酶水解大豆异黄酮生产染料木黄酮和黄豆苷元的方法

摘要

本发明提供的是一种酶水解大豆异黄酮生产染料木黄酮和黄豆苷元的方法。以不同纯度的大豆异黄酮粉为原料，应用里氏木酶β－葡萄糖苷酶或大豆β－葡萄糖苷酶中的一种进行水解，再对水解液进行溶剂萃取、超滤及冷冻离心分离纯化，得到染料木黄酮和黄豆苷元。本发明的方法可以使用不同纯度的水解原料。本发明使用的酶是可以直接购买的商品化酶，也可以是自行制备的酶。所用的酶的缓冲溶液可以循环使用。本发明易于操作，转化率较高(＞85％)，产品大豆异黄酮苷元总含量较高。使用从东北大豆中自行提取纯化的大豆β－葡萄糖苷酶可以克服微生物发酵制酶，食用安全性差的问题，可以使产品更加安全。使用商品化的酶，可以降低生产成本。因此，本发明的方法更适合于工业化生产。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及由不同浓度的大豆异黄酮粉生产染料木黄酮和黄豆苷元的方法。更具体地，本发明采用的是从东北大豆中自行提取纯化的大豆β-葡萄糖苷酶及商品化的里氏木酶β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮，并应用溶剂萃取、超滤及冷冻离心等分离纯化方法，由大豆异黄酮粉生产染料木黄酮和黄豆苷元的方法。

(二)背景技术

大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物。大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有12种，可以分为3类，即黄豆苷(daidzin)类、染料木苷(genistin)类、黄豆黄素苷(glycitin)类，分别以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在(Kudou et al.，1991a；Kudou et al.，1991b)。染料木黄酮和黄豆苷元的化学结构式为：

        染料木黄酮(genistein)        黄豆苷元(daidzein)大豆异黄酮葡萄糖苷化学结构式为：

所有大豆异黄酮化合物的化学结构式列入表1：

                                表1大豆异黄酮化合物的化学结构式

  形式  异黄酮类  R₁  R₂  R₃   游离型  daidzein  genistein  glycitein  H  OH  H  H  H  OCH₃  -  -  -   葡萄糖苷型  daidzin  genistin  glycitin  H  OH  H  H  H  OCH₃  H  H  H   丙二酰基葡萄糖苷型  6″-O-malonyldaidzin  6″-O-malonylgenistin  6″-O-malonylglycitin  H  OH  H  H  H  OCH₃  COCH₂COOH  COCH₂COOH  COCH₂COOH   乙酰基葡萄糖苷型  6″-O-acetyldaidzin  6″-O-acetylgenistin  6″-O-acetylglycitin  H  OH  H  H  H  OCH₃  COCH₃  COCH₃  COCH₃

美国等科技水平较高的国家研究表明，在大豆中存在的12种大豆异黄酮中，两种游离形式的异黄酮即染料木黄酮(genistein)和黄豆苷元(daidzein)具有较高的生物活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生(张永忠等，中国粮油学报2004，4)。但是这两种苷元形式的异黄酮在大豆中其含量非常少，不足大豆异黄酮总量的3％。具有较高生理活性作用的大豆异黄酮深加工产品，目前在国内市场尚属空白。在我国许多生产大豆异黄酮的厂家生产的多是纯度为20％、40％、60％含量的大豆异黄酮产品，其中苷元含量极少。物质的化学结构决定着物质的性质，也决定着物质的生物活性。染料木黄酮和黄豆苷元的结构与雌性激素结构相似，具有较强的弱雌激素活性等生物活性。大豆异黄酮苷元是具有高生物活性的异黄酮第二代产品，具有强劲的发展势头，预计将成为未来天然植物制剂市场的主导。国外对异黄酮的研究很多，进展也很快，对异黄酮苷元的制备已经有专利报道，并已建立了工业化生产线，而我国对大豆异黄酮的生产多采取直接溶剂提取，再用树脂纯化。这样制备出来的大豆异黄酮95％以上还是结合态形式，其中游离形式的染料木黄酮和黄豆苷元含量甚少，很难起到调节人体生理功能作用。我国也有人利用酸水解来获得游离形式大豆异黄酮，但强酸条件不易进行工业化。由于强酸水解副产物多，且水解产物主要应用于食品或药品，因此也存在潜在的不安全因素。国外主要研究酶水解。酶水解条件温和，多采用弱酸性的缓冲溶液，大豆异黄酮苷元不易变性，是工业上制备富含大豆异黄酮苷元的保健食品或药品的十分有前途的途径。酶的本质是蛋白质。酶水解不会存在人体食用的潜在危险，是一种理想的水解途径。目前国外高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶还在研制阶段，研究最多的大豆异黄酮糖苷水解酶就是β-葡萄糖苷酶(孙艳梅等，2002)，能够水解大豆异黄酮糖苷的酶还有葡萄糖酸酶、半乳糖苷酶、生物乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等(Shen，et al 1998；Bryan，BarbaraA et al 2002；Tsuruhami，Kazutakaet al 2003)，它们都有很强的水解大豆异黄酮糖苷的能力。使用从东北大豆中自行提取纯化的大豆β-葡萄糖苷酶可以克服微生物发酵制酶，食用安全性差的问题，可以使产品更加安全。使用商品化的酶，可以降低生产成本。

酶催化水解反应的化学反应方程式如下：

染料木黄酮(genistein)

                                                              黄豆苷元(daidzein)

蛋白质技术国际公司中国专利ZL97120435.7公开了使用酶水解制备异黄酮苷元的方法。该专利使用可裂解1，4糖甘键的酶制备异黄酮苷元。所裂解1，4糖甘键的酶来源于黑曲霉、米曲霉、乳克鲁威氏酵母和脆壁克黑曲霉。优选的酶是α-半乳糖酶、β-半乳糖酶、葡糖淀粉酶和果胶酶。

金凤燮申请的中国专利(申请号CN03133637.X)公开了用微生物发酵的方法水解大豆异黄酮糖苷，以制备大豆异黄酮苷元。其中所使用的微生物包括细菌、霉菌、酵母菌和担子菌。在其实施例中使用的微生物包括高温耗氧霉菌Clostridium thermocopriea、黑曲霉(Asperillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、假丝酵母和大肥菇菌(Agaricus bitorguis)。酶解产物用乙醇沉淀或正丁醇萃取分离，可得到大豆异黄酮苷元。该方法的转化率为50-80％。

王哲申请的中国专利(申请号CN200410058379.8)公开了用β-葡萄糖苷酶和膜技术生产大豆异黄酮苷元的方法。该方法以大豆异黄酮粉为基本原料，以大豆蛋白和大豆异黄酮作诱导剂，用培养霉菌释放的胞外酶β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮，并利用选自超滤和透析的膜技术进行酶水解液的后处理，得到大豆异黄酮苷元。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种适合于工业化生产染料木黄酮和黄豆苷元的方法。

本发明的目的是这样实现的：以不同纯度的大豆异黄酮粉为原料，应用里氏木酶β-葡萄糖苷酶或大豆β-葡萄糖苷酶中的一种进行水解，再对水解液进行溶剂萃取、超滤及冷冻离心分离纯化，得到染料木黄酮和黄豆苷元。其水解条件是：酶与底物比为6000～14000U/g，加pH为4.00～6.00缓冲溶液稀释至使反应溶液总体积为800mL/g底物，37～60℃水解1～12小时；得水解液先通过超滤分离，再用1∶1～1∶2的乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯或与它们有相近特性的有机溶剂进行萃取，蒸去有机溶剂，真空干燥，得富含染料木黄酮和黄豆苷元干粉产品；其中，染料木黄酮水解效率可达90％以上，黄豆苷元水解效率可达98％以上。

本发明还可以包括这样一些特征：

1、所述的大豆β-葡萄糖苷酶是采用下述方法得到的：

(1)大豆β-葡萄糖苷酶的提取

取东北大豆全豆，在20℃的水中浸泡20小时，用冷水漂洗；在浸透的大豆中加入0.1mol·L^-1，pH6.60的磷酸盐缓冲溶液，研磨，匀浆；豆浆用4000转/分钟离心3min；上清液用0.1mol·L^-1的HCl酸化至pH5.0，后用自动冷冻离心机8000r/min，4℃，离心10min；上清液即为粗提酶；

(2)大豆β-葡萄糖苷酶的纯化

在上述粗提酶中加入硫酸铵使饱和度达到65～75％，静置15～20小时；8000×g，4℃，冷冻离心10～15min，收集沉淀蛋白，溶于0.05mol·L^-1，pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中；该酶溶液倒入透析袋，在相同缓冲溶液中透析两天，换透析用的缓冲溶液三次以上；酶液出现沉淀，再4000转/分钟离心10min，清液即为部分纯化酶液，上述过程在4～10℃下操作。大豆β-葡萄糖苷酶的纯化也可以采用超滤法。

与已有技术相比，本发明的方法可以使用不同纯度的大豆异黄酮粉。本发明使用的酶是可以直接购买的、可以应用于食品或药品的商品化酶；也可以自行制备。所采用的商品化的酶是里氏木酶β-葡萄糖苷酶。自行制备的酶是从东北大豆中自行提取纯化的大豆β-葡萄糖苷酶。该大豆β-葡萄糖苷酶液在pH5.00时，反应的最佳温度为45℃。该大豆3-葡萄糖苷酶在低于40℃时酶较稳定，50℃加热5min后酶活力减少23％，60℃加热5min后酶活力仅剩了10％左右，到了70℃酶活性全部丧失。该大豆β-葡萄糖苷酶在酸性条件下稳定性较差，pH值为3.00和4.00时，于5℃放置24小时，酶活力分别剩余10％和46％，在pH值为5.00～7.00时较稳定。

本专利采用从东北大豆中自行提取纯化的大豆β-葡萄糖苷酶。纯化的大豆β-葡萄糖苷酶酶反应的最佳温度为45℃，酶反应的最佳pH为5.00。在pH值为5.00～7.00时较稳定。在低于40℃时较稳定，70℃酶活性基本全部丧失。MMatsuura(Matsuura M.；Obata A.，β-Glucosidases from soybeans hydrolyze daidzinand genistin.J.Food Sci.，1993.58(1)，144-147.Matsuura M.；Sasaki J.；Murao S.，Stuies on β-Glucosidases from soybeans that hydrolyze daidzin and genistin：Isolation and characterization of an isozyme.Biosci.Biochem Biochem.，1995.59(9)，1623-1627.)等研究了美国市售大豆中β-葡萄糖苷酶的性质，他们研究的大豆β-葡萄糖苷酶被纯化了456倍，最佳反应温度45℃，与东农42号大豆β-葡萄糖苷酶的相同。最佳pH值为4.50，与东农42号大豆β-葡萄糖苷酶的最佳pH值相近。热稳定性(该酶在50℃加热5min后，酶活力减少59％)比东农42号大豆β-葡萄糖苷酶差得多，pH稳定性(pH值为4.00时，酶活力几乎不减少)比东农42号大豆β-葡萄糖苷酶好。该美国市售大豆中存在的β-葡萄糖苷酶，在45℃时，水解大豆异黄酮糖苷3小时，水解效率为22-29％。东农42号大豆β-葡萄糖苷酶在45℃时，水解大豆异黄酮糖苷3小时，水解反应效率为72％。尽管具体实验条件不同，由于水解效率差异较大，可说明东农42号大豆β-葡萄糖苷酶有较高的水解大豆异黄酮糖苷能力，在加工高含量大豆异黄酮苷元产品中有较高的利用价值。应用大豆β-葡萄糖苷酶进行酶水解，条件温和，节约能源，大豆异黄酮苷元不易变性，安全可靠，是工业上制备大豆异黄酮苷元的十分有前途的途径。

里氏木霉β-葡萄糖苷酶(购买于上海)是淡黄色固体，将其溶解成水溶液，研究其酶学性质。首先确定测定里氏木霉β-葡萄糖苷酶活力的试验条件：底物浓度3mmol·L^-1，反应温度50℃，pH值为5.0，反应时间10分钟。研究发现该酶的热稳定性较好，60℃加热60分钟后，酶活力下降29％；酶在pH 4.5-5左右时较稳定。lmmol·L^-1的Ba²⁺，Ca²⁺，Al³⁺，Mg²⁺和Fe²⁺对酶活无明显的抑制作用，1mmol·L^-1的Ag⁺对酶活有明显的抑制作用，酶活力减少了64％。里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解糖苷型大豆异黄酮的最佳条件为：加酶量20单位、温度50℃、pH4.5、水解时间90分钟。对染料木苷水解率99.03％、黄豆苷水解率98.06％。

本发明易于操作，具有较高的转化率(＞85％)，产品大豆异黄酮苷元总含量较高。本发明使用的酶是可以直接购买的商品化酶，也可以是自行制备的酶。所用的酶的缓冲溶液可以循环使用。使用从东北大豆中自行提取纯化的大豆β-葡萄糖苷酶可以克服微生物发酵制酶，食用安全性差的问题，可以使产品更加安全。使用商品化的酶，可以降低生产成本。因此，本发明的方法更适合于工业化生产。

(四)具体实施方案

下面举例对本发明作更详细的描述：

以下各实施例中酶水解苷元得率的确定为：

异黄酮总量＝糖苷型异黄酮含量+丙二酰基型异黄酮含量+乙酰基大豆异黄酮含量

大豆异黄酮含量测定采用高效液相色谱法。

实施例1  大豆β-葡萄糖苷酶的制备及水解大豆大豆异黄酮

大豆(东农42号，由东北农业大学大豆研究所的提供)全豆500.0g，在20℃的水中浸泡20小时，用冷水漂洗。浸透的大豆中加入0.1mol·L^-1，pH6.60的磷酸盐缓冲溶液5000mL，电动匀浆机匀浆。豆浆用4000转/分钟离心3min。上清液用0.1mol·L^-1的HCl酸化至pH5.0，后用自动冷冻离心机8000r/min，4℃，离心10min。得上清液即为粗提酶。在粗提酶中加入硫酸铵使饱和度达到75％，静置20小时。8000r/min，4℃，冷冻离心10min，收集沉淀蛋白，溶于0.05mol·L^-1，pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中。该酶溶液倒入透析袋，在相同缓冲溶液中透析两天，换透析用的缓冲溶液三次以上。酶液出现沉淀。再4000转/分钟离心10min，清液即为部分纯化酶液。

称取100克40％的大豆异黄酮粉末作为水解底物，按6000U/g酶底物比加入大豆β-葡萄糖苷酶酶液，加缓冲溶液调整pH为5.00，在45℃下水解6hr。水解后，反应液在80-90℃加热5min，使大豆β-葡萄糖苷酶灭活。然后，用乙酸乙酯萃取三次，蒸出乙酸乙酯，真空干燥后得大豆异黄酮苷元粉20.3克，其中染料木黄酮含量为19.6％，黄豆苷元含量为17.2％。

实施例2  里氏木酶β-葡萄糖苷酶(商品酶由里氏木酶发酵得纤维素酶，从纤维素酶中提取纯化得β-葡萄糖苷酶)水解大豆异黄酮粉制备染料木黄酮和黄豆苷元

取100g 20％大豆异黄酮粉(黑龙江省粮食研究所提供)，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调pH至4.5，按酶-底物浓度比为5％加入β-葡萄糖苷酶(β一葡萄糖苷酶的比活力为：23万U/g)，在50℃下水浴振荡水解90min。然后离心过滤分离，分离后的大豆异黄酮苷元沉淀在70℃下用水(水体积为原来液体的4/5)洗30min，放置过夜。离心过滤分离，得到的沉淀再用70℃下用水(水体积为原来液体的4/5)洗15min，离心过滤分离，得到的沉淀用丙酮溶解(丙酮量为沉淀的5倍)，离心分离，不溶于丙酮的沉淀(主要为大豆皂苷)回收。丙酮溶液旋转减压蒸发除去丙酮，得到的沉淀在50℃下真空干燥，得产品5g，收率为5％。产品中总苷元含量为10％，其中黄豆苷元2.5％，染料木黄酮含量为7.5％。

实施例3  制备高含量染料木黄酮和黄豆苷元方法

如果需要制备高含量染料木黄酮和黄豆苷元，可以应用高纯度大豆异黄酮粉为底物进行水解。水解前对大豆异黄酮粉进一步进行纯化，再进行水解。具体方法如下：

准确称取大豆异黄酮粉，按1∶20加入浸取剂丙酮，在60℃下加热搅拌回流萃取3h，提取液在4000r/min条件下离心20min，取上层液体。沉淀用1∶10丙酮再次在60℃下于磁力加热搅拌回流萃取1h，离心分离，合并两次提取液。减压旋转蒸发除去丙酮。纯化后的大豆异黄酮用于酶水解底物，按上述酶最佳水解条件水解后，将水解液在4℃时放置过夜。第2日在4000r/min的条件下离心30min，将沉淀溶于50-60℃温水，再4℃时放置过夜。次日再在4000r/min的条件下离心，沉淀放入真空干燥箱中干燥。将干燥后的固体沉淀研磨成粉末状，制备成相应纯度产品。