法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-01-25
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K14/72 授权公告日:20120516 终止日期:20151207 申请日:20041207
专利权的终止
2012-05-16
授权
授权
2007-03-14
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-01-17
公开
公开
发明领域
广义而言，本发明涉及编码前列腺素类受体家族中一名前所未知之成员的核酸分子。
发明背景
前列腺素类激素，包括前列腺素(PG)、前列环素和血栓烷(TX)，是中央及外周生理效应的重要介质。前列腺素D2(PGD2)形成于各种组织，包括脑、胰脏、肺、骨髓、胃和皮肤以及肥大细胞之中(Lewis等人，1982)。PGD2与中枢神经系统和外周组织中的许多生理活动有关。据察，在中枢神经系统中，PGD2对睡眠之诱导、体温、嗅觉功能、激素释放和伤害感受都有影响。在外周，PGD2是免疫刺激后肥大细胞产生的花生四烯酸的主要环加氧酶产物。当过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎和异位性皮炎患者受到局部过敏原刺激时，患者鼻和支气管灌洗液、泪液和皮肤腔室液中的PGD2水平猛增。活化的肥大细胞，即PGD2的主要来源，是在诸如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮炎和其它疾病中驱动过敏反应的主要因素之一(Brightling等人，2003)。PGD2还具有多种致炎作用，诸如增加结膜和皮肤的血管通透性、增大鼻气道的阻力、加剧气道缩小和嗜曙红细胞渗入结膜和气管等。因此，PGD2是驱动炎症反应的主因之一。
人们早期的努力着眼于对五种天然发生的生物活性前列腺素类激素(PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2和TXA2)鉴定不同的受体，结果得出了前列腺素类受体的五种基本类型：分别为DP、EP、FP、前列环素(IP)和血栓烷(TP)受体(Coleman等人，1994)。前列腺素D2的许多作用都是以其对D型前列腺素受体(DP，即一种G蛋白偶联受体)的作用来介导的。人们最初认为，各前列腺素类激素优先作用于单独的受体，然而前列腺素类激素生物学研究人员开始理解这些配体与不同受体家族之成员作用的混杂性。因此，人们越发明了，若要理解前列腺素类激素的信号传递，就必须澄清前列腺素类受体活化所带来的生物学结果。
DP受体是人们尤为关注的对象，因为它存在于中央和外周细胞之中，提示与各种生物途径介导的活动有关，因此可能对许多病症都具有治疗重要性。已经在大脑中鉴定了DP受体，且PGD2对睡眠之诱导、体温、嗅觉功能和激素释放均有影响(Negishi等人，1993；Wright等人，1999及所附之参考文献)。在脊髓的不同离散细胞群中也发现了DP受体。该观察可以解释PGD2所诱导的痛觉过敏和异常性疼痛(有害触觉刺激所造成的不适感)之不调和效应。DP受体还存在于胃肠道中且与胃肠道之收缩反应有关(Wright等人，1999 Ito等人；1989)。研究还表明，DP受体的配体可诱导粘液分泌和肠细胞的细胞增生。肝脏的糖原生成也可能受DP受体的调节(Ito等人，1989)。DP受体存在于眼中，其激动剂可降低眼内压，这提示它也许对治疗青光眼有作用。据查，含有DP受体和PGD2之血小板可抑制血小板聚集，这为DP受体可用来调节血液病(诸如血栓)提供了支持(Armstrong，1996)。因此，DP受体在不同器官和组织中的不同表现向我们揭示，它也许是在不同的治疗领域中的吸引人的靶标。
尤其重要的是DP受体与多种炎症，包括但不限于哮喘、过敏性鼻炎、气道机能亢进、过敏性皮炎、过敏性结膜炎和慢性阻塞性肺病有关。有关证据证明PGD2是受到免疫刺激后的肥大细胞所释放的主要前列腺素类激素(Roberts等人，1980)。在哮喘病领域，人们长期以来一直认定呼吸道上皮是驱动哮喘病发展的炎症细胞因子和趋化因子之主要来源(Holgate等人，2000)。在哮喘病的实验鼠模型中，受到抗原攻击时，气道上皮组织上DP受体受到急剧上调(Matsuoka等人，2000)。而缺乏DP受体的基因剔除小鼠之气道机能亢进和慢性炎症，即人类哮喘病的两个主要特征(Matsuoka等人，2000)却明显降低。同样，豚鼠实验性哮喘模型表明，DP受体拮抗剂可减轻气道发炎(Arimura等人，2001)。据悉，DP受体还与人类过敏性鼻炎有关，过敏性鼻炎是一种常见的过敏性疾病，特征是打喷嚏、搔痒rhinorea、和鼻道阻塞的症状。对鼻子局部施用PGD2导致鼻道阻塞的依赖剂量的增加(Doyle等人，1990)。研究表明，DP拮抗剂可有效减轻多种物种的过敏性鼻炎症状，具体而言，可抑制抗原诱导的鼻道阻塞(即过敏性鼻炎最明显的症状)。在过敏性结膜炎和过敏性皮炎的实验模型中，DP拮抗剂也有效(Arimura等人，2001)。因此，DP拮抗剂可用于治疗多种PGD2介导的疾病，这些疾病包含但不限于支气管哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性结膜炎、系统性肥大细胞增生症和局部缺血性再灌注损伤。
迄今为止，已经克隆了人DP受体(Boie等人，1995)、大鼠DP受体(Wright等人，1999)和小鼠DP受体(Hirata等人，1994)。人、大鼠和小鼠的这些DP受体在氨基酸水平上具有73-90％的同源性，在各个情况下，活化重组受体会导致细胞内cAMP的累积。对G蛋白偶联受体的一般观察表明，化合物的功效因直向同源受体(orthologue receptor)不同而异。
本文首次公开的是豚鼠DP受体。相比本领域当前已知的，本发明具有几个优势。小鼠、大鼠、人类和豚鼠的物种差异现在可得到更全面的确定和表征。DP受体在天然组织中的低表达水平使得难以评价化合物作为该受体的调节剂、效应物、激动剂或拮抗剂的活性。本发明现在提供了检查分离和纯化条件下的受体，提供了测试化合物的能力然后将体外研究和相同物种体内研究联系起来的机会。豚鼠体格较大，因此是比较小的啮齿动物优选的动物模型，例如，它能够提供更大的表面积供皮肤病学和胃肠道研究。更为重要的是，就一些过敏模型(诸如鼻充血模型)而言，豚鼠是最有用的小动物模型，并且对气道机能亢进调节更有反应。尽管豚鼠是评估多种疾病模型中DP受体调节剂的理想临床前模型(如上所述)，但豚鼠DP受体的克隆还未曾报导，因此难以预测化合物对该直向同源物的亲和性。
附图简述
图1显示了本发明受体的核酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2显示了本发明受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3显示了多个物种间DP受体的编码序列的比对。涂阴影的残基与豚鼠的完全匹配。Hs＝人；Rn＝大鼠；Mm＝小鼠；及Cp＝豚鼠。
图4显示了多个物种间DP受体的氨基酸序列的比对。涂阴影残基与豚鼠的残基完全匹配。Hs＝人；Rn＝大鼠；Mm＝小鼠；及Cp＝豚鼠。
图5显示了豚鼠(cavia procellus)DP受体的基因组DNA片断的RNA印迹分析。泳道1：Invitrogen 0.24-9.5Kb RNA梯；泳道2：来自未受刺激的豚鼠的总肺RNA；泳道3：来自卵白蛋白刺激的豚鼠的总肺RNA。
图6显示了与用小鼠DP受体产生的等同细胞系和亲代细胞系相比，稳定转染的HEK-293-Gα16细胞中表达的重组豚鼠DP受体的PGD2诱导的钙动员的实例。
图7显示了用SPA cAMP测定得出稳定转染的HEK-293-Gα16细胞中表达的重组豚鼠DP受体的PGD2剂量反应曲线的实例。
发明详述
本发明涉及代表但不限于前列腺素类受体家族的分离的核酸和蛋白质形式。在优选实施方案中，该分离的核酸和蛋白质代表豚鼠DP受体。本发明的各个方面在下面章节详细叙述。
定义
本文所用的“核酸分子”是指具有单链或双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷，“RNA”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧尿苷或脱氧胞苷，“DNA”)的磷酸酯聚合物形式或其任意磷酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯。核酸分子可包括脱氧核糖核酸分子(DNA)，诸如基因组DNA和互补DNA(cDNA)，其可以是编码或非编码的单链或双链的、合成的DNA，还可以包括单链或双链核糖核酸(RNA)分子和使用核苷酸类似物生成的DNA和RNA的类似物。也有可能是双链DNA:DNA、DNA:RNA和RNA:RNA螺旋。
本文所用的“分离”或“纯化”的核酸分子是指已与该核酸天然来源中的其它核酸分开的核酸分子。优选地，该“分离”的核酸不带在该核酸的来源生物的基因组DNA中天然地在该核酸侧翼(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。在多种实施方案中，该分离的核酸分子可包含本发明核苷酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。例如，这些侧翼核苷酸序列可以是与该核酸来源细胞的基因组DNA中该核苷酸分子天然侧翼的序列。当核酸基本从其内源环境除去而可以由技术人员操作时，可以认为该核酸是分离的，所述操作为诸如核苷酸测序、限制性切割、定点诱变和亚克隆到表达载体中。核酸可存在于全细胞或细胞裂解物中或以部分纯化或基本纯化的形式存在。从细胞中纯化出来的核酸基本不带其它细胞物质或培养基。化学合成的核酸当基本上无化学前体或其它化学物质时是纯化的。
术语“重组的”，当与多肽相关使用时，是指由重组多核苷酸(即分离或纯化(如上定义)或不在其天然状态的多核苷酸)翻译的多肽。该术语包括例如被含克隆载体或表达载体的细胞表达或含于所述细胞中的多肽，以及合成多肽。
本文所用的术语“调节剂”是指调节本发明受体蛋白的活性的部分，例如但不限于配体和候选化合物。本发明的调节剂可以是激动剂、部分激动剂、拮抗剂或逆向激动剂。
本文所用的术语“激动剂”是指与受体结合时激活细胞内反应或加强GTP与膜的结合的部分(例如但不限于配体和候选化合物)。
本文所用的术语“部分激动剂”是指与受体结合时激活细胞内反应但激活程度小于激动剂；或加强GTP与膜的结合但程度低于激动剂的部分(例如但不限于配体和候选化合物)。
本文所用的术语“拮抗剂”是指与激动剂竞争结合受体同一部位的部分(例如但不限于配体和候选化合物)。但是拮抗剂并不激活受体的活性形式所引发的细胞内反应，从而可以抑制激动剂或部分激动剂所引起的细胞内反应。在相关方面，拮抗剂并不减弱激动剂或部分激动剂不存在时的基线细胞内反应。
本文所用的术语“逆向激动剂”是指与组成性活化受体结合并抑制基线细胞内反应的部分(例如但不限于配体和候选化合物)。所述基线反应由活化形式的受体引起，它低于不存在激动剂或部分激动剂，或者GTP与膜的结合减弱时观察到的正常基础水平。
本文所用的术语“候选化合物”是可用于筛选技术的部分(例如但不限于化合物)。在一个实施方案中，该术语不包括公众已知的选自激动剂、部分激动剂、逆向激动剂或拮抗剂的化合物。候选化合物通过常规的药物发现方法鉴定，所述方法包括鉴定受体特异的内源配体，和/或针对受体来筛选候选化合物，其中这种筛选竞争性测定来评估功效。
本文所用的“组成性活化受体”或“自主性活化受体”在本文中可互相换用，该术语是指不存在配体时活化的受体。此类组成性活化受体可以是内源的或非内源的(即通过重组方法修饰GPCR以产生野生型GPCR的突变的组成性形式。例如见EP1071701、WO00/22129、WO00/22131和美国专利号6,150,393和6,140,509，这些文献的全文特此作为参考纳入本文)。
本文所用的术语“组成性受体的活化”是指用受体与内源配体或其化学等同物结合之外的方法稳定活化状态的受体。
本文所用的术语“配体”是指可与另一分子结合的部分，其中所述部分包括但当然不限于激素或神经递质，更进一步而言，该部分立体选择性结合受体。
本文所用的术语“家族”，当涉及本发明的蛋白质或核酸分子时，是指具有表面上共同的结构域并且具有如本文定义的足够氨基酸或核苷酸序列同一性的两种或两种以上的蛋白质或核酸分子。此类家族成员可以是天然发生的并且可以来自同种或异种。例如，家族可包含源于人类的第一种蛋白质和源于鼠的该蛋白质的同源物，以及，源于人类的第二种、不同的蛋白质和该第二种蛋白质的鼠同源物。家族的成员还可以具有相同的功能特性。
术语“活性”、“生物活性”和“功能活性”在本文中可相互换用，它们是指由标准技术在体外或活体内确定的本发明蛋白质、核苷酸或核酸分子对效应细胞发挥的活性。活性可以是直接活性(诸如与第二种蛋白质的结合或对第二种蛋白质的酶促催化)或间接活性(诸如以本发明蛋白质与另一蛋白质相互作用介导的细胞信号传递活性)。在某一具体实施方案中，活性包含但不限于下述活性至少一种或多种：(i)在信号途径中与蛋白质相互作用的能力；(ii)与配体相互作用的能力；及(iii)与细胞内目标蛋白质相互作用的能力。
此外，根据本发明，可以使用本领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中详细说明，见Sambrook，Fritsch& Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(在此称作“Sambrook等人，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，ed.(1986)]；Immobilized CellsAnd Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
“载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体或黏粒，在此仅列举几例，可以向载体连接另一DNA片段从而引起该连接的片段复制。“复制子”是作为体内DNA复制的自主单位(即能够进行自控复制)的遗传元件(例如质粒、染色体、病毒)。载体的具体实例将在后文中说明。
“盒”是指可插入载体中特定限制性位点的DNA片段。该DNA片段编码目的多肽，并且涉及该盒和限制性位点用于确保该盒插入正确的读框以供转录和翻译。
当外源或异源DNA被导入细胞时，该细胞即受到“转染”。当被转染的DNA产生表型改变时，该细胞已经受到外源或异源DNA的“转化”。优选地，将转化的DNA整合到(通过共价键)组成细胞基因组的染色体DNA。
“异源”DNA是指非天然存在于细胞或细胞染色体位点中的DNA。优选地，异源DNA包括细胞外来的基因。
“同源重组”是将载体的外来DNA序列插入染色体。具体而言，该载体靶定特定的染色体位点以进行同源重组。对于特定的同源重组，载体将含有与染色体序列同源的足够长的区域供互补结合和载体向染色体的掺入。同源区越长且序列相似性程度越大，同源重组的效率就越高。
分离的核酸分子
本发明的一方面涉及编码本发明的受体蛋白质或者其部分的分离的或经纯化的核酸分子。可按本发明所提供的序列信息，采用标准的分子生物技术来分离本发明的核酸分子或该核酸序列的互补序列。以SEQ NO：1的核酸的全部或部分作为杂交探针，采用标准的杂交和克隆技术，即可分离本发明的核酸分子(Sambrook等人，1989)。相应于SEQ ID NO：1的寡核苷酸或其片段可通过标准的合成技术(诸如采用DNA自动合成仪)合成。本发明的核酸分子或其部分的扩增可以采用标准的PCR扩增技术，以cDNA、mRNA、或基因组DNA为模板并利用适当的寡核苷酸引物来进行。
本发明的核酸分子可包含SEQ ID NO：1的一部分。该核酸片段可用作探针或引物或该片段可以编码蛋白质片段，其可以是或不是受体的生物活性部分，诸如配体结合结构域。例如，第七个跨膜结构域中的精氨酸据悉是前列腺素类分子羧基的结合位点(Narumiya等人，1993)，小鼠第二个跨膜结构域的Lys-75和Leu-83赋予配体结合特异性(Kobayashi等人，2000)。这两段序列据前人报导在列腺素类家族中特征性地保守(Hirata等人，1994)并且也存在于豚鼠DP蛋白质中：第二个细胞外环中的QYCPGTWCR和第七个跨膜结构域中RFLSVISIVDPWIFI在所有DP直向同源物中都是相同的。SEQ ID NO：1的核苷酸序列允许产生探针和引物来鉴定和/或克隆本发明的受体或细胞、组织和器官中的同源物。寡核苷酸通常包含一个核苷酸序列区，该核苷酸序列区在严格条件下与SEQ IDNO：1的有义或反义序列或SEQ ID NO：1的天然或人工突变的至少10个、优选约12个，更优选25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸杂交。该探针可包含附着的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。该探针可以是试剂盒的部分，用来鉴定编码所述核酸的细胞或组织、检测mRNA水平或确定基因组基因是否已经突变或缺失。
本发明进一步涉及与SEQ ID NO：1具有90％同源性的分离的核酸分子。可利用序列数据库所提供的标准软件，采用默认参数通过比较序列，或在DNA杂交中在为特定系统确定的严格条件下可以鉴定基本同源的序列。确定适当的杂交条件在本领域技术范围内。见例如Maniatis等人，上文；DNA Cloning，Vols.I & II，上文；Nucleic Acid Hybridization，上文。
由于天然等位基因变异，种群内可以存在DNA序列多态性。等位基因是在给定基因座上备选发生的一组基因。本文所用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码本发明的受体蛋白质，优选豚鼠受体蛋白质的可读框的核酸分子。本文所用的短语“等位基因变体”是指在基因座上发生的核苷酸序列或是指该核苷酸序列编码的多肽。通过测序许多不同个体中的目标基因可鉴定备选等位基因。任何和所有这些核苷酸变异及由此而来的氨基酸多态性，或因自然等位基因变异所导致的变异及不改变本发明受体的功能活性的变异均在本发明的范围之内。
通过分离编码具有本发明受体的生物活性的多肽的SEQ ID NO：1的一部分可以制备编码“生物活性”或“生物相关的”的部分的核酸片段。例如，表达配体结合结构域或信号转导结构域的受体蛋白质的编码部分(例如通过体外重组表达)，然后评估该受体编码部分的活性。本发明还包含鉴于遗传密码简并性虽不同于SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列但却编码同一蛋白质的核酸分子。例如，发明人鉴定出两个可能的N糖基化位点，即氨基末端的Asn-7和第一个胞外环中的Asn-86。另外，还鉴定出两个可能的蛋白质激酶C磷酸化位点，即分别位于第一和第三胞质环中的Ser-46和Thr-140。
本领域技术人员已知，除了天然的等位基因变体之外，编码特定氨基酸的各密码子还具有大量的冗余性。因此，本发明涉及编码包括备选密码子的RNA的那些DNA序列或者编码备选密码子的RNA序列，所述序列编码与SEQ NO：2所表示的相同氨基酸序列或者其部分的最终翻译。本领域众所周知，以下密码子可互换使用以编码特定氨基酸：
苯丙氨酸(Phe或F) UUU或UUC
亮氨酸(Leu或L) UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或
CUG
异亮氨酸(Ile或I) AUU或AUC或AUA
甲硫氨酸(Met或M) AUG
缬氨酸(Val或V) GUU或GUC或GUA或GUG
丝氨酸(Ser或S) UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或
AGC
脯氨酸(Pro或P) CCU或CCC或CCA或CCG
苏氨酸(Thr或T) ACU或ACC或ACA或ACG
丙氨酸(Ala或A) GCU或GCG或GCA或GCG
酪氨酸(Tyr或Y) UAU或UAC
组氨酸(His或H) CAU或CAC
谷氨酰胺(Gln或Q) CAA或CAG
天冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC
赖氨酸(Lys或K) AAA或AAG
天冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC
谷氨酸(Glu或E) GAA或GAG
半胱氨酸(Cys或C) UGU或UGC
精氨酸(Arg或R) CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或
AGG
甘氨酸(Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG
色氨酸(Trp或W) UGG
终止密码子 UAA或UAG或UGA
在此需要明确指出，以上所列为RNA序列的密码子，相应于DNA的密码子中用T代替U。
本领域技术人员还理解可通过突变向SEQ ID NO：1中引入改变而不改变编码蛋白质的生物活性。“非必需”氨基酸残基是不同于野生型序列(例如SEQ ID NO：2所表示的序列)却不造成生物活性改变的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所必需的残基。因此，在一些物种间不保守或半保守的氨基酸残基可以是非必需的并且可能是作为变异的目标。因此，本发明的另一方面涉及编码本发明的蛋白质的核酸分子，其含有不是活性必需的氨基酸残基改变。此类蛋白质的氨基酸序列虽不同于SEQ ID NO：1，但其保持生物活性。欲制备编码具有不同于SEQ ID NO：2的序列的蛋白质的核酸，可将一个或多个核苷酸替代、加入或缺失引入SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
可采用标准技术来引入突变，所述技术为诸如定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，在一个或更多预测的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是指将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中是确定的。例如，所述家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝的侧链氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。下文例3提供了豚鼠受体的序列分析，其对豚鼠、人类、大鼠和小鼠的序列进行了比较，为选择非必需氨基酸提供了指导。因此，预测的非必需氨基酸残基将优选为来自同一侧链家族的另一氨基酸所替代。备选地，还可通过诸如饱和诱变沿着编码区或其部分随机引入突变，然后对所得突变体筛选生物活性以鉴定保留了活性的突变体。诱变后，编码蛋白质可重组表达，并测定蛋白质的活性。在优选实施方案中，可以对突变蛋白质测定形成蛋白质：蛋白质相互作用的能力(诸如与前列腺素类信号途径中的蛋白质相互作用)；结合配体(诸如结合前列腺素类受体的配体)的能力；或结合细胞内目标蛋白质的能力。本发明还涉及具有诊断、治疗或预防用途并且将用于筛选受体功能的激动剂、拮抗剂或调节剂的天然或突变的蛋白质或蛋白质片段。
可以改变编码肽的核苷酸序列以编码具有与天然发生的肽的不同性质的蛋白质，诸如改变配体结合结构域的亲和性或调节信号转导途径。本发明还涉及SEQ ID NO：1的核酸序列或者其部分的改变，所述改变修饰所述蛋白质的生物活性。
分离的核酸分子的杂交
在适当的温度和溶液离子强度下，单链形式的核酸分子可与另一核酸分子退火时，该核酸分子与所述另一核酸分子，诸如cDNA、基因组DNA或RNA是“可杂交的”(见Sambrook等人，上文)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。低严格性杂交条件相应于55℃的Tm(例如，5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)、0.25％奶且不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC，0.5％的SDS)。中度严格杂交条件相应于较高的Tm(例如，40％甲酰胺，与5倍或6倍的SSC等)。高度严格杂交条件相应于最高的Tm(例如，50％的甲酰胺，5倍或6倍的SSC等)。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，但是碱基之间的错配是可能的。杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补程度(本领域公知的变量)。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，具有这些序列的核酸杂合分子的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(相应于较高的Tm)按以下顺序减小：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长于100个核苷酸的杂合分子，已经推导了计算Tm的方程(见上述Sambrook等人，9.50-9.51。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置则愈加重要，且寡核苷酸的长度决定了其特异性(见上述Sambrook等人，11.7-11.8)。可杂交的核酸分子的最小长度至少约20个核苷酸，特别地至少约30个核苷酸，更特别地至少约40个核苷酸，更特别地至少约50个核苷酸，更特别地至少约60个核苷酸。
在特定实施方案中，术语“标准杂交条件”是指Tm为55℃和利用上文所述条件。在优选的实施方案中，Tm为60℃；在更优选的实施方案中，Tm为65℃。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的可杂交的核酸分子长为至少300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900或1000个核苷酸，该核酸分子在严格条件下与包含核苷酸序列，优选SEQ ID NO：1的编码序列、其互补序列或其片段的核酸分子杂交。术语“在严格条件下杂交”意在描述杂交和清洗条件，在所述条件下，相互至少55％、60％、65％、70％和优选75％或更高互补性的核苷酸通常保持杂交。这些严格条件是本领域技术人员已知的并且可以见“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。严格杂交条件的优选的非限制性实例是在约45℃6X SSC下杂交，然后于50-65℃下以0.2X SSC、0.1％SDS清洗一次或多次。优选地，在严格条件下与SEQ ID NO：1的序列或其互补序列杂交的本发明的的分离的核酸分子对应于天然发生的核酸分子。本文所用的“天然发生的”核酸分子是指具有天然发生的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白质)。技术人员将理解可以关于序列特异性变量(例如，长度、G-C丰度等)修改所述条件。在另一个实施方案中，在严格条件下与SEQ ID NO：1所表示序列的部分杂交的本发明的分离的核酸分子可用作探针或引物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含核苷酸序列区，该序列区在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的天然发生的突变体的有义或反义序列的至少约12个、优选约25个、更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个相邻核苷酸杂交。
反义核酸分子
本发明包含反义核酸分子，即与编码蛋白质的有义核酸互补(例如，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补)的分子。反义核酸可通过氢键与有义核酸结合。该反义核酸可与SEQ ID NO：1所表示的整个核酸序列或其部分互补。根据本文公开的编码链序列(例如SEQ ID NO：1)，本发明的反义核酸可根据Watson & Crick碱基配对原则设计。反义寡核苷酸可以长为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸可根据本领域已知的方法以化学合成和酶促连接来构建。例如，反义核酸(如反义寡核苷酸)可以化学合成的方式采用天然发生的核苷酸或各种经化学修饰(以期增加分子的生物稳定性或提高反义和有义核酸分子之间形成的双链体的物理稳定性)的核苷酸来制备，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物、磷酸酯衍生物及吖啶取代的核苷酸。
用于制备反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。另外，反义核酸还可以生物方式，利用表达载体来制备，所述表达载体中已经以反义方向亚克隆了核酸(即从插入的核酸转录的RNA将是目的靶核酸的反义方向)。
通常将本发明的反义核酸分子施于受试者或原位产生，以便与编码本发明蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合以抑制转录和/或翻译，从而抑制蛋白质的表达。杂交可通过常规的核苷酸互补形成稳定的双链体，或例如，对与DNA双链体结合的反义核酸分子而言，杂交是通过DNA双螺旋大沟内的特异性作用或与调控区的作用。
本发明的反义核酸分子的施用途径的实例包括在组织部位直接注射。另外，还可以修饰反义核酸分子以靶定选定的细胞，然后进行全身施用。例如，对于全身施用，可修饰反义核酸分子使之特异结合表达于选定细胞表面的受体或抗原，例如通过反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接。反义核酸分子还可以通过本文所述的载体递送到细胞。为了使反义核酸分子在细胞内达到足够的浓度，优选的载体构建体中反义核酸分子被置于强Pol II或Pol III启动子的控制下。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与相互平行的链中的互补RNA形成特异双链杂合分子(Gaultier等人，NucleicAcids Res(1987)15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，Nucleic Acids Res(1987)15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBS Lett(1987)215：327-330)。
核酶
本发明还包含核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切断单链核酸，诸如与核酶杂交的mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(见Haselhoff等人，Nature(1988)334：585-591))可用来催化切割核酸转录物，因此而抑制相应于SEQ ID NO：1的mRNA的翻译。可根据SEQID NO：1所表示的核苷酸序列来设计对SEQ ID NO：1的核酸特异的核酶。例如，可根据已知的SEQ ID NO：1序列来构建Tetrahymena L-19 IVSRNA的衍生物，使活性位置的核苷酸序列与待切之核苷酸序列互补(美国专利号4,987,071和5,116,742，其内容特此作为参考引入本文)。另外，SEQ ID NO：1所表示的核酸序列还可用来从RNA分子群中选择具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA。(Bartel等人，Science(1993)261：1411-1418。
三螺旋核酸分子和肽核酸
本发明还包含形成三螺旋结构的核酸分子。例如，为了抑制基因的表达，可以靶定与SEQ ID NO：1调节区(例如启动子和/或增强子区域)互补的核酸序列，使其形成三螺旋结构，从而防止目标细胞中基因的转录，一般见Helene，Anticancer Drug Des(1991)6(6)：569；Helene Ann NY Acad Sci(1992)660：27和Maher，Bioassays(1992)14(12)：807。
在特定实施方案中，本发明核酸分子可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链受到修饰以提高例如分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，可修饰核酸的脱氧核糖磷酸酯主链来生成肽核酸(见Hyrup等人，Bioorganic &Medicinal Chemistry(1996)4：5)。本文所用的术语“肽核酸”或“PNA”是核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸酯主链被换成假肽主链且仅有四种天然核碱基被保留下来。据察，PNA的中性主链可允许DNA和RNA的特异杂交在低离子强度下进行。PNA寡聚物的合成可根据上述Hyrup等人(1996)；Perry-O’Keefe等人，Proc Natl Acad Sci USA(1996)93：14670中所述的标准固相肽合成法进行。
PNA可用于治疗和诊断应用。例如，PNA可作为基因表达的序列特异性调节的反义或抗基因试剂，用来例如诱导转录或翻译抑制或抑制复制。还可以使用本发明的PNA。PNA可用来例如通过PNA引导的PCR锁止(clamping)分析基因中单个碱基对突变；当与其它酶(例如S1核酸酶(上述Hyrup等人(1996))联用时，PNA还可作为人工限制酶，或作为DNA序列和杂交的探针或引物(上述Hyrup等人(1996))；上述Perry-O’Keefe等人(1996)。
在另一个实施方案中，本发明的PNA通过结合亲脂性或其它辅助基团、形成PNA-DNA嵌合体，或使用脂质体或本领域已知的其它药物递送技术而受到修饰，例如增强稳定性、特异性或细胞摄入。PNA-DNA嵌合体的合成如上述Hyrup等人(1996)；Finn等人，Nucleic Acids Res(1996)24(17)：3357-63；Mag等人，Nucleic Acids Res(1989)17：5973；和Peterser等人，Bioorganic Med Chem Lett(1975)5：1119描述。
RNA/核酸干扰
RNA干扰(RNAi)或核酸干扰(NAi)是以短干扰RNA(siRNA)或短干扰核酸(siNA)介导的序列特异性转录后基因沉默过程。认为该过程是进化保守的防御机制，通过该机制，例如，由于病毒感染产生的双链RNA(dsRNA)或双链核酸(dsNA)刺激称作切酶的核糖核酸酶III的活性(Berstein等人，2001，Nature 409：363)。例如，切酶将dsRNA处理成siRNA。切酶可以参与切割涉及翻译控制的21-和22-核苷酸的小时序RNA(stRNA)。RNAi反应还涉及内切核酸酶复合体(即RNA诱导的沉默复合体(RISC))，该复合体切割具有与siRNA反义链互补的序列的目标单链RNA。(Elbashir等人，2001，GenesDev.，15：188)。为取得有效的RNAi或NAi，基于长度、结构、化学组成和序列对siRNA、dsRNA、siNA或dsNA的最佳设计是本领域技术人员已知的(见例如：Chiu and Rana等人，2003，RNA 9：1034-48；Elbashir等人，2001；Parish等人，2000；PCT公开号WO 03/070744，WO01/75164，WO 01/68836，WO 01/49844，WO 01/36646，WO 01/29058，WO00/44914，WO 00/01846，WO 99/32619，WO 99/07409，WO 99/53050；加拿大专利申请号2,359,180，其内容引入本文作为参考)。为提高活性而采取的对siNA或dsNA的一些可能的修饰包括但不限于：3’端二核苷酸突出端，用2’-脱氧核苷酸(2’-H)取代siNA的一条或两条链，以脱氧核糖核苷酸取代siNA双链体的3’端核苷酸突出片段，修饰磷酸酯-糖主链或核苷以包括氮或硫杂原子的至少一种，2’-氨基或2’-O-甲基核苷酸和在dsRNA构建体中含2’-O或4’-C亚甲基桥，以及取代有义和反义链中的4-硫代尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶。PCT公开号WO 01/68836描述了使用内源得到的dsRNA来减弱基因表达的方法。另外，已经提出靶定RNAi的mRNA作为模板从5’到3’合成靶定一种细胞类型中的一种基因的新的dsRNA并可以导致在不同细胞类型中表达的另一基因的RNAi介导的沉默，即称作传递RNAi的现象(Alder等人，2003rna 9：25)。
蛋白质
本发明涉及包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的分离的多肽，其变体、其片段、其类似物或衍生物。
欲制备编码含有具有不同于SEQ ID NO：2的序列(例如变体)的本发明蛋白质的分离的核酸分子，可将一个或多个核苷酸替代、加入或缺失引入SEQ ID NO：1的核苷酸序列，从而将一或多个氨基酸替代、加入或缺失引入编码的蛋白质。例如，豚鼠DP蛋白质中第一和第三个胞内环分别短了三个和五个氨基酸，而在小鼠、人类和大鼠DP蛋白质中这些胞内环都具有相同大小。因此我们可以将其它任何直向同源物中发现的一个或多个核苷酸插入而产生SEQ ID NO：2的变体。
在特定实施方案中，可以分析本发明的突变蛋白质：(1)与信号途径中的蛋白质形成蛋白质：蛋白质相互作用的能力；(2)结合配体的能力；(3)与细胞内靶蛋白质结合的能力，或(4)调节细胞增殖、细胞分化或细胞应答的能力。
可采用标准的细胞纯化技术，通过适当的纯化方案将本发明的天然蛋白质从细胞或组织中分离出来。备选地，可以利用重组DNA技术来容易地产生本发明蛋白质。在另一个备选实施方案中，还可以通过标准肽合成技术化学合成本发明的蛋白质或多肽。
本发明蛋白质的生物活性部分或片段包括肽，该肽包含与SEQ IDNO：2的氨基酸序列基本相同或来自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含氨基酸的数目小于本发明的全长蛋白质，并且显示出本发明蛋白质的至少一种活性。典型地，生物活性部分包含具有本发明蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。例如，本发明蛋白质的生物活性片段可以包含据前人报导为前列腺素类家族的GPCR中特征性保留的(Hirata等人，1994)且也存在于豚鼠DP蛋白质中的两段序列：第二个胞外环中的QYCPGTWCR和第七个跨膜结构域中的RFLSVISIVDPWIFI。本发明蛋白质的生活活性部分可以是多肽，即例如长度为10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。特定的生物活性多肽包括本发明蛋白质的一个或多个鉴定的结构域。此外，其它生物活性部分(其中缺失该蛋白质的其它区域)可通过重组技术制备，以供本发明蛋白质的一种或多种功能活性的评估之用。有关本发明生物相关部分的进一步指导在“实施例3”中提供。
其它有用的蛋白质与SEQ ID NO：2基本相同且保留了SEQ ID NO：2的蛋白质的功能活性但氨基酸序列中因天然等位基因变异或诱变而不同。例如，这样的蛋白质和多肽具有至少一种本文所描述的生物活性。因此，本发明的有用的蛋白质是包括与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少有约65％、75％、85％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且保留了SEQID NO：2的蛋白质的功能活性的蛋白质。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的相一性，可采用序列比对方法来取得最佳比较(例如，可在第一个氨基酸或核酸序列中引入缺口以取得与第二个氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较相应氨基酸位或核酸位上的氨基酸残基或核苷酸。若第一和第二序列的相应位置被相同的氨基酸残基或核苷酸所占据，那么认为这两个分子在该位置上是相同的。两个序列的同一性是这两个序列共有的相同位置数目为函数(即百分数同一性＝相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。
两个序列的百分数同一性可由数学算法求出。用来比较两序列的数学算法的非限制性实例是Karlin算法(见Karlin等人，Proc Natl Acad SciUSA(1990)87：2264，修正版见Karlin等人，Proc Natl Acad Sci USA(1993)90：5873-5877)。该算法已整合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(见Altschul等人，J Mol Bio(1990)215：403)。出于对比目而需要得到缺口比对时，可使用缺口BLAST法，见Altschul等人，NucleicAcids Res(1997)25：3389。另外，可采用PSI-Blast进行迭代搜索来检测分子间的远亲关系。上述Altschul等人(1997)。使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可采用各自程序(诸如XBLAST和NBLAST)的默认参数，见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。序列比较的数学算法的另一个具体的非限制性实例是Myers等的算法(见Myers等人，CABIOS(1988)4：11-17)。该算法已整合到ALIGN程序(2.0版本)，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可利用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12分，缺口罚分为4。
还可以采用与上述方法类似的方法，引入或不引入缺口来确定两个序列的百分数同一性。在计算百分数同一性时，仅计数完全匹配。
本发明还涉及本发明的嵌合或融合蛋白质。本文所用的本发明的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与“非本发明多肽”有效连接的SEQ ID NO：2的多肽。“本发明的多肽”是指具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。“非本发明的多肽”是指具有对应于与SEQ ID NO：2基本不同的蛋白质的氨基酸序列的多肽，例如，与本发明蛋白质不同的并且来自相同或不同生物的蛋白质。在本发明的融合蛋白范围内，本发明的多肽可相应于SEQ ID NO：2的全部或一部分，优选SEQ ID NO：2的至少一个生物活性部分。在融合蛋白的范围内，“有效连接”是指本发明多肽和非本发明多肽在框内相互融合。非本发明多肽可融合于本发明多肽的N-端或C-端。一种有用的融合蛋白利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，其中本发明的多肽融合到GST的C端。此类融合蛋白可方便本发明重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白的范围扩展到免疫球蛋白融合蛋白，其中SEQ ID NO：2的全部或一部分与来自免疫球蛋白家族成员的序列融合。本发明的免疫球蛋白融合蛋白可掺入药物组合物，并施用于受试者以抑制配体与细胞表面上本发明受体蛋白质的相互作用，从而抑制体内受体介导的信号转导。本发明的免疫球蛋白融合蛋白还可用来影响本发明受体的同源配体的生物利用率。抑制配体-受体相互作用可以具有治疗意义，诸如但不限于治疗或调节睡眠、体温、嗅觉功能、激素释放、疼痛、胃肠道疾病、肝病、眼疾(诸如青光眼)、血液疾病(诸如血栓形成)、炎症(包括但不限于哮喘、过敏性鼻炎、气道机能亢进、过敏性皮炎、过敏性结膜炎和慢性阻塞性肺病)。另外，本发明的免疫球蛋白-多肽融合蛋白可作为免疫原而在患者体内产生抗体，纯化配体并在筛选分析中鉴定抑制本发明受体-配体作用的分子
在具体实施方案中，本发明的嵌合或融合蛋白经标准的重组DNA技术产生。例如，按照常规技术(例如使用钝端或交错端末端进行连接、限制酶消化来提供适当的末端、按需要填充粘性末端、进行碱性磷酸酶处理以避免不必要的结合和酶促连接)，将编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一实施方案中，融合基因由常规技术，诸如自动化DNA合成仪合成。另外，可利用锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，该锚定引物在两个连续的基因片段间引发互补突出端，这两个基因片段可以随后退火并再扩增生成嵌合基因序列(见例如上述Ausubel等人)。此外，还可通过商业途径获得许多编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体。编码本发明多肽或其部分的核酸可被克隆到这样的表达载体，使融合部分与本发明的蛋白质在框内连接。
核酸和蛋白质变体
如上文所解释，本发明还涉及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的变体。例如，可采用标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将突变引入SEQID NO：1所表示的氨基酸序列。此外，可对一个或更多预测的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是指一个氨基酸残基被另一个带相似侧链的氨基酸所替代。例如，一个或多个氨基酸可被另一个极性相似的氨基酸(作为功能等同物)所替代而形成沉默改变。本发明多肽的氨基酸序列中氨基酸的取代氨基酸可选自该氨基酸所属家族的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这样的改变将预计不会影响由聚丙烯酰胺凝胶电泳或等电点法确定的表观分子量。
尤其优选的替代为：
-Lys替代Arg和反之亦然，以保留正电荷；
-Glu替代Asp和反之亦然，以保留负电荷；
-Ser替代Thr，以保留自由-OH；以及
-Gln替代Asn，以保留自由NH2。
其它替代可使用合成(即非天然发生的)的氨基酸。
还可以引入氨基酸替代来得到具有尤其优选的性质的氨基酸。例如，可将Cys引入潜在与另一个Cys形成二硫键的位置。可将His引入作为特定“催化”位点(即His可作为酸或碱，它是生物化学催化中最常用的氨基酸)。可引入Pro，利用其特殊的平面结构而诱导蛋白质结构中的β-转角。
还可将突变随机引入SEQ ID NO：1编码序列的全部或片段(诸如通过饱和诱变)，然后对所生成的突变体进行生物活性筛选，鉴定保留了活性的突变体。诱变之后，可以重组表达编码蛋白质，然后确定蛋白质的活性。
本发明的变体可作为激动剂(模拟物)或拮抗剂。本发明蛋白质的变体可通过诱变生成，例如本发明蛋白质的离散点突变或截短。本发明蛋白质的激动剂可保留与本发明天然发生的蛋白质基本相同或部分生物活性。拮抗剂可竞争地与细胞信号级联下游或上游的成员(包括本发明蛋白质)结合，从而抑制本发明天然发生的蛋白质的一种或多种活性。因此，用具有有限功能的变体进行治疗可引起特定的生物效应。用具有本发明天然发生的蛋白质的部分生物活性的变体进行治疗受试者，副作用要小于用该蛋白质的天然发生的性质进行的治疗。
欲鉴定具有激动剂(模拟物)或拮抗剂功能的本发明蛋白质的变体，可以筛选本发明蛋白质的突变体，例如截短的突变体的组合文库，考察蛋白质的激动剂或拮抗剂活性。在一个实施方案中，通过核酸水平上的组合诱变生产本发明蛋白质的变体的多样化文库，该变体文库由多样化的基因文库编码。变体的多样化文库的制备方法有，例如，通过酶催化法使合成的寡核苷酸混合物连接到基因序列，这样，简并组的本发明的潜在核酸序列表达为含有该组本发明序列的单独多肽或备选地一组更大的融合蛋白(例如用于噬菌体展示)。由多种方法可以用于从简并寡核苷酸序列来生成本发明潜在变体文库。简并基因序列的化学合成可由自动化DNA合成仪进行，该合成基因然后连接到适当的表达载体。利用一组简并基因可以允许在一个混合物中提供编码所希望组的本发明潜在核酸序列的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见例如Narang，Tetrahedron(1983)39：3；Itakura等人，Ann Rev Biochem(1984)53：323；Itakura等人，Science(1984)198：1056；Ike等人，Nucleic Acid Res(1983)11：477)。
另外，蛋白质编码序列的片段文库可用于生成片段的多样化群体，供筛选及随后选择本发明蛋白质的变体。在一个实施方案中，编码序列片段文库的建立包含在一定的条件下(在此条件下，每个分子仅发生约一个切口)用核酶处理本发明编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性形成双链DNA，其包括来自不同切割产物的有义/反义对，用S1核酸酶处理而从重新形成的双链体除去单链部分并将所生成的片段文库连接到表达载体。由此方法即可得到表达文库，其编码本发明蛋白质的N-端和多种大小的内部片段。
用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物和筛选cDNA文库以获得具有所选特性的基因产物的一些技术在本领域是公知的。此类技术可以经修改适应于快速筛选通过组合诱变本发明蛋白质产生的基因文库。适于高通量分析筛选大基因文库的最广泛使用的技术一般包括将基因文库克隆入复制型表达载体，用所得的载体文库转化合适的细胞并在一定的条件下表达组合基因，其中对所需活性的检测有利于分离编码基因的载体，其中所述基因的表达产物已得以检测。递归整体诱变(recursiveensemble mutagenesis；REM)为在文库中增加功能突变体的频率的技术，该技术可用于与筛选测试结合来鉴定本发明的变体蛋白质(Arkin等人，美国国家科学院院报(1992)89：7811-7815；Delgrave等人，蛋白质工程(ProteinEngineering)(1993)6(3)：327-331)。
本发明蛋白质的类似物及衍生物
此外，本发明亦包括以化学修饰法制备的本发明蛋白质衍生物或类似物。本发明之蛋白质可通过使蛋白质部分连接一或多个化学部分予以衍生化。
适用于衍生化之化学部分可选自水溶性聚合物，从而使该GAVE6类似物或衍生物于水性环境(例如生理环境)中不会沉淀。任选地，该聚合物为可药用的。本领域技术人员可基于例如该聚合物/成分缀合物是否将于治疗上使用，以及如果使用的话，所需剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性等考虑因素选择所需之聚合物。对于本发明蛋白质，这些可使用本文提供的试验予以确定。在此处具有用途的水溶性聚合物的实例包括，但不限于，聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧杂环己烷、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或者随机共聚物)、dextran、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于在水中之稳定性而于制备上具有优点。
聚合物可具有任何分子量，并可是分枝或不分枝的。以聚乙二醇而言，为了容易操作及制备，优选之分子量介于约2kDa与约100kDa之间(“约”一词表明聚乙二醇制品中，有些分子较所述分子量重，有些则较轻)。视所需治疗性质(例如，所需缓释持续时间、对生物活性的影响(若有的话)、操作容易性、抗原性的程度或缺乏、及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物之其它已知效应)而定，可使用其它大小。
如此连接于本发明蛋白质之聚合物分子的数目可不同，并且本领域技术人员能够确定其对功能的影响。可以使用相同或不同的化学部分(例如，聚合物，如不同重量之聚乙二醇)予以单一衍生化，或可提供二-、三-、四-衍生化或某种衍生化组合。聚合物分子对本发明蛋白质分子之比例可不同，其于反应混合物中之浓度亦可以不同。通常最适比例(就其中无过量未反应成分或诸成分及聚合物的反应的效率而言)由例如所需衍生化程度(例如，单、二-、三-、等)、所选聚合物分子量、聚合物是不分枝的或是分枝的、及反应条件等因素决定。
聚乙二醇分子(或其它化学部分)连接于本发明蛋白质时应虑及对功能域或抗原性域的影响。本领域技术人员有许多可运用的连接方法，例如，并入本文供参考用之EP 0 401 384(将PEG偶联于G-CSF)，亦参见Maliket al.，1992，Exp.Hematol.20：1028-1035(记载使用tresyl chloride之GM-CSF的聚乙二醇化)。举例而言，聚乙二醇可藉反应基，例如，游离氨基或羧基，经由氨基酸残基共价结合。反应基为可与活化之聚乙二醇分子结合者。具有游离氨基之氨基酸残基包括赖氨酸残基及N-末端氨基酸残基；具有游离羧基者包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基及C-末端氨基酸残基。亦可使用巯基作为反应基，以连接聚乙二醇分子。用于治疗用途时优选连接于氨基，例如连接于N-末端或赖氨酸基团。
可能特别需要N-末端经化学修饰之本发明蛋白质。使用聚乙二醇举例说明本发明组合物，可对多种聚乙二醇分子(由分子量、分支情况等)、反应混合物中聚乙二醇分子对本发明蛋白质分子之比例、所进行的聚乙二醇化反应之类型、及获得选定N-末端聚乙二醇化蛋白质之方法予以选择。获得N-末端聚乙二醇化制品(亦即，如果需要，则自其它单聚乙二醇化部分中分离此部分)之方法可为从聚乙二醇化蛋白质分子群中纯化N-末端聚乙二醇化物质。选择性N-末端化学修饰可通过利用可以用于衍生化的不同类型伯氨基团之不同反应性(赖氨酸对N-末端)籍由还原性烷化作用达成。于适当反应条件下，可以用含羰基的聚合物对本发明蛋白质N-末端进行实质上的选择性衍生化。例如，于容许利用赖氨酸残基的ε-氨基与N-末端残基的α-氨基间的pKa差异之pH下进行反应，可将本发明蛋白质选择性地N-末端聚乙二醇化。利用此选择性衍生化，可控制水溶性聚合物与本发明蛋白质之连接：与聚合物之缀合主要发生于N-端，而其它反应性基团，例如赖氨酸侧链氨基，则无明显的修饰作用发生。使用还原性烷化作用，水溶性聚合物可属上述类型，并且应具有供偶联于本发明蛋白质之单一反应性醛。可使用含单一反应性醛的聚乙二醇丙醛。
抗体
可使用分离之本发明蛋白质或其部分或片段作为免疫原，使用制备多克隆与单克隆抗体之标准技术产生结合本发明蛋白质之抗体。此处所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原结合位点的分子或其片段，其中所述抗原结合位点特异性结合抗原如本发明的蛋白质。特异性结合本发明蛋白质的分子是在天然含有本发明蛋白质的样品如生物样品中结合本发明蛋白质而实质上不结合其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括用酶如胃蛋白酶处理抗体可产生的F(ab)和F(ab′)2片段。本发明提供以本发明蛋白质、其变体、其片段、或其类似物或衍生物作为免疫原之多克隆、单克隆及嵌合型抗体。嵌合抗体优选用于治疗人类疾病或病症，因为相对异种抗体而言，人类或人源化抗体自身引起免疫反应(特别是过敏反应)的可能性要小。
可使用全长本发明蛋白质作为免疫原，或者，本发明提供本发明之抗原性肽片段作为免疫原。本发明之抗原肽包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的至少8个(优选地10、15、20、30或更多个)氨基酸残基，并涵盖表位，从而对该肽产生的抗体可以与本发明蛋白质形成特异免疫复合体。
免疫原一般通过用该免疫原免疫合适的受试者(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)被用于制备抗体。合适的免疫原性制品可包含如重组表达的本发明蛋白质或化学合成的本发明多肽。该制品还可包含佐剂，诸如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用免疫原性制品免疫合适的受试者可诱导抗本发明蛋白质的多克隆抗体反应。
本发明之抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、或嵌合抗体。此处所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群这样的抗体分子，其只包含一种可与本发明蛋白质特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。这样单克隆抗体组合物一般显示出与特定的本发明蛋白质表位的单一结合亲和性。
多克隆抗体可如上所述通过用本发明免疫原免疫合适的受试者而制备。可用标准技术，如使用固定化本发明蛋白质的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，在一段时间内监测接受免疫的受试者体内的抗体效价。如果需要，可从哺乳动物(如从血液)分离针对本发明蛋白质的抗体分子，并用公知的技术如蛋白A层析法进一步纯化，以获得IgG级分。免疫后在合适的时间，如当抗体效价最高时，可从受试者获得抗体产生细胞并通过标准技术利用此细胞制备单克隆抗体，所述技术有例如Kohler等人，自然(Nature)(1975)256：495-497最初描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kohler等人，今日免疫学(Immunol Today)(1983)4：72)，EBV杂交瘤技术(Cole等人，单克隆抗体和癌治疗(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)或三瘤(trioma)技术。产生杂交瘤的技术是公知的(一般参见：免疫学最新技术(Current Protocols inImmunology)(1994)Coligan等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，NY)。简而言之，将永生细胞系(通常为骨髓瘤)与来自如上所述的本发明免疫原免疫过的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，并筛选所得杂交瘤细胞的培养上清液来鉴定产生结合本发明蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤。
可使用任一熟知的用于融合淋巴细胞和永生细胞系的方法产生单克隆抗体(参见如免疫学最新技术，见上文；Galfre等人，自然(1977)266：550-552；Kenneth，单克隆抗体：生物学分析中的新方面(Monoclonal Antibodies：ANew Dimension In Biological Analyses)，Plenum Publishing Corp.，纽约，N.Y.(1980)；和Lerner，耶鲁生物医学杂志(Yale J Biol Med)(1981)54：387-402)。而且，普通技术人员可以理解也可用此类方法的诸多改变后的方法。一般永生细胞系(如骨髓瘤细胞系)来自与淋巴细胞相同的哺乳动物种类。例如，鼠杂交瘤可通过用本发明免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴细胞与永生小鼠细胞系如骨髓瘤细胞系融合而制备，其中骨髓瘤细胞系对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT培养基”)敏感。许多骨髓瘤细胞系中的任一种都可按照标准技术用作融合伙伴(partner)，如P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可从ATCC获得。一般，用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合。融合所得的杂交瘤细胞然后用HAT培养基选择，其中HAT培养基杀死未融合的和非生产性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞由于未被转化几天后死去)。本发明的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞可通过筛选骨髓瘤细胞培养物上清液中结合本发明蛋白质的抗体进行检测(例如应用标准的ELISA试验)。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的备选方案，可以应用本发明蛋白质筛选重组组合免疫球蛋白质文库(如抗体噬菌体展示文库)，由此得以分离结合本发明蛋白质的免疫球蛋白文库成员，从而鉴定和分离到单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可从供应商处获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及Stratagene“SurfZAP”噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
此外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例是本领域技术人员已知的(见，例如Fuchs等，Bio/Technology(1991)9：1370-1372；Hay等，Hum Antibody Hybridomas(1992)3：81-85；Huse等，科学(Science)(1989)246：1275-1281；Griffiths等，EMBO J(1993)25(12)：725-734；美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809，将它们的公开引入本文作为参考)。
此外，重组抗体，包括如包含人和非人部分的嵌合的和人源化的单克隆抗体可以使用标准重组DNA技术制备。该类嵌合的和人源化的单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用如下文献中描述的方法产生：PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等，科学(1988)240：1041-1043；Liu等，美国国家科学院院报(1987)84：3439-3443；Lin等，免疫学杂志(1987)139：3521-3526；Sun等，美国国家科学院院报(1987)84：214-218；Nishimura等，癌研究(Canc Res)(1987)47：999-1005；Wood等，自然(1985)314：446-449；Shaw等，国家癌研究所杂志(J Natl CancerInst)(1988)80：1553-1559；Morrison，科学(1985)229：1202-1207；Oi等，生物/技术(Bio/Techniques)(1986)4：214；美国专利号5,225,539；Jones等，自然(1986)321：552-525；Verhoeyan等，科学(1988)239：1534；和Beidler等，免疫学杂志(J Immunol)(1988)141：4053-4060；将它们的公开引入本文作为参考。
特别需要完全人抗体以用于治疗人类患者。该抗体可应用转基因小鼠制备，所述转基因小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因，而能够表达人的重链和轻链基因。该转基因小鼠可以用选择的抗原(如本发明蛋白质的全部或一部分)以标准方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可由常规的杂交瘤技术获得。位于转基因小鼠中的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中进行重排，并随后经历类型转换和体细胞突变。这样，应用该表位可鉴定出抑制本发明蛋白质活性的抗体。克隆非人抗体的重链和轻链并用于构建噬菌体展示的Fab片段。例如，可将重链基因克隆到质粒载体中，以使细菌分泌重链。可将轻链基因克隆到噬菌体外壳蛋白基因中以使其可表达于噬菌体表面。使用与人轻链库(随机收集的)融合的噬菌体感染表达非人重链的细菌。产生的后代噬菌体展示杂合抗体(人轻链/非人重链)。利用选择的抗原淘选能结合所选抗原的噬菌体。为鉴定出该噬菌体可能需要几轮筛选。
从选出的可结合所选抗原的噬菌体中分离人轻链基因。然后利用选出的人轻链基因指导人重链基因的筛选，方法如以下所述。将选出的人轻链基因插入载体进行细菌表达。表达所选人轻链的细菌用融合了人重链库的噬菌体进行感染。产生的子代噬菌体展示人抗体(人轻链/人重链)。
接着，使用选出的抗原淘选可结合所选择抗原的噬菌体。选出的噬菌体展示出完全人抗体，该抗体识别的表位与最初选择的非人单克隆抗体所识别的表位相同。分离编码重链和轻链的基因，并可进一步操作用于制备人抗体。该技术参见Jespers等的描述(生物/技术(Bio/Technology)(1994)12：899-903)。
抗体(如单克隆抗体)可通过标准技术(如亲和层析或免疫沉淀)用来分离本发明蛋白质。抗-本发明蛋白质的抗体可以帮助从细胞中纯化天然的蛋白质和表达于宿主细胞中的重组产生的蛋白质。此外，抗体可用于检测本发明蛋白质(如在细胞裂解物或细胞上清液中)以评估该蛋白质的表达丰度和表达方式。抗体可用于诊断中作为临床试验方法的一部分来监测组织中的蛋白质水平，以便例如，确定特定治疗方案的疗效。如下文所述，将抗体与可检测的物质偶联可方便检测。
可检测的标记物
任选地，本发明的分离核酸分子、本发明多肽和本发明抗体、以及这些部分之片段，可进行可检测标记。适当标记物包括酶、荧光团[例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红(TR)、罗丹明、游离或螯合的镧系盐(特别是Eu3+)等]、发光团、放射性同位素、螯合剂、染料、胶体金、乳胶颗粒、配体(例如，生物素)、生物发光物质、及化学发光剂。使用对照标志时，受体及对照标志可使用相同或不同的标记物。
使用放射性标记物，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、及186Re之情形下，可使用目前已知可用之计数方法。于标记物为酶的情形下，可利用本领域中目前使用之比色、分光光度、荧光分光光度、电流测定或气体定量测定等技术之任一者达成检测。
直接标记物为根据本发明可用的可检测标记物的一个实例。直接标记物被定义为呈天然状态时，以肉眼或藉助于光学滤片及/或通过施加刺激(例如，以U.V.光引起荧光)易于被看见之实体。根据本发明可用的有色标记物的实例包含金属溶胶颗粒，例如，如Leuvering(美国专利4,313,734)所述之金溶胶颗粒；如Gribnau et al.(美国专利4,373,932)与May et al.(WO88/08534)所述之染料溶胶颗粒；如May(文献同前)、Snyder(EP-A 0 280 559与0 281 327)所述之染色乳胶；或如Campbell et al.(美国专利4,703,017)所述之包封于脂质体中之染料。其它直接标记物包括放射性核苷酸、荧光基团或发光基团。除了这些直接标记装置外，包括酶在内的间接标记物亦可根据本发明予以使用。多种酶联免疫吸附测定法为本领域中悉知，例如，碱性磷酸酶与辣根过氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、脲酶，这些及其它实例已由Eva Engvall于Methods in Enzymology，70，419-439，1980之Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT及美国专利4,857,453详细讨论。
用于本发明之其它可检测的标记物包括磁珠或磁共振成像标记物。
于另一实施方案中，可于本发明分离多肽、本发明抗体、或其片段上，产生供32P标记用的磷酸化位点，例如，见述于欧洲专利号0372707。
如此处所例示，蛋白质，包括抗体，可通过代谢标记法予以可检测地标记。代谢标记发生于在补充代谢性标记物(例如[35S]-甲硫氨酸或[32P]-正磷酸盐)的培养基存在下体外培养表达该蛋白质的细胞的期间。除了以[35S]-甲硫氨酸进行代谢性(或生物合成性)标记外，本发明还考虑以[14C]-氨基酸及[3H]-氨基酸(其中氚取代于非不稳定位置)进行标记。
除了上面引用的标记外，还可以用抗体可识别的抗原肽标记该抗体。实例包括HA标记和FLAG标记。
重组表达载体和宿主细胞
本发明另一方面涉及含编码SEQ ID NO：1(或其一部分)的核酸的载体，优选表达载体。如上所解释的，载体的一个类型为“质粒”，是指可连入额外DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一类型为病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连入病毒基因组中。某些载体可在宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他的载体(如非游离型的哺乳动物载体)在导入宿主细胞内时整合到宿主细胞基因组中，并因此随宿主基因组一同复制。此外，表达载体能够指导与其有效连接的基因的表达。一般，重组DNA技术中应用的表达载体常为质粒(载体)形式。然而，本发明意在包括其他形式的表达载体，如可执行等同功能的病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸分子，所述核酸分子以适于在宿主细胞内表达的形式存在。这意味着本发明的重组表达载体包括一段或多段基于用于表达的宿主细胞而选出的调控序列，该序列与待进行表达的核酸有效连接。在重组表达载体内，“有效连接”意指目的核苷酸序列连接到调控序列上，其连接方式允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞中后在该宿主细胞中表达)。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(如多聚腺苷酸化信号)。该调控序列在如Goeddel，基因表达技术：酶学方法(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)，185卷，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。调控序列包括那些指导核苷酸序列在多种宿主细胞中进行组成型表达的序列(如组织特异的调控序列)。本领域内的技术人员应当理解，表达载体的设计将取决于选择进行转化的宿主细胞、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞中以产生此处描述的核酸编码的蛋白质或肽。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达SEQ IDNO：1或者其部分，所述细胞有例如，细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞在之前的Goeddel的文献中有讨论。备选地，重组表达载体可应用如噬菌体调控元件和蛋白质在体外进行转录和翻译，其中所述元件和蛋白质如T7启动子和/或T7聚合酶。
蛋白质在原核细胞内的表达大都在大肠杆菌中使用载体进行，所述载体含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体可在其编码的蛋白质上添加一些氨基酸，这些氨基酸通常添加到重组蛋白的氨基端。此类融合载体一般有三种用途：1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；和3)在亲和纯化中作为配体协助重组蛋白的纯化。通常，融合表达载体中在融合部分和重组表达蛋白的连接处导入有一个蛋白水解切割位点，从而使得可以在纯化融合蛋白后使重组蛋白得以和融合部分分离。此类酶和关联识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith等，基因(Gene)(1988)67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，三者分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组蛋白上。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等，基因(Gene)(1988)69：301-315)和pET 11d(Studier等，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)，AcademicPress，San Diego，California(1990)185：60-89)。pTrc载体上靶基因的表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子起始转录。
使大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一个策略是在蛋白水解切割重组蛋白的能力被削弱的宿主中表达蛋白(Gottesman，基因表达技术：酶学方法，Academic Press，San Diego，California(1990)185：119-128)。另一策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，以使编码每一氨基酸的各密码子都为优选在大肠杆菌中应用的密码子(Wada等，核酸研究(1992)20：2111-2118)。对本发明核酸序列进行此类改变可通过标准的DNA合成技术完成。
在另一实施方案中，本发明的表达载体为酵母表达载体。用于在酵母(如酿酒酵母(S.cerevisiae))中实现表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6：229-234)、pMFa(Kurjan等，细胞(Cell)(1982)30：933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
备选地，可应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达SEQ ID NO：1或者其部分。现有可用于在培养的昆虫细胞(如Sf 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)(1983)3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow等，病毒学(Virology)(1989)170：31-39)。
而在另一实施方案中，本发明的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中进行表达。应用于此处的哺乳动物表达载体的实例包括，但当然不限于pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329：840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常由病毒调控元件提供。例如，通常应用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。对于其他适用于原核和真核细胞的表达系统，见之前Sambrook等的文献的第16和17章。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优选地在特定的细胞类型中表达(例如，应用组织特异的调控元件来表达核酸)。组织特异的调控元件在本领域内是公知的。合适的组织特异性启动子的非限定实例包括白蛋白启动子(肝脏特异；Pinkert等，基因进展(Genes Dev)(1987)1：268-277)，淋巴特异的启动子(Calame等，Adv Immunol(1988)43：235-275)，特别是T细胞受体(Winoto等，EMBO J(1989)8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji等，细胞(Cell)(1983)33：729-740；Queen等，细胞(Cell)(1983)33：741-748)的启动子，神经元特异的启动子(如神经丝启动子；Byrne等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1989)86：5473-5477)，胰腺特异的启动子(Edlund等，科学(Science)(1985)230：912-916)和乳腺特异的启动子(如奶乳清蛋白启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请号264,166)。发育调节的启动子也包括在内，如鼠hox启动子(Kessel等，科学(Science)(1990)249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes等，基因进展(Genes Dev)(1989)3：537-546)。将前面参考文献的每一个的公开引入本文作为参考。
本发明还提供含本发明的DNA分子的重组表达载体，其中该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是，DNA分子有效连接到调控序列上，该连接方式使得可以表达(通过转录该DNA分子)产生与本发明的mRNA反义的RNA分子。可以对与反义方向克隆的核酸有效连接的调控序列进行选择以指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达。例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列以指导反义RNA实现组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中反义核酸被置于高效调控区域的控制下，其活性由载体所导入的细胞的类型决定。使用反义基因进行基因表达调控的讨论见Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。
本发明的另一方面涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可互换使用。应当理解，该术语不仅指特定的受试细胞，也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在传代过程中可发生某些改变，这样，后代实际上可能并非与亲代细胞相同，但其仍包括在此处所用术语的范围之内。
宿主细胞可为任意的原核或真核细胞。例如，本发明的蛋白质可在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、293细胞或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞为本领域内的技术人员公知。载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”意指本领域内公知的各种将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、转导、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染或电穿孔。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据应用的表达载体和转染技术，仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。为鉴定和筛选整合体，一般将编码选择标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些可赋予药物抗性的基因，所述药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可与编码SEQ ID NO：1或者其部分的基因位于同一载体上被导入宿主细胞或编码选择标记的核酸可以导入不同的载体上。被导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选进行鉴定(例如，掺入了选择标记物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)本发明的蛋白质。因此，本发明进一步提供了通过应用本发明的宿主细胞产生SEQ ID NO：2或者其部分的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码SEQ ID NO：1的重组表达载体已经导入了该细胞)，由此使本发明的蛋白质得以产生。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离本发明的蛋白质。
在另一实施方案中，本发明包含诱导型表达系统，其用于其他亚克隆到修饰表达载体上的蛋白质的重组表达。例如，包含突变G蛋白的宿主细胞(例如，酵母细胞、Y2肾上腺皮质细胞和cyc-S49，见美国专利号6,168,927B1，5,739,029和5,482,835；Mitchell等，美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad USA)(1992)89(19)：8933-37和Katada等，生物化学杂志(J BiolChem)(1984)259(6)：3586-95)用包含编码SEQ ID NO：1的核酸序列的第一表达载体进行转导，其中SEQ ID NO：2在宿主细胞中进行功能表达。尽管表达的本发明的蛋白质具有组成型活性，但突变的存在不允许信号转导发生；即，不能激活G蛋白指导的下游级联放大(例如，不能激活腺苷酰环化酶)。随后，用第二表达载体转导包含SEQ ID NO：1的宿主细胞。除待通过此诱导型系统进行表达的目的基因外，第二载体还包含与宿主细胞G蛋白突变体互补的结构基因(即，哺乳动物或酵母的功能性Gs、Gi、Go或Gq，例如，见PCT公开号WO 97/48820；美国专利号6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835，并并且将它们完整引入本文作为参考)。第二载体的互补结构基因为可诱导的；即，处于外源添加的组分(如四环素、IPTG、小分子等，见之前的Sambrook等的文献)的控制下，所述组分可以激活与所述互补结构基因有效连接的启动子。加入诱导剂后，该互补结构基因编码的蛋白质进行功能性表达，结果具有组成型活性的本发明的蛋白质将形成复合体，导致适当的下游通路的激活(例如，形成第二信使)。第二载体包含的目的基因具有有效连接的启动子，所述启动子可以由合适的第二信使(如CREB和AP1元件)激活。这样，当第二信使积聚时，目的基因上游的启动子被激活以表达所述基因的产物。缺乏诱导剂时，目的基因的表达关闭。
在一个特定的实施方案中，用于此诱导型表达系统的宿主细胞包括但不限于，S49(cyc-)细胞。尽管本发明考虑包含G-蛋白突变的细胞系，但也可以人工制备/构建出合适的突变体(见针对酵母细胞的美国专利号6,168,927B1、5,739,029和5,482,835)。
在相关的方面，细胞用与如下cDNA有效连接的载体转化，所述cDNA包含编码SEQ ID NO：2中所示蛋白质的序列。该系统包含的第一和第二载体可以考虑包括但不限于，pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329：840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6：187-195)、pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6：229-234)、pMFa(Kurjan.，细胞(Cell)(1982)30：933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
在一个相关方面，宿主细胞可通过适宜的方法转染，其中转染可导致功能性蛋白质的表达(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因转移和表达：实验室指南(Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual)，Stockton Press，New York，NY，1990)。该“功能性蛋白质”包括但不限于，一经表达即可与G-蛋白形成复合体的蛋白质，其中该G-蛋白调节第二信使的形成。于本文中具有用途的其它宿主细胞转染方法包括，但当然不限于，转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、使用基因枪、或DNA载体转运子(参见，例如，Wu et al.，1992，J.Biol.Chem.267：963-967；Wu and Wu，1988，J.Biol.Chem.263：14621-14624；Hartmut et al.，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日申请)。
广泛种类的启动子于本发明中具有用途。的确，本发明多肽之表达可由本领域中已知之任何启动子/增强子元件控制，但这些调控元件必须在选定供表达用的宿主中具有功能。可用于控制表达之启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中所含的启动子(Yamamoto et al.，1980，Cell22：787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因之调控序列(Brinster etal.，1982，Nature 296：39-42)、原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)、或tac启动子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)；亦参见《Scientific American》中“来自重组细菌的有用蛋白质”，1980，242：74-94；得自酵母或其它真菌之启动子元件例如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；及具有组织特异性且已用于转基因动物之动物转录控制区域：于胰腺腺泡细胞中具活性之弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift et al.，1984，Cell 38：639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；于胰腺β细胞中具活性之胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)、于淋巴细胞中具活性之免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedl et al.，1984，Cell 38：647-658；Adames et al.，1985，Nature 318：533-538；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、于睾丸、乳房、淋巴与肥大细胞中具活性之小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域(Leder et al.，1986，Cell 45：485-495)、于肝脏中具活性之白蛋白基因控制区域(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1：268-276)、于肝脏中具活性之甲胎蛋白基因控制区域(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer et al.，1987，Science 235：53-58)、于肝脏中具活性之α1抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1：161-171)、于髓样细胞中具活性之β-珠蛋白基因控制区域(Mogram et al.，1985，Nature 315：338-340；Kollias et al.，1986，Cell 46：89-94)、于大脑少突胶质细胞中具活性之髓鞘碱性蛋白质基因控制区域(Readhead et al.，1987，Cell 48：703-712)、于骨骼肌中具活性之肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Sani，1985，Nature 314：283-286)、及于下丘脑中具活性之促性腺素释放激素基因控制区域(Mason et al.，1986，Science 234：1372-1378)。
含本发明核酸分子之表达载体可由四种一般方法予以鉴定：(a)所需质粒DNA或特定mRNA之PCR扩增、(b)核酸杂交、(c)存在或不存在选择标记基因的功能、及(d)插入序列之表达。第一方法中，核酸可利用PCR扩增以便扩增产物的检测。第二方法中，插入表达载体中的外源基因之存在可通过使用包含与插入的标记基因同源的序列的探针进行核酸杂交予以鉴定。第三方法中，重组载体/宿主系统可根据由载体中插入外源基因引致的某些“选择标记”基因功能(例如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、杆状病毒中包含体的形成等)之存在与否予以鉴定和挑选。于另一实例中，若编码本发明的蛋白质、其变体、或其类似物或衍生物之核酸插入载体之“选择标记”基因序列内，则含该插入物之重组体可由不存在该基因功能予以鉴定。第四方法中，只要表达的蛋白质呈现功能活性构象，则重组表达载体可藉测定由重组载体表达的基因产物之活性、生化或免疫学特征予以鉴定。
广泛种类的宿主/表达载体组合可用于表达本发明之DNA序列。有用的表达载体，举例而言，可由染色体片段、非染色体的及合成的DNA序列组成。适当之载体包括SV40之衍生物与已知细菌质粒，例如，大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith et al.，1988，Gene 67：31-40)、pMB9及其衍生物、质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如，λ噬菌体的许多衍生物，例如，NM989，及其它噬菌体DNA，例如，M13与丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒例如2μ质粒或其衍生物；用于真核生物细胞之载体，例如用于昆虫或哺乳动物细胞之载体；由质粒与噬菌体DNA的组合衍生之载体，例如经修饰使用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒等。
例如，于杆状病毒表达系统中，非融合转移载体，例如但不限于pVL941(BamH1克隆位点；Summers)、pVL1393(BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglII、及PstI克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、及BamH1克隆位点；Summers和Invitrogen)、及pBlueBacIII(BamH1、BglII、PstI、NcoI、及HindIII克隆位点，可具有蓝/白重组体筛检；Invitrogen)，及融合转移载体，例如但不限于pAc700(BamH1与KpnI克隆位点，其中BamH1识别位点由起始密码子开始；Summers)、pAc701与pAc702(与pAc700相同，但读框不同)、pAc360[多角体蛋白起始密码子下游36碱基对BamH1克隆位点；Invitrogen(195)]、及pBlueBacHisA、B、C[三个不同读框，具有BamH1、BglII、PstI、NcoI、及HindIII克隆位点，供ProBond纯化之N-末端肽，及噬菌斑蓝/白重组体筛检；Invitrogen(220)]均可使用。
考虑用于本发明之哺乳动物表达载体包括具有可诱导的启动子[例如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子]之载体，例如，具有DHFR表达载体之任何表达载体、或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，例如pED[PstI、SalI、SbaI、SmaI、及EcoRI克隆位点，载体表达克隆基因与DHFR二者；参见Kaufman，Current Protocols in Molecular Biology，16.12(1991)]。或者，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亚磺酰亚胺共扩增载体，例如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、及BclI克隆位点，其中载体表达谷氨酰胺合成酶与克隆基因；Celltech)。于另一实施方案中，可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下指导附加体表达之载体，例如pREP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及KpnI克隆位点、组成型RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pCEP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及KpnI克隆位点、组成型hCMV立即早期基因、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及BamH1克隆位点、可诱导之金属硫蛋白Iia基因启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pREP8(BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheI、及KpnI克隆位点、RSV-LTR启动子、组氨醇选择标记；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及BamH1克隆位点、RSV-LTR启动子、G418选择标记；Invitrogen)、及pEBVHis(RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记、经由ProBond树脂可纯化及以肠激酶可切割的N-端肽；Invitrogen)。用于本发明之可选择哺乳动物表达载体包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、及Apa1克隆位点、G418选择；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位点、G418选择；Invitrogen)等。根据本发明可以使用之痘苗病毒哺乳动物表达载体(参见，kaufmun，1991，文献同前)包括但不限于pSC11(SmaI克隆位点、TK-及β-gal选择)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、及HindIII克隆位点；TK-及β-gal选择)、及pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHI、及Hpa克隆位点；TK或XPRT选择)。
根据本发明亦可使用酵母表达系统来表达本发明的蛋白质、其变体、或其类似物或衍生物。例如，仅举二例如下，非融合pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、KpnI、及HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI、及HindIII克隆位点、以ProBond树脂纯化及以肠激酶切割的N-端肽；Invitrogen)，均可根据本发明予以使用。
一经鉴定及分离出特定之重组DNA分子，便可使用本领域中已知的数种方法扩增它。一旦建立适当的宿主系统及生长条件，即可将重组表达载体增殖并大量制备。如先前之说明，可使用之表达载体包括，惟不限于，下述载体或其衍生物：人类或动物病毒例如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ)、及质粒与粘粒DNA载体，仅举数例如上。
此外，可选择能以所需特定方式调节插入序列的表达、或修饰及加工基因产物之宿主细胞株。不同宿主细胞在蛋白质的翻译与翻译后加工及修饰上[例如，糖基化作用、切割(例如，信号序列之切割)]具有特征性及特异的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质得到所需的修饰及加工。例如，细菌系统中之表达可用于制备无糖基化的核心蛋白质产物。
转基因动物
本发明的宿主细胞也可用于制备非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为受精的卵母细胞或胚胎干细胞，所述细胞中已导入编码对应于SEQ ID NO：1的序列。然后该宿主细胞可以用于产生基因组中导入了外源序列的非人转基因动物，或产生其中内源序列已被改变的同源重组动物。该动物可用以研究本发明蛋白质的功能和/或活性，以及用于鉴定和/或评估本发明蛋白质活性的调节剂。如此处所用，“转基因动物”为非人动物，优选地为哺乳动物，更优选为啮齿动物，如大鼠或小鼠，其中动物的一个或多个细胞包含转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类、绵羊、狗、奶牛、山羊、鸡、两栖动物等。本发明的一个特定实施方案是豚鼠，其过表达本发明的受体并且将可以用作过敏性鼻炎、支气管哮喘或慢性阻塞性肺病的动物模型。
如此处所用，术语“转基因”指外源DNA，其整合到细胞基因组中，并在细胞发育成转基因动物后保留在成熟动物的基因组内。转基因指导编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。如此处所用，“同源重组动物”为非人动物，优选地为哺乳动物，其对应于SEQ IDNO：1的内源基因已通过同源重组发生改变。这在动物发育之前，在内源基因和导入动物细胞(如动物的胚胎细胞)的外源DNA分子间完成。
本发明的转基因动物可以通过使用上述一种转染方法将编码SEQ IDNO：1或其部分的核酸分子导入受精卵母细胞的雄性原核，然后允许卵母细胞在假孕的雌性代孕动物体内发育来产生。所述cDNA序列(如(SEQ ID NO：1)中的序列)可作为转基因导入非人动物的基因组中。备选地，人基因的非人同源物，如小鼠基因可以基于与对应于SEQ ID NO：1的cDNA的杂交分离。内含子序列和多腺苷酸化信号也可包括在转基因内，以提高转基因的表达效率。组织特异的调控序列可以有效连接本发明的转基因以指导本发明蛋白质在特定细胞内表达。用于通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物，尤其诸如小鼠的动物的方法是本领域内的常规操作，且可参见如美国专利号4,736,866和4,870,009、美国专利号4,873,191及Hogan，Manipulating the Mouse Embryo(操作小鼠的胚胎)，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)，这些文献的内容特此作为参考引入本文。可以使用相似的方法产生在基因组中存在转基因和/或在动物的组织或细胞内表达本发明的mRNA的其它转基因动物。起始的转基因动物可用来繁殖其它的携带转基因的动物。此外，携带编码SEQ ID NO：1的转基因的转基因动物可进一步被培育成携带其他转基因的转基因动物。
为生成同源重组动物，制备出含至少部分本发明基因(例如，本发明基因的人或者非人同源物，例如，鼠基因)的载体，所述部分本发明基因中已经导入缺失、添加或替代因而可以改变(如功能性破坏)本发明的基因。在一个特定的实施方案中，设计载体，以致在同源重组后可破坏内源基因的功能(即，不再编码功能蛋白质；也称为“敲除”载体)。
备选地，可设计载体，以便在同源重组后内源基因发生突变或改变但仍编码功能蛋白质(例如，可改变上游调控区域由此改变内源蛋白质的表达)。
在此同源重组载体中，改变的该基因部分在5′和3′端侧翼为该基因的其它核酸序列，从而允许在载体携带的外源基因和存在于胚胎干细胞内的内源基因之间发生同源重组。此其它的侧翼核酸序列的长度应足以使与内源基因的同源重组成功进行。一般地，载体内包括几千碱基的侧翼DNA(5′及3′端)(例如参见，Thomas等，细胞(Cell)(1987)51：503中对同源重组载体的描述)。
将载体导入(如通过电穿孔)胚胎干细胞系，且筛选出导入的本发明基因与内源基因发生同源重组的细胞(例如参见，Li等，细胞(Cell)(1992)69：915)。然后将筛选出的细胞注射到动物(例如，小鼠)的胚泡中以形成嵌合集合体(例如参见，Bradley，畸胎癌和胚胎干细胞：实用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach)，Robertson编辑，IRL，Oxford，(1987)，113-152页)。然后将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎生长足月。在生殖细胞中带有同源重组DNA的子代可用于繁殖动物，通过转基因的生殖系传送，所繁殖的动物的所有细胞都将含有同源重组的DNA。
用于构建同源重组载体和同源重组动物的方法可以进一步参见Bradley，生物/技术中的最新观点(Current Opinion in Bio/Technology)(1991)2：823-829和PCT公开号WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中的描述，将这些文献引入本文作为参考。
在另一实施方案，产生的转基因非人动物可含有选择系统以允许调控转基因的表达。该系统的一个实例为噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。对cre/loxP重组酶系统的描述参见如Lakso等，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad USA))(1992)89：6232-6236。重组酶系统的另一实例为酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重组酶系统(O′Gorrnan等，科学(Science)(1991)251：1351-1355)。如果cre/loxP重组酶系统被用于调控转基因的表达，则需要同时含有编码cre重组酶和选定蛋白的转基因的动物。该动物可通过构建“双重”转基因动物，例如通过两转基因动物的交配(所述动物中一个含有编码选定蛋白的转基因而另一个含有编码重组酶的转基因)来提供。
此处描述的非人转基因动物的克隆可根据以下文献描述的方法制备，Wilmut等，自然(Nature)(1997)385：810-813和PCT公开号WO 97/07668和WO 97/07669(将它们完整引入本文作为参考)。简言之，可以分离转基因动物的细胞如体细胞，诱导其脱离生长周期并进入G0期。然后，通过应用如电脉冲将此静止细胞与去除细胞核的卵母细胞融合，所述去核卵母细胞与分离的静止细胞来自同一动物物种。然后培养重建的卵母细胞以使其发育成桑椹胚或胚细胞，然后将其转移到假孕的雌性代孕动物体内。雌性代孕动物生育的后代即是分离细胞(如体细胞)所来源的动物的克隆。
本发明的额外用途及方法
本发明的核酸分子、蛋白质、蛋白质同源物和抗体以及这些部分的片段可用于一种或多种以下的方法中：a)筛选试验；b)检测试验(例如，染色体作图、组织分型、法医生物学)；c)预测医学(例如，诊断试验、预后试验、监测临床试验和药物基因组学)；和d)治疗方法(如治疗性和预防性的)。本发明的蛋白质与其他细胞蛋白质相互作用，因此可用于(i)调节细胞增殖；(ii)调节细胞分化；和(iii)调节细胞存活，和(iv)调节细胞功能。本发明的分离的核酸分子可用于表达本发明的蛋白质(例如，在基因治疗应用中在宿主细胞中通过重组表达载体表达)，用于检测本发明的mRNA(如在生物样品中)或用于检测本发明的基因中的遗传损伤以及用于调节内源mRNA、DNA或者蛋白质的活性。此外，本发明的蛋白质可用于筛选能调节该蛋白质活性或表达以及治疗特征是内源性蛋白质的产生不足或过量的疾病的药物或化合物。应用本发明也可以针对与野生型蛋白质相比活性降低或异常的蛋白质形式的产生来进行筛选。此外，本发明的抗体可用于检测和分离蛋白质，以及用于调节蛋白质活性。本发明进一步涉及通过以上描述的筛选试验鉴定新型药剂，及其在此处描述的治疗中的用途。
1.检测和筛选试验
存在内源配体时激活G蛋白受体将允许G蛋白受体复合体形成，由此导致GTP结合G蛋白。G蛋白的GTPase结构域可以将GTP缓慢水解为GDP，在正常情况下导致受体失活。但组成型激活的受体会持续将GDP转变成GTP。
G蛋白的不可水解底物[35S]GTPγS可用于监测G蛋白与如下胞膜增强的结合作用，其中所述胞膜表达组成型激活的受体。Traynor和Nahorski报道，[35S]GTPγS可用于监测在存在和缺乏配体时与膜偶联的G蛋白(Traynor等，Mol Pharmacol(1995)47(4)：848-54)。该试验系统优选用于候选化合物的起始筛选，因为该系统可通用于所有G蛋白偶联受体，而不必考虑与受体结合的具体G蛋白的种类。
Gs刺激腺苷酰环化酶，而Gi和Go抑制该酶。如在本领域内所公知的，腺苷酰环化酶催化ATP向cAMP转化；因而，偶联Gs蛋白的组成型活化GPCR将与提高的cAMP细胞水平相关联。备选地，偶联Gi(或Go)蛋白的组成型活化GCPRs将与降低的cAMP细胞水平相关联，参见“突触传导的间接机制(Indirect Mechanism of Synaptic Transmission)”，第8章，从神经元到脑(3rd Ed.)，Nichols等编，Sinauer Associates，Inc.，1992。因此，检测cAMP的试验可用于判定候选化合物是否为受体的逆向激动剂。本领域内已知的多种测定cAMP的方法均可以使用。在一个实施方案中，抗-cAMP抗体用于基于ELISA的试验中。在另一实施方案中，则考虑全细胞第二信使报告系统(见PCT公开号WO 00/22131，并将其完整引入本文作为参考)。一个具体实施方案是下面“实施例5”中描述的SPA试验。
在一个相关的方面，环AMP通过促进cAMP效应DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合而驱使基因表达，其中cAMP效应DNA结合蛋白或转录因子(CREB)然后在称为cAMP效应元件的特异性位点结合启动子并驱动基因表达。因此可构建这样的报告体系，其在报告基因如β-半乳糖苷酶或萤光素酶之前具有包含多个cAMP效应元件的启动子。进一步地，当组成型活化的Gs-连接受体引起cAMP的累积时，则可激活基因并表达报告蛋白。然后可用标准的生物化学试验检测报告蛋白如β-半乳糖苷酶或萤光素酶(PCT公开号WO 00/22131，将其引入本文作为参考)。
其它G蛋白，如Go和Gq，与磷脂酶C的激活相关，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2释放出两个胞内信使：甘油二酯(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3积聚的增加与Gq-相关受体和Go-相关受体的激活相关联(PCT公开号WO 00/22131，将其引入本文作为参考)。检测IP3积聚的试验可用于判定候选化合物是否为Gq-相关受体或Go-相关受体的逆向激动剂。Gq-相关受体还可用AP1报告试验检测，该试验在于检测Gq-依赖的磷脂酶C是否引起了含AP1元件的基因的激活。这样，激活的Gq-相关受体将显示为该基因表达的增强，而逆向激动剂将显示为该表达的减弱。
本发明提供了用于鉴定调节剂的方法(此处也称作“筛选试验”)，所述调节剂即能结合本发明蛋白质或对例如该蛋白质表达或活性具有刺激或抑制效应的候选或测试化合物或试剂(例如，肽、肽模拟物(peptidomimetics)、小分子或其他药物)。例如，本文描述的筛选试验可以用于鉴定作为所述受体的拮抗剂的化合物，其可用于治疗支气管哮喘。
在一个实施方案中，本发明提供用于筛选如下候选或测试化合物的试验，所述化合物能结合膜结合形式的本发明蛋白质、多肽或其生物活性部分或调节其活性。本发明的测试化合物可应用众多手段之任一种在本领域内公知的组合文库方法中获得，包括：生物文库；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要去褶合(deconvolution)的合成文库方法；“单珠单化合物”文库方法；和应用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam，抗癌药物研究(Anticancer Drug Des)(1997)12：145)。
用于合成分子文库的方法的实例可在本领域内找到，例如：DeWitt等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1993)90：6909；Erb等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1994)91：11422；Zuckermann等，医学化学杂志(J Med Chem)(1994)37：2678；Cho等，科学(Science)(1993)261：1303；Carrell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)33：2059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)33：2061和Gallop等，医学化学杂志(JMed Chem)(1994)37：1233。
化合物文库可呈现在溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13：412-421)或珠子上(Lam，自然(Nature)(1991)354：82-84)、芯片上(Fodor，自然(Nature)(1993)364：555-556)、或细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,571,698；5,403,484和5,223,409)、质粒(Cull等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1992)89：1865-1869)或噬菌体上(Scott等，科学(Science)(1990)249：386-390；Devlin，科学(Science)(1990)249：404-406；Cwirla等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)87：6378-6382；和Felici，分子生物学杂志(J Mol Biol)(1991)222：301-310)；将前面参考文献的每一个的公开引入本文作为参考。
在本发明的一个特定实施方案中，试验为基于细胞的试验，其中在细胞表面表达膜结合形式的本发明蛋白质(或其生物活性部分)的细胞与受试化合物接触，并测定受试化合物结合该蛋白质的能力。例如，细胞可为酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。测试化合物与所述蛋白质的结合能力的测定可以通过例如以下方式进行：将测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联，这样测试化合物与所述蛋白质或其生物活性部分的结合可通过检测复合体中的标记化合物进行确定。例如，测试化合物可直接或间接标记125I、35S、14C或3H，放射性同位素的检测可通过直接计数放射量或通过闪烁计数进行。备选地，测试化合物可应用如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶标记，且酶标记的检测可通过测定适宜的底物向产物的转化来实现。在特定的实施方案中，试验包括将在细胞表面表达膜结合形式的本发明蛋白质或其生物活性部分的细胞与可以结合所述蛋白质的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与所述蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与所述蛋白质相互作用的能力的测定包括测定测试化合物与已知化合物相比优先与本发明的蛋白质或其生物活性部分结合的能力。
在另一实施方案中，试验为基于细胞的试验，包括使细胞表面表达膜结合形式的本发明蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)所述蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。测试化合物调节本发明的蛋白质或其生物活性部分的活性的能力可通过，例如，测定所述蛋白质结合靶分子或与其相互作用的能力来确定。如此处所用，“靶分子”是指天然与本发明蛋白质结合或作用的分子，如表达本发明蛋白质的细胞的表面分子、在第二细胞的表面上的分子、在细胞外周围区域中的分子、与胞膜内表面结合的分子或细胞质分子。靶分子可以是另一种分子或本发明的蛋白质或多肽。在一个实施方案中，靶分子为信号转导途径的成分，所述途径促进胞外信号(例如由化合物结合膜结合形式的本发明的蛋白质所产生的信号)通过细胞膜向细胞内转导。例如，靶分子可为具有催化活性的第二胞内蛋白质或促进下游信号分子关联的蛋白质。
本申请的蛋白质与靶分子结合或作用的能力可通过以上描述的用于测定直接结合的其中一种方法来测定。在特定的实施方案中，本发明蛋白质与靶分子结合或作用的能力可通过测定靶分子的活性来确定。靶分子活性的测定方法有例如：检测靶分子对胞内第二信使(如胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等)的诱导、检测靶分子对合适底物的催化/酶促活性、检测报告基因(例如有效连接编码可检测标记(如萤光素酶)的核酸的效应调控元件)的诱导或检测细胞反应，例如细胞分化或细胞增殖或功能。具体实施方案在下面的“实施例4”中描述，其中本发明的受体偶联到Gα16以引起钙应答。
本发明还涉及无细胞试验，包括将本发明蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触，并测定测试化合物结合所述蛋白质或其生物活性部分的能力。测试化合物与所述蛋白质的结合可以如以上所描述的方式直接或间接进行检测。在优选的实施方案中，试验包括将本发明蛋白质或其生物活性部分与能结合该蛋白质的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与所述蛋白质相互作用的能力。其中对测试化合物与本发明蛋白质相互作用的能力的测定包括测定测试化合物与已知化合物相比优先结合本发明的蛋白质或其生物活性部分的能力。
本发明的另一无细胞试验涉及将本发明蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)所述蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。对测试化合物调节本发明的蛋白质的活性的能力的测定可通过，例如利用以上描述的用于测定直接结合的其中一种方法测定所述蛋白质结合靶分子的能力来实现。在备选的实施方案中，对测试化合物调节所述蛋白质活性的能力的测定可通过测定所述蛋白质进一步调节靶分子的能力来实现。例如，可以按前述测定靶分子对适当底物的催化/酶促活性。
本发明另一无细胞试验包括将本发明的蛋白质或其生物活性部分与能结合所述蛋白质的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与所述蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与所述蛋白质相互作用的能力的测定包括测定所述蛋白质优先结合靶分子或调节靶分子的活性的能力。
受体可由非配体分子激活，所述非配体分子并不一定抑制配体结合但可引起受体结构改变以致造成G蛋白结合或，可能的受体聚集、二聚化或簇集，从而引起激活作用。例如，可以针对暴露于细胞表面的本发明受体的多个部位产生抗体。如用标准试验(如监测cAMP水平或胞内Ca2+水平)所测定的，这些抗体可以通过G蛋白级联激活细胞。由于涉及分子作图，特别是表位作图，单克隆抗体可能是优选的。单克隆抗体可由表达于细胞表面的完整受体以及已知形成在细胞表面的肽引起。可应用Geysen等，美国专利号5,998,577的方法以获得大量的相关肽。
所发现的可激活本发明受体的抗体可经过修饰以最小化与受体激活无关的活性，如补体结合。这样，可对抗体分子实行截短或突变以使受体激活以外的活性最小或丧失。例如，对某些抗体，仅需要抗原结合部分。这样，可去除抗体的Fc部分。
将表达本发明受体的细胞暴露于抗体以激活该受体。然后使激活的细胞暴露于多种分子以期鉴定出那些调节受体活性并导致更高激活水平或更低激活水平的分子。然后可对达此目的的分子在无抗体的情况下在表达本发明受体的细胞上进行试验，以观察对非激活细胞的效应。然后可以用公知的技术检测靶分子并将其修饰为候选药物，用于治疗与代谢改变相关的失调。
本发明的无细胞试验适于应用可溶形式和膜结合形式的本发明的蛋白质。对于包括膜结合形式的无细胞试验，可能需要利用增溶剂以使膜结合形式维持在溶液中。该增溶剂的实例包括非离子去污剂，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、THESIT、异三癸基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸。
在本发明以上试验方法的不止一个实施方案中，可能需要固定本发明的蛋白质或其靶分子以易于从非复合形式的一种或全部两种所述蛋白质中分离出复合形式，以及适于试验的自动化。在存在或缺乏候选化合物时测试化合物与本发明的蛋白质的结合或所述蛋白质与靶分子的相互作用可在任何适用于容纳反应物的容器内完成。该容器的实例包括微量滴定板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可提供融合蛋白，该融合蛋白添加有允许其中一种或全部两种上述蛋白质结合到基质上的结构域。例如可将谷胱甘肽-S-转移酶/本发明融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sepharose珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上。备选地，然后将谷胱甘肽衍生的微量滴定板与测试化合物组合。接着，在利于形成复合体的条件下(例如在生理性盐和pH条件下)，孵育非吸附靶蛋白或本发明的蛋白质及混合物。孵育后，洗涤珠子或微量滴定板孔以移去任何未结合成分，然后直接或间接地测定复合体的存在。备选地，可以使复合体与基质解离，且用标准技术测定结合或活性水平。
其他用于固定蛋白质于基质上的技术也可用于本发明的筛选试验。例如，可利用生物素和链霉亲和素的偶联固定本发明的蛋白质或其靶分子。生物素化的本发明的蛋白质或靶分子可应用本领域内公知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-丁二酰亚胺)制备产生，并固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemicals)的孔内。备选地，可使用与本发明的蛋白质或靶分子反应但不阻碍本发明的蛋白质结合靶分子的抗体对平板的孔进行衍生。孵育后，通过抗体缀合，将未结合的靶标或本发明的蛋白质捕获在孔内。除了以上描述的用于检测GST-固定的复合体的方法外，用于检测复合体的方法还包括应用与本发明的蛋白质或靶分子反应的抗体对复合体进行的免疫检测以及依赖于检测与本发明的蛋白质或靶分子连结的酶促活性的酶联试验。
在另一实施方案中，蛋白质表达的调节剂可通过如下方法鉴定，其中，使细胞与候选化合物接触并测定胞内本发明的mRNA或蛋白质的表达。将存在候选化合物时本发明的mRNA或蛋白质的表达水平与缺乏候选化合物时本发明的mRNA或蛋白质的表达水平进行比较。然后，基于该比较，可以鉴定候选化合物是否为表达的调节剂。例如，当mRNA或蛋白质在存在候选化合物时的表达大于(统计学显著大于)缺乏该化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为mRNA或蛋白质表达的刺激剂或激动剂。备选地，当mRNA或蛋白质在存在候选化合物时的表达低于(统计学显著低于)缺乏该化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为mRNA或蛋白质表达的抑制剂或拮抗剂。如果活性在存在配体或激动剂时减少，或在组成型表达细胞中低于基线，则候选化合物被鉴定为逆向激动剂。胞内mRNA或蛋白质的表达水平可由此处描述的用于检测mRNA或蛋白质的方法进行测定。
而在本发明另一方面，本发明的蛋白质可在双杂交或三杂交试验中用作“诱饵蛋白”(例如参见美国专利号5,283,317；Zervos等，细胞(Cell)(1993)72：223-232；Madura等，生物化学杂志(J Biol Chem)(1993)268：12046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14：920-924；Iwabuchi等，癌基因(Oncogene)(1993)8：1693-1696；和PCT公开号WO 94/10300，将每篇文献的公开引入本文作为参考)，以鉴定其他与本发明的蛋白质结合或作用并调节本发明的蛋白质活性的蛋白质。该结合蛋白也可能通过本发明的蛋白质作为如信号途径的上游或下游元件参与信号传播。
由于本发明使得可以制备出大量的纯的本申请蛋白质，故可以确定出可能功能区域的构象的物理特征，用于合理的药物设计。例如，细胞内和细胞外结构域为特别有意义的区域。一旦确定了区域的形状和离子构型，可与这些区域作用的候选药物即可成型，然后可以在完整细胞、动物和患者中进行试验。能够获得此3-D结构信息的方法包括X射线晶体学、NMR光谱学、分子模建等。3-D结构也可导致鉴定出其他已知蛋白中的类似构象位点，而对于所述蛋白已存在作用于此位点的已知药物。这些药物或其衍生物可能用于本发明的蛋白质。
上述之筛选方法对鉴定本发明受体之激动剂、部分激动剂、拮抗剂、逆向激动剂或调节剂尤其有用，其为鉴定可治疗各种疾病(这些疾病包括但不限于支气管哮喘、COPD、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性结膜炎、系统性肥大细胞增多症和局部缺血性再灌注损伤)之化合物提供了途径。
本发明还涉及由以上筛选试验鉴定到的新药剂，以及其在此处描述的治疗中的应用。
本发明DNA序列的部分或片段可在不同应用中作为多核苷酸试剂。例如，序列可用于：(i)在染色体上对相应的基因绘图并，由此定位与遗传疾病相关的基因区域；(ii)从微小量生物样品中对个体实施鉴定(组织分型)；和(iii)为生物样品的法医鉴定提供帮助。这些应用在以下的分段中描述。
2.染色体作图
一旦分离出基因的序列(或序列的一部分)，则该序列可用于在染色体上作图定位本发明的基因。因此，此处描述的核酸分子或其片段可用于在基因组上作图定位。基因组上所述序列的作图定位是确定序列与疾病相关基因的关系的重要一步。
简言之，通过从SEQ ID NO：1公开的序列中制备PCR引物(优选的长度为15-25bp)，可以对基因在基因组上作图。引物可用于包含单个人染色体的体细胞杂合体的PCR筛选。仅有包含与本发明的序列对应的人基因的那些杂合体能产生扩增片段。
通过不同哺乳动物体细胞(例如人和小鼠细胞)的融合可以制备体细胞杂合体。随着人类与小鼠之融合细胞的生长和分裂，一般而言，人染色体将随机消失，而小鼠之染色体则保留下来。可利用小鼠细胞不能生长(缺乏特定的酶)而人类细胞可以生长的培养基，使含有所需酶之编码基因的人染色体保留下来。通过使用多种培养基，就可建立细胞系细胞系组。组中的各细胞系含一条人染色体或几条人类染色体或全部小鼠染色体，以此方式则易于将各基因定位于特定的人染色体。(D′Eustachio等人，Science(1983)220：919-924)。仅含人染色体片段的体细胞杂合体可由具有转座或缺失的人类染色体制成。
体细胞杂合体的PCR作图是一种将特定序列定位于特定染色体上的快速方法。每台热循环仪每天可定位三段或更多的序列。可类似地用于将序列作图定位到基因组特定染色体上的其他作图策略包括原位杂交(描述于Fan等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)87：6223-27)、用标记的流式分拣染色体预筛选和通过与染色体特异的cDNA文库杂交进行预选择。
也可使用DNA序列与中期染色体铺展物的荧光原位杂交(FISH)一步提供精确的染色体定位。染色体铺展物的制备可应用被化学物阻滞在分裂中期的细胞进行，所述化学物如可破坏有丝分裂纺锤体的秋水仙碱。染色体可以用胰蛋白酶短暂处理然后进行Giemsa染色。每条染色体上会出现亮带和暗带图案，由此可鉴定出各染色体。FISH技术可应用短至500或600个碱基的DNA序列进行。但是，大于1,000个碱基的克隆更有可能结合独特的染色体位置并产生足够的信号强度以便简单检测。优选地1,000个碱基且更优选地2,000个碱基将足以在合理的时间内产生好的结果。参见Verma等的涉及该技术的综述(人类染色体：基础操作手册(HumanChromosomes：A Manual of Basic Techniques)(Pergamon Press，NewYork，1988))。染色体作图可以在硅片上(in silico)考虑统计学因素，如优势对数得分或单纯接近度(mere proximity)进行推断。
用于染色体作图的试剂可单个应用以定位染色体上的单一位点。此外，可应用一组试剂标记多个位点和/或多条染色体。对作图目的，实际上优选对应于所述基因两翼区域的试剂。编码序列在基因家族内更可能保守，因此增加了染色体作图中交叉杂交的机会。
一旦将序列绘制在精确的染色体位置，则可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据联系起来。然后，基因和绘图定位于同一染色体区域的疾病之间的关系，可通过连锁分析进行确定(物理上邻近的基因的共遗传)，如参见Egeland等，自然(Nature)(1987)325：783-787中的描述。
此外，可测定受到或未受到本发明的蛋白质相关疾病影响的个体之间DNA序列的差异。如果在一些或全部的受影响个体中观察到突变而未在任何未受影响的动物中观察到此突变，则该突变可能为特定疾病的致病因子。对受到影响和未受到影响的动物的比较一般包括首先在染色体中寻找结构的改变，如缺失或易位，所述改变可在染色体铺展物中观察到或可应用基于该DNA序列的PCR检测到。最终，可对来自几个动物的基因进行完整测序，以证实突变的存在并将突变与多态性区分开来。
3.诊断试验
用于检测生物样品中本发明的核酸或蛋白质存在与否的示例性方法包括：从受试者中获得生物样品，并将生物样品与可检测所述蛋白质或核酸(如mRNA或基因组DNA)的化合物或试剂接触，以检测生物样品中的存在。用于检测mRNA或基因组DNA的优选试剂为能够与本发明的mRNA或基因组DNA杂交的标记核酸探针。核酸探针可为，例如全长核酸，如SEQ ID NO：1的核酸或其部分，如长度为至少15、30、50、100、250、500或更多个核苷酸并且足于在严格的条件下特异杂交到mRNA或基因组DNA上的寡核苷酸。可用于本发明诊断试验的其它合适探针在本文中有描述。
用于检测本发明的蛋白质的一个特定试剂为能够结合所述蛋白质的抗体，优选地为带有可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的、嵌合的或更优选地为单克隆的。可应用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“生物样品”意在包括从受试者分离的组织、细胞和生物液体，以及存在于受试者体内的组织、细胞和液体。即，本发明的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于体外检测mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。用于在体外检测所述蛋白质的技术包括ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于体外检测基因组DNA的技术包括Southern杂交。此外，用于体内检测蛋白质的技术包括向受试者体内导入标记的抗-本发明的蛋白质的抗体。例如，可给抗体标记上放射性标记物，其在受试者体内的存在和部位可通过标准成像技术检测。
在一个实施方案中，生物样品含有来自受试者的蛋白质分子。或者，生物样品可以含有来自受试者的mRNA分子或来自受试者的基因组DNA分子。可以应用于此处的一个特定的生物样品是利用常规手段从受试者分离到的嗜中性粒细胞样品。
因此，在开发预后或诊断实验时，将鉴定核酸或蛋白质的多态性与疾病联系起来用于诊断携带者或患者可能是有益的。例如，对于类风湿性关节炎、哮喘、节段性回肠炎等，具有预后或诊断试验将是有益的。在与活化或发炎状态相关的细胞中，本发明的核酸或蛋白质的表达提升。与发炎相关的失调症包括，过敏状态、结肠炎、节段性回肠炎、水肿状态、接触性过敏、过敏症、其它形式之关节炎、脑膜炎及免疫系统藉由血管扩张、发热、聚集细胞、体液等对刺激产生反应而造成刺激部位肿胀等之其它状况。因此，代谢的失调可以用于诊断类风湿性关节炎。而且，类风湿性关节炎的分子机制可能是可检测的，例如，可能存在可以在组织样品(如血液样品)中进行检测的诊断性SNP、RFLP、表达水平的变化性、功能的变化性等等。
在另一实施方案中，这些方法还包括：从对照受试者获得生物样品；使对照样品与能够检测本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，以便检测生物样品中蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和量；和将对照样品中蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和量与测试样品中蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和量进行比较。
4.高通量筛选化学文库
能调节本发明的核酸或蛋白质活性的化合物之任何分析法均经得起实施高通量筛选。高通量筛选系统为市售可得[参见，例如，Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；BeckmanInstruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等]。这些系统典型地使整个程序自动化，包括适用于该分析法的所有样品与试剂的吸取、液体的分配、定时孵育、及检测器中微量培养板之最后读取。这些可配置系统提供了高通量及迅速的启动，以及高度灵活性与使用者自定性。这些系统之厂商提供了有关多种高通量操作之详细方案。举例而言，Zymark Corp.提供了叙述用于检测基因转录调节、配体结合等的筛选系统之技术公报。
5.试剂盒
本发明还包括检测生物样品(测试样品)中本发明的核酸或蛋白质的存在的试剂盒。该试剂盒可以用于确定受试者是否患有或有增加的危险性患有与异常表达相关的疾病(例如免疫学失调)。例如，该试剂盒可以包含能够检测生物样品中的本发明的蛋白质或mRNA的标记化合物或试剂以及用于检测样品中核酸或蛋白质的量的手段(例如，抗体或寡核苷酸探针)。当本发明的蛋白质或mRNA的量高于或低于正常水平时，试剂盒还可以用于得出表明受试者是否患者或有危险患有与本发明的核酸或蛋白质异常表达相关的疾病的结果。
对于基于抗体的试剂盒，其可以包含例如：(1)可与本发明的蛋白质结合的第一抗体(例如附着在固相支持物上)；和，任选地，(2)可与本发明的蛋白质或与第一抗体结合并缀合有可检测试剂的第二种不同的抗体。如果不存在第二抗体，则可以可检测地标记第一抗体，或者对能与第一抗体结合的另一分子进行可检测的标记。正如本领域已知的，无论如何都应包括已标记的结合部分以充当可检测的报道分子。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，本发明的试剂盒可以包含，例如：(1)可与本发明的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸或(2)可用于扩增本发明的核酸分子的引物对。
试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含在探测可检测试剂(例如酶或底物)时所必需的成分。试剂盒还可以含有可以进行分析和与测试样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每一个成分通常装在不同的容器中，并且所有这些不同容器被放在一个包装中。此外，还可以装入说明书和背景信息。
6.在临床试验过程中监测疗效
监测药剂(例如，药物或化合物)对本发明的核酸或蛋白质表达或活性的影响(例如，调节异常细胞增殖、分化和/或功能的能力)既可以应用于基础药物筛选中也可以应用于临床试验中。例如，可以在表现出降低的基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性的受试者的临床试验中，监测药剂(通过本文描述的筛选试验确定的)在增加基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性方面的有效性。或者，可以在表现出增加的基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性的受试者的临床试验中，监测药剂(通过本文描述的筛选试验确定的)在降低基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性方面的有效性。在这些临床试验中，所述基因的表达或活性以及，优选地，其它基因(例如，细胞增殖疾病所涉及的基因)的表达或活性可以用作特定细胞的免疫应答性的标记物。例如，但不限于，可以鉴定当用调节本发明的核酸或蛋白质活性的药剂(例如，化合物、药物或小分子)(例如，本文所述筛选试验鉴定的药剂)处理时细胞中可以被调节的基因(包括本发明的基因)。因此，例如，在临床试验中，为了研究药剂对细胞增殖疾病的作用，可以分离细胞，制备RNA并分析本发明的核酸及参与该疾病的其它基因的表达水平。基因表达水平(即，基因表达图式)可以通过如下方式定量：按本文所述进行Northern印迹分析或RT-PCR，或者，作为备选方案，利用本文所述方法之一测量产生的蛋白质的量或测量本发明的基因或其它基因的活性水平。以此方式，基因表达图式可以作为标记物指示细胞对药剂的生理反应。由此，可以在使用药剂治疗个体之前以及治疗过程中的不同点上，确定反应状态。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种方法，由此可以监测使用药剂(例如，通过本文所述筛选试验鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其它候选药物)治疗受试者的疗效，该方法包括步骤：(i)在施用药剂前从受试者获得用药前样品；(ii)检测用药前样品中本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个用药后样品；(iv)检测用药后样品中本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(v)对用药前样品中本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平与一个或多个用药后样品中本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平进行比较；和(vi)据此改变患者的药剂施用方案。例如，可能期望增加药剂施用以增加本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性，使之超过所检测到的水平，即，增加药剂的效力。或者，可能期望降低药剂施用以降低本发明的蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水，使之低于所检测到的水平，即，降低药剂的效力。
下面的实施例更详细地描述本发明。
实施例
实施例1
克隆豚鼠DP受体的起始外显子DNA片段
欲克隆豚鼠DP受体cDNA，首先采用PCR从基因组DNA来克隆该DP受体的外显子片段。利用Sequencher程序(Gene Codes，Ann Arbor MI)比对人类(U31332)、小鼠(NM_008962)和大鼠(NM_022241)DP受体序列之保留区以设计一系列PCR引物。豚鼠基因组DNA购自CeMines(Evergreen，Co.)。用于扩增豚鼠基因组DNA的420bp片段之引物由引物675_Topo_F3(SEQ ID NO：3：GGGACACCCTTTCTTCTACAA)和675_Topo_R2(SEQ ID NO：4：GAACACATGGTGAAGAGCACTG)进行。PCR产物由TOPO-TA克隆仪(Invitrogen，Carlsbad CA)按厂商说明克隆，插入序列由ABI 3100DNA测序仪按厂商说明测序。
3’和5’RACE-PCR克隆
将所得之DNA序列与人类、小鼠和大鼠的DP序列比对。比对显示，PCR产物序列虽同源却不同于来自所检查的物种的DP受体共有序列(图3)。用豚鼠DP受体共有序列来设计额外的引物并采用DNA末端快速扩增法(RACE)来延长克隆的序列。为了获得DP受体转录物的3’端，可采用Clontech(BD Biosciences之分公司，Palo Alto CA)的SMART RACE系统。采用引物675_GP_3’RACE_F(SEQ ID NO：5：GTGCTCGTGGCGCCGGTGTG)和由豚鼠肺mRNA转化的cDNA模板来延长豚鼠DP受体mRNA序列。将RACE产物克隆到PCR4-Topo(Invitrogen，Carlsbad CA)，然后经上述之测序和比对来揭示DP受体的编码序列的整个3’端延长部分。为了分离豚鼠DP受体cDNA之5’端，使用引物675_Rev_P2(SEQ ID NO：6：CACATGGTGAAGAGCACGGTCATGA)来进行SMART RACE，生成1kb PCR产物。以经纯化的PCR产物为模板，用引物675_RACE_R9(SEQ ID NO：7：TCACCAGGCACTTGCCTAGCAGGTCTGT)来进行5’嵌套RACE。将RACE产物克隆到PCR4-Topo(Invitrogen)，如上述测序和比对，揭示DP受体之编码序列的整个5’端延长部分。
构建编码豚鼠DP受体之cDNA
用Gene Construction Kit(Textco，Keene NH)程序来鉴定DP受体之编码序列。设计与Gateway克隆相匹配引物(GW675，正向引物SEQ IDNO：8：AAAAGCAGGCTTAGGAATGTCCTTCTATCCCTGCAACAC；GW675，反向引物SEQ ID NO：9AAGAAAGCTGGGTCTCACAGACTGGATTCCACGTTAG)来位于该编码序列的侧翼并将其与从豚鼠卵白蛋白质刺激的肺细胞得到的cDNA一道用于PCR反应。10个单位的FU Turbo(Stratagene，La Jolla CA)热稳定聚合酶和100ng模板cDNA用于进行PCR。将所生成的1.1kb DNA片段按QiaQuick方案(Qiagen)用凝胶电泳层析法纯化后再通过GatewayBP重组酶克隆方法(Invitrogen)克隆到pDONR201载体。将克隆反应物转化到大肠杆菌E.coli DH5-α，取所得菌落的少量制备DNA进行测序以证实完整DP受体编码序列的克隆。
实施例2
RNA印迹分析
用豚鼠DP受体的起始基因组DNA片段进行RNA印迹分析(图5)。将经卵白蛋白刺激或未接受卵白蛋白刺激的雄性Hartley豚鼠的肺切除。对比未受到卵白蛋白刺激(泳道2)的豚鼠总肺RNA表达和受到卵白蛋白刺激(泳道3)的豚鼠总肺RNA表达。与经光谱和18S RNA带强度分析，RNA载入量相当。DP受体之RNA印迹分析鉴定出了豚鼠肺中3-4kbmRNA，其大小与前人报导的小鼠和人类DP之转录物(Hirata等人，1994；Boie等人，1995)吻合。该mRNA在受卵白蛋白敏化和刺激的豚鼠肺中明显上调，此结果与先前有关DP受体在受抗原刺激的小鼠肺中上调的报导相当(Matsuoka等人，2000)。这些数据支持了DP在豚鼠肺中哮喘反应中的重要性。
实施例3
豚鼠的直向同源物DP受体的序列分析
豚鼠DP受体之核苷酸序列如图1所示，其氨基酸序列如图2所示。豚鼠DP的cDNA含1,032bp的可读框，其编码345个氨基酸之蛋白质(理论分子量为38,250)。
豚鼠DP蛋白质包含两个潜在的N-糖基化位置，即氨基末端的Asn-7和第一个细胞外环的Asn-86。另外，还有两个潜在的蛋白质激酶C磷酸化位点，即分别位于第一和第三混溶细胞质环中的Ser-46和Thr-140。
豚鼠DP受体的核苷酸序列与人类、大鼠和小鼠DP的相应序列之比较由图1示出。在蛋白质水平上类似地，与豚鼠DP受体之序列的同一性对于人DP为66％，对于小鼠DP为63％，对于大鼠DP为65％(图2)。
亲水性分析证实了七个假定跨膜结构域的存在，这些区域的位置与先前所定义的小鼠、大鼠和人类DP序列之保留区的位置相同。在DP直向同源物间，序列保留性在跨膜结构域中最高。两段据前人报导为前列腺素类家族之GPCR所特别保留的序列也存在于豚鼠DP蛋白质中：所有DP直向同源物中第二个细胞外环中的QYCPGTWCR和第七跨膜结构域中的RFLSVISIVDPWIFI都是相同的。
对于不同物种，TMD VI和VII之间细胞外环也显示出不同。即该环在直向同源物之间不同，在人类、大鼠、小鼠和豚鼠DP中该环的长度分别是24、21、21和18个氨基酸。尤其令人关注的是豚鼠DP中TMD VI和VII之间的氨基酸数目要比人类DP受体的少六个氨基酸。此外，小鼠和大鼠DP受体中该区域少了3个氨基酸。Kobayashi等(2000)制备了一系列的嵌合IP-DP受体来定义使DP具有配体结合选择性的区域。令人感兴趣的是，他们所发现的对PGD2选择性和有效结合有重大作用的区域之一就是穿膜VI-VII区，即新近克隆的豚鼠DP受体中缺少了6个氨基酸的该相同区域。配体亲和性或化合物功效的种间差异也许源于TMD VI-VII环内的相互作用和豚鼠受体上该环中的变异。
豚鼠DP蛋白质中第一和第三个细胞内环要分别短3和5个氨基酸，而在小鼠、人类和大鼠DP蛋白质中这些细胞内环大小都相同。Kobayashi等还强调了就PGD2结合而言，第一个跨膜结构域对第一个细胞外环区的重要性。鉴于豚鼠DP中第一个细胞内环比人类、小鼠和大鼠DP的短3个氨基酸，该区域可能是造成受体结合亲和性的额外区域。受体的该区域还可能是化合物对人类和豚鼠DP具有不同亲和性的原因。豚鼠DP中第三个细胞内环(介于TMD V和VI之间)少了5个氨基酸，它是造成PGD2功能相关的受体上的另一个区域。
实施例4
pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP哺乳动物表达载体的构建
由PCR得到小鼠DP受体之全长cDNA，然后采用Gateway BP重组酶克隆法将其克隆到pDONR201载体。所制成的小鼠DP载体与上述的豚鼠DP载体类似。经DNA测序确定，该小鼠DP cDNA与Genbank检索号NM_008962表示的以前描述的小鼠DP序列相同。为了进行表达研究，将小鼠和豚鼠之DP受体由LR反应亚克隆到pEAK10表达载体(EdgeBiosystems)，其已经受到Gateway改造。pEAK10载体的Gateway改造是指以EcoRI消化，然后经过Klenow填充将Gateway盒克隆到该载体。所生成的载体pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP用来制备下文所述之稳定细胞系。
HEK293-Gα16细胞系的生成
如所述的(Amatruda等人，1991)克隆编码人Gα16的cDNA。简单而言，将HL-60人前髓细胞的总RNA分离出来并以之为模板在PCR中合成编码Gα16的cDNA。将所得PCR产物克隆到表达载体pHook-3(Invitrogen)，其也共表达单链抗体(sFv)以允许用半抗原包被的磁珠用淘选方案方便地富集经转染的细胞(Chesnut等人，1996)。用构建的质粒(pGα16)来转染HEK293细胞，进行Zeocin选择，然后按厂商说明书经磁珠富集阳性克隆。对于最后的纯化和选择，令单个克隆单独生长，然后取等分试样用与Gαs(GIP受体)自然偶联的任选GPCR之表达载体另外转染以分析Gα16的功能表达，最后用Molecular Devices Corp制造的FLIPR仪来测试经转染细胞的钙信号传递。
pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP在HEK293-Gα16细胞中的表达
按照厂商的说明利用Lipofectamine 2000(Gibco)来用pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP载体转染HEK293-Gα16细胞系。培育经转染的细胞，由1ug/ml的嘌呤霉素和250ug/ml的Zeocin选择5周。测量应答PGD2刺激的细胞内钙释放来监视DP受体在经转染的细胞群体中的表达。
细胞内钙分析
为了进行功能鉴定，用新克隆的豚鼠DP受体稳定转染HEK293-Gα16细胞，并用小鼠DP受体产生等同细胞系供比较之用。对这两种表达DP受体的细胞系以及不表达任何转染的DP受体的亲代细胞系进行第二信使分析，使用DP受体与Gα16的结合来引发钙反应。用未经转染的HEK293-Gα16细胞或经pEAK10-gpDP或pEAK10-mDP表达载体转染的细胞进行细胞内钙测量。将经转染或未经转染的细胞以每孔10000个细胞接种于384孔板中。用钙分析缓冲液冲洗细胞3次。然后将细胞在37℃的4μM载钙染料Fura-4/AM(Molecular Probes)中孵育数分钟。用钙分析缓冲液再冲洗三次以除去未掺入的fura-4/AM。在Fura-4/AM装载的细胞受到PGD2或缓冲液刺激后，用FLIPR仪(Molecular Devices Corp.)来测量细胞内的钙。如图6所示，PGD2刺激使豚鼠和小鼠之DP表达细胞系中的细胞内钙动员急剧增加，EC50值分别为1.4nM和18nM。两种细胞系中钙释放的最大值相当。相比，亲代HEK293-Gα16细胞系只在很高的PGD2浓度(即，高于10μM PGD2)下显示出钙反应。
实施例5
SPA cAMP分析
新克隆的豚鼠DP受体的额外功能的鉴定利用DP的天然信号通路，即腺苷酸环化酶刺激cAMP的产生。经转染或未经转染的细胞以每孔40,000个细胞接种在96孔板。在37℃过夜孵育后，更换培养基并用确定浓度的PGD2刺激细胞15分钟。按照生产商的方法，采用cAMP SPA直接筛选分析系统(Amersham)来测量受刺激的细胞中cAMP的积累。如图7所示，豚鼠DP细胞系显示出对PGD2刺激的良好cAMP反应，该反应与小鼠DP受体的反应相当。豚鼠和小鼠DP细胞系的EC50值分别为0.8nM和0.5nM，且两种受体的最大反应相当。相比，亲代HEK293-Gα16细胞系在受到PGD2的刺激后细胞内cAMP并未增加。
参考文献
Arimura A，Yasui K，Kishino J，Asanuma F，Hasegawa H，Kakudo S，Ohtani M，Arita H(2001).Prevention of allergic inflammation by a novel prostaglandin receptorantagonist，S-5751.J Pharmacol Exp Ther.298(2)，411-9
Armstrong，R.A.1996 Platelet prostanoid receptors.Pharmacol.Ther.72：171-191.
Boie，Y.，Sawyer，N.，Slipetz，D.M.，Metters，K.M.，Abramovitz，M.1995Molecular cloning and characterization of the human prostanoid DP receptor.J.Biol.Chem.270：18910-18916.
Brightling CE，Bradding P，Pavord ID，Wardlaw AJ(2003).New Insights intothe role of the mast cell in asthma.Clin Exp Allergy 33，550-556
Coleman，R.A.，Smith，W.L.，Narumiya，S.1994 VIII.International union ofpharmacology classification of prostanoid receptors：properties，distribution，andstructure of the receptors and their subtypes.Pharmacol.Rev.46：205-229.
Doyle WJ，Boehm S，Skoner DP(1990)Physiologic responses to intranasaldose-response challenges with histamine，methacholine，bradykinin，andprostaglandin in adult volunteers with and without nasal allergy.J Allergy ClinImmunol.86(6 Pt 1)，924-35
Hirata，M.，Kakizuka，A.，Aizawa，M.，Ushikubi，F.，Narumiya，S.1994Molecular characterization of a mouse prostaglandin D receptor and functionalexpression of the cloned gene.91：11192-11196.
Holgate S，Lackie P，Wilson S，Roche W，Davies D.(2000)BronchialEpithelium as a key Regulator of Airway Allergen Sensisitzation and Remodelling inAsthma.Am J Respir Crit Care Med.162，113-117
Ito，S.，Narumiya，S.and Hayaishi，O.1989 Prostaglandin D2：a biochemicalperspective Pros.Leuko.Essent.Fatty Acids 37：219-234.
Lewis，RA，Soter NA，Diamond PT，Austen KF，Oates JA，Roberts LJ II(1982).Prostaglandin D2 generation after activation of rat and human mast cells with anti-IgE.J.Immunol 129，1627-1631.
Matsuoka，T.，Hirata，M.，Tanaka，H.，Takahashi，Y.，Murata，T.，Kabashima，K，Sugimoto，Y.，Kobayashi，T.，Ushikubi，F.，Aze，Y.，Eguchi，N.，Urade，Y.，Yoshida，N.，Kimura，K，Mizoguchi，A.，Honda，Y.，Nagai，H.，Narumiya，S.2000 ProstaglandinD2 as a mediator of allergic asthma.Science 287：2013-2017.
Sambrook，et al.，eds.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989.
Roberts，L.J.II，Sweetman，B.J.，Lewis，R.A.，Austin，K.F.，Oates，J.A.1980Increased production of prostaglandin D2 in patients with systemic mastocytosis.N.Eng.J.Med.303：1400-1404.
Wright，D.H.，Nantel，F.，Metters，K.M.，Ford-Hutchinson，A.W.1999 A novelbiological role for prostaglandin D2 is suggested by distribution studies of the rat DPprostanoid receptor.Eur.J.Pharmacol.377：101-115.
序列表
<110>安万特药物公司
<120>编码新的前列腺素受体蛋白的核酸及其使用方法
<130>USAV2003/0073 WO PCT
<140>还未分配
<141>2004-12-08
<150>10/747,994
<151>2003-12-30
<160>2
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>1038
<212>DNA
<213>豚鼠(Cavia porcellus)
<400>1
atgtccttct atccctgcaa caccaccgcc tcggtacgga gtgggaactc ggcgacggtg 60
ggcggagtgc tcttcagcgc gggcctcctg ggcaacctgc tggccctagc gctgctggca 120
cgctcggggc tcgggtcctg ccggccgcgc ccgcagccct cagtcttcta cgtgctggtg 180
tgcggcttga cggtcacaga cctgctaggc aagtgcctgg tgagcccggt ggtgctggct 240
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<210>2
<211>345
<212>PRT
<213>豚鼠
<400>2
Met Ser Phe Tyr Pro Cys Asn Thr Thr Ala Ser Val Arg Ser Gly Asn
1 5 10 15
Ser Ala Thr Val Gly Gly Val Leu Phe Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asn
20 25 30
Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Ala Arg Ser Gly Leu Gly Ser Cys Arg
35 40 45
Pro Arg Pro Gln Pro Ser Val Phe Tyr Val Leu Val Cys Gly Leu Thr
50 55 60
Val Thr Asp Leu Leu Gly Lys Cys Leu Val Ser Pro Val Val Leu Ala
65 70 75 80
Ala Tyr Ala Gln Asn Arg Ser Leu Arg Gly Leu Ala Pro Ala Gln Gly
85 90 95
Asp Ser Leu Cys Gln Ala Phe Ala Phe Ile Met Ser Phe Phe Gly Leu
100 105 110
Ala Ser Thr Leu Gln Leu Leu Ala Met Ala Leu Glu Cys Trp Leu Ser
115 120 125
Leu Gly His Pro Phe Phe Tyr Gln Arg His Ile Thr Val Arg Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Ala Pro Ala Val Gly Ala Phe Ser Leu Ala Phe Cys Ala
145 150 155 160
Leu Pro Phe Val Gly Phe Gly Asn Phe Val Gln Tyr Cys Pro Gly Thr
165 170 175
Trp Cys Phe Phe Gln Met Ile Ser Gly Asp Asp Ser Pro Ser Val Lys
180 185 190
Gly Tyr Ser Val Leu Tyr Ser Thr Leu Met Ala Leu Leu Val Leu Ala
195 200 205
Ile Val Leu Cys Asn Leu Gly Ala Met Arg Asn Leu Tyr Thr Met His
210 215 220
Gln Arg Leu Arg Arg His Thr Arg Cys Cys Ser Leu Arg Asp Arg Ala
225 230 235 240
Gly Glu Ala Phe Pro Gln Ser Leu Glu Glu Leu Asp His Leu Leu Leu
245 250 255
Leu Ala Leu Met Thr Val Leu Phe Thr Met Cys Thr Leu Pro Leu Val
260 265 270
Tyr Arg Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Lys Ala Val Glu Glu Glu Pro Asp
275 280 285
Asp Leu Leu Ala Leu Arg Phe Leu Ser Val Ile Ser Ile Val Asp Pro
290 295 300
Trp Ile Phe Ile Ile Phe Arg Thr Ser Val Phe Arg Met Phe Phe His
305 310 315 320
Lys Ile Phe Ile Arg Pro Leu Leu Tyr Arg Asn Trp His Cys His Phe
325 330 335
Tyr Gln Thr Asn Val Glu Ser Ser Leu
340 345
机译： 编码新的前列腺素受体蛋白的核酸及其使用方法
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