扰Ezrin的表达，为研究Ezrin基因在食管癌中的功能提供很好的工具。

                   抑制人Ezrin基因表达的siRNA及其表达载体序列表

               SEQUENCE LISTING

<110>汕头大学医学院

<120>抑制人Ezrin基因表达的siRNA及其表达载体

<130>

<160>4

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

E1：

5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’

5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’

<210>2

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

E2：

5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA 3’

5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTCGAGGCCAAAGTGGG 3’

<210>3

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

 5′TCCACTATGTGGATAATAA3

<210>4

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

 5′ACTTTGGCCTCCACTATGT3′