在造纸工业中监控生物膜形成微生物的存在的方法

摘要

本发明涉及在纸张或纸板制造工艺中检测生物膜形成微生物是否存在以确定在该工艺中抗生物膜剂的需要的方法。该方法包括下述步骤：(a)将取样器装置置于生产线中一段时间，使所述微生物能在所述工艺中在取样器表面上就地形成生物膜，(b)任选地在试验抗生物膜剂的溶液内处理在其上具有所述形成的生物膜的取样器表面一段时间，然后(c)在培养装置的凹穴内，使所述生物膜与液体生长介质接触一段时间，和(d)从所述装置的凹穴中取出生长溶液，并定性和/或定量地检测在凹穴壁上是否存在粘附的生物膜。本发明还提供一种组件盒。

说明书

发明领域

本发明涉及在纸张和纸板制造工业中监控生物膜形成微生物的存在以确定在该工艺中是否需要抗生物膜试剂的方法。此外，还提供用于该方法的组件盒(assembly kit)。

发明背景

纸张和纸板制造工艺含有富含生物可降解养分且具有有益pH(例如pH 4-9)的温热生产用水(例如，45-60℃)，因而提供微生物生长的良好环境。在该工艺中微生物显示出形成生物膜，即表面附着式生长，和自由泳式，即浮游生物式生长。造纸工业中的数个问题因生物膜，即粘泥层引起，所述生物膜在工艺设备的表面上形成且可从表面上剥落。机器表面的生物结垢和松散的生物膜/聚集体可引起严重的工艺干扰：降低水的流量；阻塞过滤器、丝网等；例如通过在成品内引起空穴或着色斑点劣化成品质量；或者使整个纸幅断裂。生物膜难以从工艺设备的表面上除去，且常常需要使用非常强的化学品。

为了控制微生物生长，将例如杀生物剂加入到生产用水中。通过杀生物剂有效地控制浮游微生物，然而，使用杀生物剂还没有解决纸张或纸板机器中的所有生物膜的问题。存在数个原因，例如宽范围的各种微生物在造纸工艺中生长，且还已知在生物膜内的细菌生长通常比浮游微生物对杀生物剂更具有抗性。

发明人之一，Kolari，M.在Attachment Mechanisms andProperties of Bacterial Biofilms on Non-Living Surfaces，Dissertationes Biocentri Viikki Universitatis Helsingiensis12/2003，博士论文，University of Helsinki，Finland中最近研究了在纸张和纸板工业中的生物膜形成剂。在研究中，确定了生物膜形成剂并研究其相互作用。因此，发现该工艺包括不同类型的生物膜形成微生物：能粘附到清洁表面上的主生物膜形成剂，和然后粘附到主生物膜上的辅助生物膜形成剂。主生物膜形成剂似乎是在纸张和纸板机器内数种其它微生物成功地表面定居的先决条件。例如，Deinococcus geothermalis是一种主生物膜形成剂，而数种杆菌属(Bacillus)物种的菌株粘附到这一细菌的主生物膜上。Kolari等人在Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，(2003)30，p.225-238中公开了更多的主生物膜形成剂。在修正最新、未出版公开的数据的情况下，迄今为止被人们认识的相关的主生物膜形成微生物是：Deinococcus geothermalis物种；Meiothermus属，如M.silvanus或M.ruber物种，Azospirillum属；Burkholderia属，如B.multivorans或B.cepacia；Porphyrobacter属，如P.cryptus；“Rubellimicrobium”属；和Thermomonas属，如T.haemolytica或T.hydrothermalis。主生物膜形成剂典型地适度耐热，其中一些具有高至67℃的最大生长温度，和大多数菌株在45-55℃的温度下显示出最快速的生长。然而，没有讨论克服在造纸工业中与生物膜有关的问题。

如上所述，在纸张和纸板机器内粘泥形成的过程中，似乎生物膜形成剂是最有害的微生物，和预防它们将改进生产机器的功能，并进而改进该工艺的产率。由于这一目的，申请人在最近的专利申请FI20021986和FI20021987中公开了一类新型的抗生物膜剂，它来自于植物，且可在纸张或纸板制造工艺中用于防止形成生物膜和/或除去已经形成的生物膜。

有效使用杀生物剂或所述抗生物膜剂将需要有效的监控方法。在造纸工业中，微生物生长的典型监控方法是在实验室中培养生产用水的样品。然而，这种培养方法耗时且复杂，即它们耗时数天，且特别地要求使用各种生长介质用于分离和鉴定样品内的不同类型的微生物。此外，已知在实验室中微生物生长依赖于培养介质，由此存在于样品内的部分微生物常常无法在实验室条件下生长。此外，监控典型地集中在自由泳式微生物上。还缺少用于监控抗生物膜剂对生物膜形成微生物影响的有效方法。因此，例如杀生物剂常规地用于非选择性抑制该工艺内的所有微生物，由此常常要求大量的杀生物剂。

申请人的FI95597公开了一种装置，它可在实验室中使用或者引入到在其载玻片上产生生物膜的造纸工艺中。采用纯酵母培养物或者通过将该装置置入生产用水中，从而形成生物膜。使用常规的平板培养法，通过计算每cm²上的酵母细胞的数量，来分析生长。如前所述，平板培养法在鉴定有害微生物和筛选例如合适的杀生物剂这两方面均是耗时的。此外，在生物膜内的一部分微生物可能无法在培养介质上生长。

US6326190和US6410256公开了一种方法，其中在装置内排列的多个突出部分(protrusion)的表面上形成细菌生物膜并测定生物膜对抗菌剂的灵敏度。然而，在所述方法中，采用常规的耗时技术，即通过在特定的实验室装置内使用在实验室中培养的纯的培养物，来形成生物膜。

因此，在造纸工业中仍需要更加有效的监控粘泥形成的方法。

发明目的

本发明的目的是提供用于造纸工业的进一步的检测方法，该方法能以有效且节约时间的方式监控在纸张或纸板制造工艺中的微生物状态。

本发明进一步的目的是提供一种检测方法，该方法可用于选择性监控在造纸工业中有害的生物膜形成微生物，且可用于筛选抗生物膜剂，所述抗生物膜剂对在工艺条件下生长的生物膜最具有活性。

本发明另一目的是提供一种组件盒，它能非常可行地用于在处理场所进行的本发明的检测方法。

附图简述

图1代表在实施例中使用的取样器装置和处理/培养装置的一个优选的实施方案。

发明详述

发明人已发现，可在纸张或纸板制造工艺中，在取样器装置的表面上就地形成生物膜，并可视需要直接从所述表面就有害的生物膜形成剂，特别是主生物膜形成剂的存在和量对在所述表面上形成的生物膜进行分析。因此，在本发明中，不需要从取样器表面上除去就地形成的生物膜。

此外，发明人已开发了在取样器表面上形成的生物膜的检测方法，该方法快于目前使用的培养基方法，且可用于检测在特定的生产场所处实际的生物膜形成剂的出现，和用于选择最有效的抗生物膜剂和对抗在该场所处所述实际生物膜的抗生物膜剂的有效浓度。

现已开发的检测方法可用于监控在纸张或纸板制造工艺中抗生物膜剂的需要，尤其是否需要任何抗生物膜剂，是否需要进一步添加它和/或待添加的抗生物膜剂的有效/最佳用量。

以下在权利要求中定义了本发明的特性特征。

因此，本发明提供在纸张或纸板制造工艺中监控微生物生长以确定在该工艺中抗生物膜剂的需要的检测方法，该方法包括下述步骤：

(a)将取样器装置置于生产线中例如3小时-7天，优选12小时-3天的时间段，使所述微生物能在所述工艺中在取样器表面上就地形成生物膜，

(b)任选地在介于环境温度至65℃的温度下，例如在35-65℃下，优选在40-60℃下，更优选在接近于生产线的取样场所的工艺温度的温度下，如在40-60℃下，在试验抗生物膜剂的溶液内处理所述形成的生物膜，优选在其上具有所述形成的生物膜的取样器表面例如10分钟-4小时，优选1-2小时的时间段，然后

(c)在介于环境温度至65℃的温度下，例如在35-65℃下，优选在40-60℃下，更优选在接近于生产线的取样场所的工艺温度的温度下，如在40-60℃下，在培养装置的凹穴内，使所述生物膜，优选在其上具有所述生物膜的取样器表面与液体生长介质接触例如8-48小时，优选8-24小时，更优选16-20小时的时间段，

(d)从所述装置的凹穴中取出生长溶液，和在生物膜原地位于取样器表面的情况下，还从所述装置的凹穴中取出取样器，并定性和/或定量地检测在凹穴壁上是否存在粘附的生物膜。

此处所使用的术语“纸张或纸板制造工艺”和此处所使用的“生产线”涵盖用于纸张原材料和纸浆工业的湿法制造工艺的生产线、制浆工艺、制浆干燥工艺，实际的纸张或纸板制造工艺及其设备(包括纸张和纸板机器)。纸张和纸板机器要理解为包括具有丝网部分的湿部和干燥部这二者。

取样器装置可置于生产线的任何位置上，其中包括纸张或纸板机器的湿部部分和生产线的干燥部。此外，取样器装置的暴露环境可以是任何工艺介质，其中包括生产用水、纸浆悬浮液、循环和废水、原材料、试剂和中间产品等。该装置可浸渍在液体物流内或者引入到生产线的溅射区域内。

此外，取样器装置可包括用于将其固定到例如造纸设备表面上，例如在造纸机的生产用水容器内的装置。或者，生产线的取样场所可配有安装设备，其中可固定取样器装置，其时间为在其表面上形成生物膜的时间段。在该工艺中，在装置表面上形成生物膜所需要的时间取决于在生产线内的场所和工艺类型，因此可由本领域的技术人员来选择。例如当该装置在中性造纸机的丝网部分内时，取决于机器的清洁度，暴露时间为12-48小时，即离最后一次停顿和洗涤的延迟。

在从该工艺中取出取样器之后，可任选地漂洗或洗涤暴露于形成生物膜的表面，以除去任何松散的材料。

在本发明的一个优选的实施方案中，对所形成的生物膜进行任选的处理步骤(b)和培养步骤(c)，同时所形成的生物膜保持在原地，即粘附在取样器的表面上。

优选地，该方法包括用一种或多种试验抗生物膜剂的处理步骤(b)用以选择在有利浓度下的最有效的抗生物膜剂。

优选通过在含有试验抗生物膜剂的溶液内浸渍在其上具有生物膜的取样器的表面，从而进行处理步骤(b)。可在配有凹穴的处理装置内进行处理，所述凹穴用含试验抗生物膜剂的溶液填充。试验抗生物膜剂溶解在优选为液体生长介质、灭菌水和/或生产用水的溶液内。优选通过在常规的震荡器内，例如在介于150-250rpm下，在例如以上定义的温度下震荡处理装置例如以上定义的时间段，从而进行处理。在处理步骤之后，适当地例如用无菌水洗涤表面。优选地，同样从相同的取样场所提供参考样品，所述参考样品用相同的溶液处理，但不存在任何试验抗生物膜剂。

在本发明的方法中，优选在各种浓度下测试一种或多种抗生物膜剂对存在于被监控工艺内的生物膜形成剂的效率并测定在该工艺场所处使用的试剂的有用/最佳浓度。在数种抗生物膜剂/浓度的情况下，可使用数种取样器装置，所述取样器装置保持在生产线的相同场所内，且每一取样器对应于一种试剂和一种浓度。更优选的是，取样器装置配有多个独立的表面，由此每一独立的表面可在步骤(b)中用一种抗生物膜剂和一种浓度处理，且同样独立地在步骤(c)中培养。此外，在步骤(b)中，一种或多种装置或表面典型地未用试验抗生物膜剂处理，作为参考样品，即仅仅用溶液处理。本发明的处理步骤(b)提供关于所测试的抗生物膜剂对该工艺中有害生物膜的效率的可靠信息，因为试验聚焦在其生长的生物膜模型中的实际生物膜形成剂上，即预生长生物膜上。

在任选的处理步骤(b)之后，可在培养步骤(c)之前漂洗或洗涤处理过的生物膜。优选通过在溶液内浸渍在其上具有任选处理的生物膜的所述取样器的表面，在配有用液体生长介质填充的凹穴的培养装置内进行任选处理的生物膜的培养。培养步骤所使用的时间和温度例如如上所定义。在优选的实施方案中，例如，采用常规的震荡器，例如在150-260rpm下震荡，从而进行培养步骤，这是因为发现震荡非常有利于生物膜的形成。震荡器可合适地安排有加热装置用以提供所需的温度。步骤(c)用于在该装置的壁上形成生物膜，然后可使之在随后的步骤(d)中染色，以便定性和/或定量地检测在生产线的取样场所内是否存在生物膜形成剂。优选地，该方法包括处理步骤(b)，通过这一步骤显示生物膜形成微生物存活通过抗生物膜剂处理步骤的程度。

因此，在培养步骤之后，生长溶液，和在原地处理生物膜，即同时粘附在取样器表面上的情况下，在任选的步骤(b)和紧跟的步骤(c)之后，取样器也在步骤(d)中从培养装置的凹穴中取出，任选地洗涤，优选用无菌水洗涤凹穴，以除去任何松散的材料，并使粘附在凹穴器壁上的任何生物膜形成微生物染色，按照已知的方式，定性，例如目测，或定量，例如分光光度法检测在凹穴内的颜色形成是否存在和/或强度。合适的染色剂包括适合于使生物膜染色的任何常规的试剂，例如：

-显示出生物物质的通用染色剂，例如结晶紫或藏红花色素，

-显示出细胞数量的染色剂，例如吖啶橙、溴化3，8-二胺基-5-乙基-6-苯基菲啶、DAPI、SYTO16或其它核酸染色剂，

-微生物细胞存活性的染色剂，例如LIVE/DEAD^TM、CTC或各种四唑化合物，

-功能特异的荧光染色剂，例如检测淀粉降解活性、甲壳素酶活性、酯酶活性、脂酶水解活性或磷酸酶活性的荧光酶底物。

在本发明方法的优选实施方案中，取样器装置包括支持，即连接在支持体上的多个伸长的突出部分，由此当引入到该工艺内时，在突出部分的每一表面上类似地形成生物膜。突出部分的材料例如可以是不锈钢，塑料，如聚苯乙烯，或者陶瓷，优选不锈钢。在所述实施方案中，任选的处理装置还配有含一种或多种浓度的一种或多种试验抗生物膜剂的所述溶液的多个凹穴(其中在每一个凹穴内具有一种试验抗生物膜剂和一种浓度)以及不具有试验抗生物膜剂的所述溶液(＝参考)的凹穴，以便从生产线的取样场所中取出取样器之后，所述取样器的突出部分可浸渍在所述凹穴内，其中在每一个凹穴内具有一个突出部分。在所述实施方案中，培养装置也包括含有生长溶液的多个凹穴，以便在步骤(b)中任选地处理的所述取样器的突出部分可浸渍在培养装置的凹穴内的所述溶液中，其中在每一个凹穴内具有一个突出部分。

令人惊奇的是，在突出部分上形成的生物膜对本发明的方法来说是足够的，且具有的进一步的优势是，不要求从突出部分中除去生物膜，这将简化和加速监控。本发明的易于应用的实施方案的主要优势是，可对在真实的工艺条件下预生长的多种类似生物膜同时测试数种不同的抗生物膜剂。

此外，采用本发明的情况下，可就在其实际的生物膜生长状态下的抗生物膜剂测试生产线中取样场所的真实的生物膜形成剂，由此就所测试的抗生物膜剂的效率来说，可获得更加可靠的结果。

所述优选的取样器装置可以是任何体系，其中伸长的突出部分一端固定在支持体上，优选固定在平面支持体上。取样器的尺寸没有限制，并可根据所选的工艺内的取样位置和分析体系而变化。在进一步优选的实施方案中，取样器装置包括排列成行且一端固定在支持板上的多个销(pin)或钉(peg)；和任选步骤(b)的处理装置和步骤(c)的培养装置是配有排列成行的多个孔且适合于在一个孔内接收一个突出销或钉的板，以便取样器装置的每一个销/钉位于处理和培养装置的板的每一孔内。优选地，取样器装置是配有在其上永久固定的数排销/钉的盖(lid)，以便盖可与例如可商购的多孔板，如6-、12-或24-孔板，优选12孔板，如12孔聚苯乙烯板一起使用作为处理装置(b)和培养装置(c)。自然的是，希望选择处理和培养板中孔的数量和行数，使之与盖的销/钉的数量和行数相匹配，以便当盖置于多孔板上时，每一个销/钉位于板中的一个孔内。因此，在处理和培养步骤过程中，销/钉的一端浸渍在板中的孔内存在的液体介质中，而另一端固定在盖上。

已发现，取样器装置，例如具有销/钉的盖非常有利于在纸张或纸板制造工艺中就地产生生物膜。也已发现，在该工艺中，对于本发明的取样器来说，不需要覆盖物/外壳，在该工艺中可以如此放置取样器和暴露突出部分，以便突出部分直接与工艺条件，例如生产用水物流或溅射的水接触。

可甚至在12-48小时内检测在取样器装置上由主生物膜形成剂形成的生物膜。可甚至在18小时内实现抗生物膜剂抗预生长的生物膜的效力。因此，与现有技术的方法相比，本发明的方法能对该工艺内的生物膜生长的任何变化以及对由于所述微生物导致已经出现的任何问题情况作出快速反应。

因此，在一个优选的实施方案中，在该工艺的一个或多个位置处进行连续监控，由此可在没有任何过度延迟的情况下，决定例如添加或进一步添加抗生物膜剂、其类型和有效量所要求的行动，而当使用现有技术的方法时，过度延迟则是显而易见的。由于相同的原因，可优化抗生物膜剂的添加，预期在该工艺中例如严重的故障并进而避免它。

任选地，可使用取样器上的突出部分作为起始点用于分离形成主生物膜的微生物。任选地，也可对在取样器上的突出部分染色，并可量化在暴露于工艺条件下的过程中生长的生物膜。

本发明进一步提供一种组件盒，用于在纸张或纸板制造工艺中监控是否存在生物膜形成微生物，并用于测定在该工艺中是否需要抗生物膜，和任选地用于选择最有效的抗生物膜剂。该组件盒包括至少下述的结合：

(i)取样器装置，所述取样器装置包括连接到支持体上的多个伸长的突出部分，使得所述微生物能在所述工艺内在取样器的表面上就地形成生物膜，

(ii)任选的处理装置，所述处理装置包括配有多个凹穴的板，其中排列所述凹穴，以便在每一个凹穴内接收取样器装置的一个突出部分，

(iii)培养装置，所述培养装置包括配有多个凹穴的板，其中排列所述凹穴，以便在每一个凹穴内接收取样器装置的一个突出部分，

(iv)震荡处理和/或培养装置的震荡器，

(v)任选的检测器，所述检测器用于检测在培养装置的凹穴内是否存在粘附的任何染色的微生物，和

(vi)含下述的试剂：

(a)一种或多种适合于造纸工业的试验抗生物膜剂，优选一种或多种稀释形式，

(b)液体生长介质，

(c)染色剂，和

(d)任选的洗液，如无菌水。

优选地，组件盒包括(i)所述取样器，它是配有一端固定在盖上的排列成行的多个销/钉的盖，(ii)处理装置，和(iii)培养装置，这二者均是配有排列成行的多个孔的多孔板，由此当取样器盖置于处理或培养板上时，取样器的销/钉位于处理和培养板的孔内，其中一个销/钉位于每一孔内。这种装置如上所述。

此外，在一个实施方案中，(ii)用一种或多种浓度的一种或多种抗生物膜剂在液体生长介质或灭菌水内的溶液预填充处理板的孔，其中每一孔内填充一种试验抗生物膜剂，并单独用生长介质或灭菌水预填充至少一个孔(参考孔)，和(iii)用液体生长介质预填充培养板的孔，并用可除去的覆盖物，如箔密封孔。

此处所使用的“抗生物膜剂”通常是指抑制或防止微生物生长的任何试剂。优选的抗生物膜剂适合于抑制在造纸工业中出现的生物膜形成微生物生长的生物膜模型，和更优选在造纸工业中的主生物膜形成剂，例如Deinococcus geothermalis和/或以上提及的其它主生物膜形成剂。抗生物膜剂包括可商购的杀生物化学品，例如2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)和亚甲基双硫代氰酸酯(MBT)，以及植物来源的抗生物膜剂、纯化合物和提取物，如在以上提及的专利申请FI20021986和FI20021987中提及的那些，优选酚类化合物，例如棓酸(gallate)辛酯和棓酸月桂酯，桦木醇和黄酮醇，例如五羟基黄酮和三羟基黄酮。以上所使用的术语“试验抗生物膜剂”在此处是指一种抗生物膜剂，例如化合物，两种或多种抗生物膜剂的混合物，例如待测试和一起使用的化合物的任何组合，或者提取物，例如植物提取物。试验抗生物膜剂优选如上所述溶解在水溶液内。

生长介质是一种溶液，且可例如选自适合于造纸工业中出现的微生物，特别是生物膜形成剂，更特别地适合于主生物膜形成剂的可商购的含水生长溶液，例如R2-肉汤(例如商购于Difco)，和优选含有外加的养分的灭菌纸张或纸板机器的生产用水。

部分或所有试剂可以在多剂量的容器内，例如在瓶子内，或者在单位剂量的容器内，或者预填充在以上提及的所述装置的凹穴内。

用于组件盒的合适的染色剂包括适合于使生物膜染色的任何常规的试剂，如以上提及的那些。此外，若组件盒用于定量测定的话，也可提供用于从凹穴中溶解染色剂的试剂，例如乙醇。

组件盒可进一步包括例如适合于震荡处理和/或培养板的震荡器，所述震荡器优选可配有加热体系用于例如在处理和/或配有步骤过程中板的保温。此外，检测器，例如用于吸光或荧光测量的多孔板读数器可包括在组件盒内。检测器的类型取决于生物膜微生物所使用的染色方法。移液管也可包括在组件盒内。

实施例

在这一实验中，本发明的取样器装置的一个实施方案用于阐述测定在造纸机内形成的生物膜失活过程中数种抗生物膜剂影响的本发明方法。

在这一实施方案中，取样器装置包括一端固定在不锈钢盖上的12根不锈钢钉。图1中列出了具有钉的盖以及当盖置于处理板上时具有适合于接收钉的12孔的处理板。合适地，设计盖与可商购的12孔聚苯乙烯板互补。

将三个取样器盖浸渍在中性高级纸造纸机的透明的滤液贮仓内，并使之在生产用水的温度52℃下悬挂浸渍在所述滤液中68小时。然后取出取样器，用灭菌的自来水漂洗1次，并将每一盖置于12孔处理板上，以便具有在该工艺中在其表面上就地形成的生物膜的钉浸渍在孔内的处理溶液中，其中每一钉对应于每一孔，同时一端通过盖支持。

处理板的每一孔单独含有3.5ml灭菌自来水(参考样品)或者3.5ml灭菌自来水与浓度为1-50ppm的抗生物膜剂(活性物质)。使用孔的最大体积，以便钉的几乎全部长度暴露于抗生物膜剂(处理溶液)下。所测试的抗生物膜剂是BCDMH(溴-氯-5，5-二甲基乙内酰脲)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合物、THPS(四(羟甲基)硫酸盐)、DBNPA(2，2-二溴-2-氰基乙酰胺)、戊二醛、MBT(亚甲基双(硫代氰酸酯))、BNPD(溴-2-硝基丙-1，3-二醇)，所有这些均可商购。

通过在52℃下静止保温培育在其上具有盖的板2小时，进行抗生物膜处理步骤。在该处理步骤之后，从板上取下盖，并用灭菌自来水漂洗3次，然后置于与处理板相类似的12孔培养板上，但每一孔含有2.5ml灭菌R2-肉汤(Difco)。培养板(浸渍在孔内的板+具有钉的盖)在250rpm下，在52℃下震荡17小时。

最后，从孔中除去钉和生长介质，用自来水漂洗孔，并用藏红花色素对在孔壁上粘附的微生物染色。肉眼评价通过用抗生物膜剂处理存活下来的微生物所产生的生物膜的含量。

因此，在这一实验中，DBNPA、BCDMH、THPS和戊二醛可杀灭或除去在钉上的生物膜，结果在培养步骤过程中没有形成新的生物膜。然而，在用异噻唑啉酮、MBT或BNPD处理钉上的生物膜之后，处理过的生物膜仍然能在培养步骤过程中在培养装置的孔壁表面上形成新的生物膜。通过5ppm的DBNPA实现用最低抗生物膜剂浓度防止培养步骤中新的生物膜的再生长。