用于缺血性心脏病的细胞疗法的内皮氧化氮合酶转录增强剂

摘要

本发明涉及增强内皮氧化氮合酶(eNOS)转录的化合物用于在患有缺血性心脏病如冠心病或缺血性心肌病的患者的细胞疗法中处理干细胞和祖细胞的用途。在施用之前将这类从骨髓中分离得到的细胞例如用eNOS转录增强剂进行处理可提高它们的功能活性并改善心脏的新血管形成和心脏再生。

说明书

本发明涉及增强内皮氧化氮合酶(eNOS)转录的化合物用于在患有缺血性心脏病如冠心病或缺血性心肌病的患者的细胞疗法中处理干细胞和祖细胞的用途。在施用之前将这类例如可由骨髓分离得到的细胞用eNOS转录增强剂进行处理可提高它们的功能活性并改善心脏的新血管形成和心脏再生。

在患有缺血性心脏病如冠心病或缺血性心肌病的患者中，梗塞后心力衰竭仍然是发病率和死亡率的主要原因。虽然被阻塞动脉的迅速再灌注已经显著降低了早期的死亡率，但是在急性心肌梗塞幸存的患者中，以梗塞区域的进行性扩大和左心室腔的扩张为特征的心室重塑过程常常造成心力衰竭的发生。逆转该重塑的主要目标是刺激新血管形成以及促进梗塞区域内心肌细胞的再生。

近期研究的结果已经表明，内皮干细胞和祖细胞在出生后的新血管形成和心脏再生中发挥重要作用。在严重缺血后增加新血管形成是一种重要的治疗选择，例如，在诸如心肌梗塞或肢体缺血等事件之后。直到近期，人们认为成年人缺血组织的新血管形成局限于成熟内皮细胞的迁移和增殖—一个被称为血管生成的过程。同时，越来越多的证据表明循环的内皮祖细胞(EPC)寻靶至缺血部位并促进新血管的形成(C.Kalka等人，用于治疗性新血管形成的离体扩增的内皮祖细胞移植，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000，97：3422-7)。与源自原始内皮祖细胞(成血管细胞)的血管的胚胎发育类似，该过程被称为血管发生。循环祖细胞募集的遗传抑制可抑制肿瘤血管生成这一事实证明了它们的重要性。血管内皮生长因子(VEGF)或基质细胞源因子(SDF)-1可使EPC从骨髓转移到循环中。在缺氧组织中VEGF和SDF-1均被大量上调，这表明在严重缺血后VEGF和SDF-1构成了寻靶信号以募集循环的祖细胞，从而促进内皮修复机制(S.H.Lee等人，在急性心肌缺血和梗塞中血管生成因子的早期表达，N.Engl.J.Med.2000，342：626-33)。

近期的实验研究证明由骨髓或血液获得的祖细胞有助于梗塞心肌的再生并促进缺血心肌的新血管形成(A.A.Kocher等人，缺血心肌通过人骨髓源成血管细胞的新血管形成可预防心肌细胞凋亡、减少重塑和增强心脏功能，Nat.Med.2001，7：430-6；D.Orlic等人，骨髓细胞使梗塞心肌再生，Nature 2001，410：701-5；S.Fuchs等人，在无选择的晚期冠状动脉病患者中进行的基于导管的自体骨髓心肌注射：可行性研究，J.Am.Coll.Cardiol.2003，41：1721-4)。此外，在实验诱导的心肌梗塞后和在慢性缺血性心脏病患者中静脉内输注或心肌内注射成人祖细胞均产生心脏功能的持续改善。在临床上已经证实，在急性心肌梗塞患者和慢性缺血性心肌病患者中冠脉内输注成人干细胞和祖细胞均是可行的且安全的(B.Assmus等人，祖细胞移植和在急性心肌梗塞中的再生促进作用(TOPCARE-AMI)，Circulation2002，106：3009-17；B.E.Strauer等人，在人中通过自体冠状动脉内单核骨髓细胞移植修复梗塞的心肌，Circulation 2002，106：1913-8)。这类在患者中进行的自体细胞治疗形式的细胞疗法可显著地改善局部和整个左心室的功能。

缺血性心脏病患者细胞疗法成功的必要条件是被移植细胞寻靶并从而移入心脏的靶区域，尤其是当选择血管内施用途径时。虽然在缺血性心脏病患者和健康对照者中各种类型的骨髓干细胞和祖细胞如间充质和造血干细胞和祖细胞的数量是相似的，但不幸的是缺血性心脏病患者的干细胞和祖细胞的功能活性受损并且它们的寻靶能力降低。来自冠心病患者的干细胞和祖细胞的这种功能受损限制了它们在临床细胞疗法中的治疗潜能。当使用血管内施用途径时尤其如此，所述血管内施用途径要求祖细胞逆化学引诱物梯度外渗以便进入并寻靶至缺血组织。干细胞和祖细胞的功能活性和寻靶能力可通过测定它们的集落形成能力或迁移活性来评价，例如响应于VEGF和SDF-1的集落形成能力或迁移活性。在进行细胞疗法之前监测干细胞和祖细胞的迁移活性或集落形成活性可用作替代实验以确定可从细胞疗法中获得更大利益的患者。另一方面，最近已有报道，由来自健康小鼠供体的全功能骨髓得到的EPC在新血管形成受损的鼠类模型中可恢复衰老宿主的心脏血管生成(J.M.Edelberg等人，年轻成年骨髓源内皮前体细胞可恢复衰老受损的心脏血管生成功能，Circ.Res.2002，90：e89-e93)。因此，如果通过适宜的方法、例如通过在施用前进行药理学或基因学操作能使缺血性心脏病患者的功能受损的干细胞和祖细胞的活性被恢复并从而使患者从细胞疗法中获得的益处增加将是有利的。

令人惊奇的是，现已发现缺血性心脏病患者的干细胞和祖细胞的受损的功能可通过与内皮氧化氮合酶转录增强剂一起进行孵育而被大大改善。在重新施用之前将患者的细胞用eNOS转录增强剂进行离体处理，由此产生的内皮氧化氮合酶表达增加可提高或恢复这些细胞的功能活性，这一点已经用迁移测定法(transmigration assay)在体外和用如下所述的鼠后肢缺血模型在体内得到了证实。在后者的模型中，通过血流量测定法测定了股动脉结扎后的新血管形成，并且已经发现如果将来自缺血性心脏病患者的干细胞和祖细胞用eNOS转录增强剂预处理后再进行施用，则有益作用大大增加。所观察到的作用确实是由于内皮氧化氮合酶的活性提高所导致的，并且已经通过抵消已知为eNOS和NO形成抑制剂的N^G-一甲基-L-精氨酸(L-NMMA)的作用证实了NO的形成。在存在eNOS转录增强剂和L-NMMA的条件下对来自缺血性心脏病患者的干细胞和祖细胞进行孵育不会导致功能活性提高。

因此，本发明的主题是内皮氧化氮合酶转录增强剂用于在缺血性心脏病患者的细胞疗法中处理干细胞和/或祖细胞的用途，以及内皮氧化氮合酶转录增强剂在制备药物中的用途，所述药物用于在缺血性心脏病患者的细胞疗法中处理干细胞和/或祖细胞，和制备用于在缺血性心脏病患者的细胞疗法中处理干细胞和/或祖细胞的药物的方法，该方法包括使用内皮氧化氮合酶转录增强剂，以及在缺血性心脏病患者的细胞疗法中处理干细胞和/或祖细胞的方法，该方法包括用内皮氧化氮合酶转录增强剂处理细胞。

内皮NO合酶(eNOS，NOS-III)属于通过氧化精氨酸而产生信使分子氧化氮(NO)的三种同功酶组成的组。源于内皮的NO在许多关键的心血管机制中非常重要。它具有血管舒张作用，并且抑制血小板聚集、白细胞对内皮的粘附和内膜平滑肌细胞的增殖。内皮NO合酶在转录水平上和在转录后水平上均受到生理和病理生理调节。eNOS表达在内皮细胞中的上调是治疗和预防包括心血管疾病如冠心病和动脉粥样化形成在内的各种病症的有效手段。增强eNOS转录的化合物在例如WO 02/064146、WO 02/064545、WO 02/064546和WO 02/064565中有描述。在这些参考文献中没有述及在缺血性心脏病患者的细胞疗法中通过对干细胞和祖细胞进行离体处理而产生的对这类细胞功能的有益作用。关于eNOS对干细胞和祖细胞从骨髓移入循环系统中的重要性，近期已有报道(A.Aicher等人，内皮氧化氮合酶在干细胞和祖细胞移动中的重要作用，Nat.Med.2003；9：1370-1376)。

在本发明的一个优选实施方案中，使用了WO 02/064146、WO02/064545、WO 02/064546和WO 02/064565以及相应的专利文件如US2003/0008915、US 2003/0022935、US 2003/0022939和US 2003/0055093中所公开的eNOS转录增强剂，将这些文献的内容引入本文作为参考。在本发明的一个更优选的实施方案中，使用了式I的eNOS转录增强剂，

其中

n为1、2或3；

R为苯基或Hetar基团，二者均是未被取代的或带有1、2、3或4个相同或不同的取代基，所述取代基选自F；Cl；Br；C₁-C₃-烷基；C₁-C₃-烷氧基甲基；2-氨基-3，3，3-三氟丙基-；CF₃；C₃-C₅-烷二基；苯基；杂芳基；苄基；杂芳基-甲基-；OH；C₁-C₃-烷氧基；苯氧基；三氟甲氧基；2，2，2-三氟乙氧基；(C₁-C₄-烷基)COO；(C₁-C₃-烷基)巯基；苯基巯基；(C₁-C₃-烷基)磺酰基；苯基磺酰基；NH₂；(C₁-C₄-烷基)氨基；二(C₁-C₄-烷基)氨基；(C₁-C₃-烷基)-CONH-；(C₁-C₃-烷基)-SO₂NH-；(C₁-C₃-烷基)-CO；苯基-CO；-OCH₂O-；-OCF₂O-；-CH₂CH₂O-；COO(C₁-C₄-烷基)；-CONH₂；-CONH(C₁-C₄-烷基)；-CON(二(C₁-C₄-烷基))；CN；-SO₂NH₂；-SO₂NH(C₁-C₄-烷基)；-SO₂N(二(C₁-C₄-烷基))；吡咯烷基；哌啶基；吗啉基；和硫代吗啉基；其中任选地存在于所述苯基或所述Hetar基团的所述取代基中的所有杂芳基、苯基、含杂芳基和含苯基的基团是未被取代的或被1、2、3或4个相同或不同的选自F、Cl、Br、CN、C₁-C₃-烷基、OH、C₁-C₃-烷氧基和CF₃的取代基取代；

杂芳基和Hetar基团彼此独立地为5-元至10-元的、芳族的、含有1、2、3或4个相同或不同的选自N、O和S的杂原子的单环或二环杂环；

其为任何立体异构形式或它们任何比例的混合物，或其可药用盐。

如果在式I化合物中基团或取代基如例如苯基、杂芳基、烷基等可以出现多次，则它们都彼此独立地具有所给出的含义，因此在每种情况下可以彼此相同或不同。一个实例为二(C₁-C₄-烷基)氨基，其中的烷基取代基可以相同或不同。

烷基残基可以是直链的或支链的、非环状的或环状的。当它们为其它基团例如烷氧基、烷氧基羰基或氨基的一部分时或者当它们被取代时，这也是适用的。

烷基的实例有甲基、乙基、丙基、丁基、这些残基的正异构体、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基。本文中的术语烷基还特别包括含有至少三个碳原子的环烷基残基和环烷基-烷基-残基(被环烷基取代的烷基)。这类环烷基残基的实例有环丙基和环丁基。环烷基可以被一个或多个相同或不同的(C₁-C₄)-烷基残基、特别是甲基取代。此外，除非另有说明，否则本文的术语烷基也包括未被取代的烷基残基以及被一个或多个、例如1、2、3或4个相同或不同的残基例如苯基取代的烷基残基。在被取代的烷基残基例如苯基烷基中，取代基可以存在于任何所需的位置。

C₃-C₅-烷二基的实例有-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂-CH(CH₃)-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-基团。

除非另有说明，否则上述的苯基残基和包括杂芳基残基在内的杂环基残基可以是未被取代的或者可以带有1、2、3或4个在以上定义中给出的取代基，所述取代基可以存在于任何所需的位置上。在单取代的苯基残基中，取代基可以在2-位、3-位或4-位，在二取代的苯基残基中，取代基可以在2，3-位、2，4-位、2，5-位、2，6-位、3，4-位或3，5-位。在三取代的苯基残基中，取代基可以在2，3，4-位、2，3，5-位、2，3，6-位、2，4，5-位、2，4，6-位或3，4，5-位。在四取代的苯基残基中，取代基可以在2，3，4，5-位、2，3，4，6-位或2，3，5，6-位。

除非另有说明，否则杂芳基残基和杂环基残基如Hetar基团优选衍生自含有1、2或3个相同或不同杂原子的杂环，更优选衍生自含有1或2个相同或不同杂原子的杂环。杂环基的环优选是5-元环、6-元环或7元环，更优选是5-元环或6-元环。可衍生得到式I化合物中出现的残基的单环和二环杂环系统的实例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、1，3-间二氧杂环戊烯、1，3-唑(＝唑)、1，2-唑(＝异唑)、1，3-噻唑(＝噻唑)、1，2-噻唑(＝异噻唑)、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、吡喃、噻喃、1，4-二烯、1，2-嗪、1，3-嗪、1，4-嗪、1，2-噻嗪、1，3-噻嗪、1，4-噻嗪、1，2，3-三嗪、1，2，4-三嗪、1，3，5-三嗪、1，2，4，5-四嗪、氮杂、1，2-二氮杂、1，3-二氮杂、1，4-二氮杂、1，3-氧氮杂、1，3-硫氮杂、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并间二氧杂环戊烯、喹啉、异喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉、酞嗪、噻吩并噻吩、1，8-萘啶和其它萘啶、喋啶或酚噻嗪，它们各自为饱和形式(全氢化形式)或为部分不饱和形式(例如二氢化形式或四氢化形式)或为最大不饱和形式，只要各个形式是已知的和稳定的并包含在化合物的定义内。本文所用的术语杂芳基包括其中两个环均是芳族环的二环残基以及其中只有一个环是芳族环的二环残基。独立地，这也适用于Hetar基团。适宜的杂环包括例如饱和的杂环吡咯烷、哌啶、吗啉和硫代吗啉。不饱和的杂环可以在环系统内包含例如1、2或3个双键。5-元环和6-元环特别也可以是芳族环。

可由这些杂环衍生得到的取代基可以通过任何适宜的碳原子连接。由在环氮原子上带有氢原子或取代基的氮杂环例如吡咯、咪唑、吡咯烷、吗啉、哌嗪衍生得到的残基也可以通过环氮原子连接，特别是当各杂环残基与碳原子连接时。例如，噻吩残基可以以2-噻吩基或3-噻吩基的形式存在，呋喃残基可以以2-呋喃基或3-呋喃基的形式存在，吡啶残基可以以2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基的形式存在，哌啶残基可以以1-哌啶基(＝哌啶子基)、2-哌啶基、3-哌啶基或4-哌啶基的形式存在，(硫代)吗啉残基可以以2-(硫代)吗啉基、3-(硫代)吗啉基或4-(硫代)吗啉基(＝硫代吗啉代基)的形式存在。通过碳原子连接的由1，3-噻唑或咪唑衍生得到的残基可以通过2-位、4-位或5-位连接。

如果杂环基是被取代的，它可以带有1、2、3或4个相同或不同的取代基。杂环的取代基可以存在于任何所需的位置，例如在2-噻吩基或2-呋喃基中可存在于3-位和/或4-位和/或5-位，在3-噻吩基或3-呋喃基中可存在于2-位和/或4-位和/或5-位，在2-吡啶基中可存在于3-位和/或4-位和/或5-位和/或6-位，在3-吡啶基中可存在于2-位和/或4-位和/或5-位和/或6-位，在4-吡啶基中可存在于2-位和/或3-位和/或5-位和/或6-位。适宜的氮杂环也可以以N-氧化物或以含有衍生自可药用酸的抗衡离子的四价盐的形式存在。例如，吡啶基可以以吡啶-N-氧化物的形式存在。

本发明包括式I化合物的所有立体异构形式。式I化合物中存在的不对称中心均可以彼此独立地具有S构型或R构型。本发明包括所有可能的对映体和非对映体以及两种或更多种立体异构体的混合物，例如对映体和/或非对映体的所有比例的混合物。因此，本发明所用的可以以对映体形式存在的化合物可以以对映体纯的形式存在，既可以是左旋对映体也可以是右旋对映体；可以以外消旋物的形式存在；和可以以两种对映体的所有比例的混合物形式存在。如果存在顺/反异构现象，本发明包括顺式和反式两种形式以及这些形式的所有比例的混合物。所有这些形式均包括在本发明之内。如果需要，可以进行单个立体异构体的制备，制备方法有：用常规方法例如色谱法或结晶法对混合物进行分离，使用立体化学结构相同的起始原料进行合成，或者进行立体选择性合成。任选地，可以在分离立体异构体之前进行衍生化。立体异构体混合物的分离可以在式I化合物阶段或在合成中的中间体阶段进行。本发明也包括式I化合物的所有互变异构形式。

如果式I的化合物含有一个或多个酸性或碱性基团，则本发明还包括它们相应的药学上或毒理学上可接受的盐，特别是它们的可药用盐。因此，含有酸性基团的式I化合物可以以这些基团的形式存在，并且根据本发明，可以以例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐的形式被使用。这类盐的更具体的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的盐。根据本发明，含有一个或多个碱性基团、即可被质子化的基团的式I化合物可以以它们与无机或有机酸的加成盐形式存在并且可以以该形式被使用。适宜的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸以及本领域技术人员已知的其它酸。如果式I化合物在分子中同时含有酸性或碱性基团，则除了所述的盐形式外，本发明还包括内盐或内铵盐(两性离子)。各个盐可以通过本领域技术人员已知的常规方法由式I化合物制得，例如通过使它们与有机或无机酸或碱在溶剂或分散剂中接触或通过与其它盐进行阴离子交换或阳离子交换而制得。

本发明还包括式I化合物的溶剂合物例如水合物或与醇的加合物、式I化合物的活性代谢物、含有生理可耐受的和可裂解的基团的式I化合物的衍生物和前体药物例如酯、酰胺以及式I中的N-H基团被N-烷基如N-甲基或被N-酰基如N-乙酰基或N-精氨酰基(包括在N-酰基中存在的官能团上所形成的可药用盐)代替的化合物的用途，条件是当在适于离体处理干细胞和祖细胞的条件下根据本发明进行使用时，它们表现出所需的活性。

特别优选地，本发明使用的式I化合物中的一个或多个变量具有以下给出的优选含义，所有优选含义的组合均为本发明的主题。对于所有优选的式I化合物，本发明还包括它们的所有立体异构形式和其所有比例的混合以及它们的可药用盐的用途。

n、即多亚甲基链(CH₂)_n中CH₂基团的数量优选为1或3。在本发明的一个实施方案中，在所使用的式I化合物中n为1，即式R-COOH的酸的茚满-2-基酰胺。在本发明的另一个实施方案中，在所使用的式I化合物中n为3，即式R-COOH的酸的6，7，8，9-四氢-5H-苯并环庚烯-6-基酰胺。

R优选选自4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、4-(C₁-C₃-烷氧基)苯基、4-三氟甲氧基苯基、2-溴-4-氟苯基、2-氯-4-氟苯基、3，4-二甲基苯基、2，4-二甲基苯基、4-氯-2-甲基苯基、2-羟基-4-甲基苯基、2-羟基-4-乙氧基苯基、2-甲氧基-4-甲基苯基、4-苯氧基苯基、3-氟-4-甲基苯基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基、2，2-二氟苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基、2，3-二氢苯并呋喃-5-基、1-(4-氯苯基)-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、1-(4-氟苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-基、1H-苯并三唑-5-基、1H-吲哚-4-基、1H-吲哚-6-基、1-异丙基-2-三氟甲基-1H-苯并咪唑-5-基、1-甲基-3-氧代-1，2，3，4-四氢-喹喔啉-6-基、1-苯基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、2-(2-羟基吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-基、2-(4-氰基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基、2，4-二甲基唑-5-基、2，4-二甲基嘧啶-5-基、2，4-二甲基噻唑-5-基、2，5-二甲基-1H-吡咯-3-基、2，5-二甲基-1-苯基-1H-吡咯-3-基、2，5-二甲基-1-吡啶-4-基甲基-1H-吡咯基、2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基、2，6-二氯吡啶-3-基、2，6-二甲氧基吡啶-3-基、2，6-二甲基吡啶-3-基、2-氨基-4，6-二甲基吡啶-3-基、2-氨基-6-氯吡啶-3-基、2-氨基-吡啶-3-基、2-氯-6-甲基吡啶-3-基、2-氯吡啶-4-基、2-环丙基-4-甲基-噻唑-5-基、2-二甲基氨基-4-甲基-噻唑-5-基、2-二甲基氨基吡啶-4-基、2-乙基-5-甲基-2H-吡唑-3-基、2-羟基-6-甲基吡啶-3-基、2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基、2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基、2-甲基吡啶-3-基、2-甲基-6-三氟甲基吡啶-3-基、2-甲基噻唑-5-基、2-(吗啉-4-基)吡啶-4-基、2-(吗啉-4-基)嘧啶-5-基、2-(吡咯烷-1-基)吡啶-4-基、3，5-二甲基-1H-吡唑-4-基、3-氨基-5，6-二甲基吡嗪-2-基、3-氨基-5-甲基吡嗪-2-基、3-氨基吡嗪-2-基、3-二甲基氨基-4-甲基苯基、3-二甲基氨基苯基、3H-苯并咪唑-5-基、1H-苯并咪唑-5-基、3-甲磺酰基氨基-2-甲基苯基、3-甲磺酰基氨基苯基、3-甲基-异唑-4-基、3-(吗啉-4-基)苯基、3-(哌啶-1-基)苯基、3-(吡咯烷-1-基)苯基、4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯基、4，6-二甲基吡啶-3-基、4-氨基-2-乙硫基嘧啶-5-基、4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基、4-氯-3-甲磺酰基氨基-苯基、4-氯-3-氨磺酰基苯基、4-甲基-3-甲基氨基苯基、4-甲基噻唑-5-基、吡啶-2-基、5，6，7，8-四氢喹啉-3-基、5-氨基-1-苯基-1H-吡唑-4-基、5-甲磺酰基-2-甲基苯基、5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基、5-甲基异唑-3-基、5-甲基吡啶-3-基、5-甲基吡嗪-2-基、6-氯吡啶-3-基、6-氰基吡啶-3-基、6-二甲基氨基吡啶-3-基、6-乙炔基吡啶-3-基、6-甲氧基甲基吡啶-3-基、6-甲氧基吡啶-3-基、6-甲基-2-甲基氨基吡啶-3-基、6-甲基氨基吡嗪-2-基、6-甲基吡啶-3-基、6-(吗啉-4-基)吡啶-3-基、6-(吡咯烷-1-基)吡啶-3-基、咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6-三氟甲基吡啶-3-基和嘧啶-4-基。

杂芳基优选为5-元至10-元地、芳族的、含有1、2或3个、更优选1或2个相同或不同的选自N、O和S的杂原子的单环或二环杂环。杂芳基最优选选自呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、吡唑基、咪唑基、哒嗪基、吡嗪基、吡啶基、嘧啶基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基和吲唑基。

Hetar基团优选为5-元至10-元的、芳族的、含有1、2或3个、更优选1或2个相同或不同的选自N、O和S的杂原子的单环或二环杂环。Hetar基团最优选选自呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、吡唑基、咪唑基、哒嗪基、吡嗪基、吡啶基、嘧啶基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基和吲唑基。

在本发明的一个尤其优选的实施方案中，以其任何立体异构形式或它们的任何比例的混合物或其可药用盐的形式使用式I化合物，在所述的式I化合物中n的数值为1，且基团R具有上述R优选选自其中的各含义中的一种。在本发明另一个尤其优选的实施方案中，以其任何立体异构形式或它们的任何比例的混合物或其可药用盐的形式使用式I化合物，在所述的式I化合物中n的数值为3，且基团R具有上述R优选选自其中的各含义中的一种。这类尤其优选的式I化合物的实例有4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺和2，2-二氟苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-甲酸茚满-2-基酰胺。

本发明所用的化合物、特别是式I化合物和它们的前体可以用文献中所述的或与本领域技术人员已知的方法相类似的方法合成。例如，式I化合物可以由式R-COOH的各个酸或其衍生物和各个胺通过形成酰胺键而合成。为了达到此目的，可以将各个胺溶解在惰性溶剂例如水、异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯或二烷中，并且在存在碱如例如三乙胺或氢氧化钠的条件下与适当的羧酸衍生物例如酰氯反应，例如在室温下反应。式I化合物也可以通过使各个胺与各个酸在存在碱如例如二异丙基乙基胺和适当偶联试剂如例如碳二亚胺如二环己基碳二亚胺或TOTU的条件下在惰性溶剂如例如四氢呋喃、二烷或二甲基甲酰胺中进行偶联反应、例如在室温下进行偶联反应而得到。如果需要，然后可将获得的酰胺官能化以获得其它化合物。合成式I化合物的所有反应本身均是本领域技术人员所公知的，所述反应可在文献中描述的标准条件下或者根据与文献中所述的方法相类似的方法来进行，所述文献例如Houben-Weyl，Methoden derOrganischen Chemie(有机化学方法)，Thieme-Verlag，Stuttgart，或Organic Reaction，John Wiley & Sons，纽约。根据个例的情况，为了避免式I化合物合成中的副反应，通过引入保护基临时性地阻断官能团并在合成的后期阶段将它们去保护或者以前体基团的形式引入官能团、例如氨基的前体硝基并在后期的反应步骤中将其转化成所需的官能团可能是必需的或有利的。在个例中适用的这类合成策略和保护基以及前体基团是本领域技术人员所公知的。如果需要，可以通过常规的纯化方法例如重结晶法或色谱法对式I化合物进行纯化。用于制备式I化合物的起始化合物可商购获得或者可根据文献中的方法或与之类似的方法制备。

用本发明的eNOS转录增强剂处理的成人干细胞和祖细胞的分离和进一步处理可根据文献中所述的标准方法或与文献中所述方法相类似的方法进行，所述方法是本领域技术人员已知的。所采用的细胞可由患者的骨髓获得，所述骨髓是通过常规抽吸法获取的，因此所采用的细胞可以是骨髓干细胞和祖细胞或源于骨髓的干细胞和祖细胞。用常规方法对骨髓进行处理，所述方法可包括用密度梯度离心法进行分级以分离出单核细胞。洗涤后，将细胞混悬在常规的细胞培养基中，例如可商购获得的X-Vivo培养基(Cambrex，East Rutherford，New Jersey，USA)，所述培养基是不含血清的培养基，适合用于人。作为细胞可混悬于其中以备将来进行处理、适合用于实验研究的另一种细胞培养基，可提及的是可商购获得的RPMI 1640培养基(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)。一般而言，所获得的细胞混悬液由包括造血祖细胞在内的不同细胞群组成。可以将获得的细胞混悬液定性，例如通过标准技术如流式细胞术分析使用常规抗体鉴别造血和间充质干细胞和祖细胞群。细胞的功能活性可以例如用集落形成单位测定法或通过测定它们响应于VEGF或SDF-1的迁移能力来评价，所述方法在上文中有提及并且在下文中有更详细的描述。细胞混悬液含有为内皮祖细胞或可发育为内皮祖细胞的细胞，而内皮祖细胞又可发育成内皮细胞并导致新血管的形成，即促进梗塞区域的新血管形成。除了来自骨髓外，本发明所用的祖细胞也可用类似方法例如由患者的脂肪组织或循环血获得，从而分别得到源于脂肪组织或源于循环血的祖细胞。由血液获得的细胞群通常在重新施用前离体培养数天。由于体循环中存在的内皮祖细胞源于骨髓细胞，所以诸如“源于骨髓的”等术语可恰当地用来表示由患者的骨髓获得的细胞以及由采集的血液获得的细胞。

可以在细胞培养的标准条件下对所获得的缺血性心脏病患者的干细胞和祖细胞的混悬液进行离体处理以改善它们的受损的功能活性和寻靶能力并因此在重新施用后改善新血管形成。细胞在混悬液中的浓度可以为约100000个/毫升至约5000000个/毫升，例如约1000000个/毫升，所述混悬液可以是在适宜培养基如X-Vivo中的混悬液，所述培养基是完全配方，不需要加入其它物质。在用eNOS表达增强剂进行的处理中所用培养基的pH一般为约6.5至约7.5，特别是约6.8至约7.3，整个细胞处理过程中的pH也是如此。将细胞混悬液与eNOS转录增强剂在适宜的可药用溶剂中的溶液混合，所述溶剂例如水或有机溶剂如醇例如乙醇或聚二醇(polyglycol)如聚丙二醇或二甲亚砜或这类溶剂的混合物。eNOS转录增强剂的溶液也可以含有可药用的助剂，如盐、缓冲物质或增溶剂。eNOS转录增强剂在所得混合物中的浓度一般为约1nM至约1mM，特别是约0.1μM至约100μM，例如约1μM至约10μM，如约5μM。然后，将混合物例如在无菌条件下、于通常为约37℃的温度下、在可以由含约5％二氧化碳的空气组成的潮湿气氛中进行孵育。孵育时间取决于个例的情况，例如所采用的eNOS转录增强剂的有效性。一般而言，孵育时间为约6小时至约48小时，例如约12小时至约24小时，如约18小时。如果本发明使用的是由循环血获得的祖细胞，则在上述的通常用这类细胞进行的培养中可实施与eNOS转录增强剂一起进行的孵育。可将获得的混合物不经后处理直接施用于患者，因为所含有的eNOS转录增强剂是一种在体内也发挥有益作用的药用物质。或者，可以将经处理的细胞首先通过离心法从获得的混合物中分离出来、洗涤例如用缓冲液洗涤、重新混悬例如重新混悬在培养基如X-Vivo中，并且将该混悬液施用于患者。

本发明的另一个主题是前述的通过用eNOS转录增强剂进行处理来制备具有提高的功能活性的干细胞和/或祖细胞的方法，即，制备具有提高的功能活性的干细胞和祖细胞的方法，其包括用内皮氧化氮合酶的转录增强剂处理来自缺血性心脏病患者的干细胞和祖细胞。本发明的主题还有：用于在缺血性心脏病患者的细胞疗法中处理干细胞和祖细胞的药物(或药物组合物或药物制剂)，其包含eNOS转录增强剂，例如式I化合物和/或其可药用盐，以及任选地一种或多种助剂，如盐或缓冲物质或增溶剂；用于这类处理的套药盒和套药包，其含有所述药物以及用于这类用途的其它物品，例如用于溶解固态eNOS转录增强剂的适宜溶剂或介质和使用说明书。所述药物可以例如包含置于瓶、安瓿或小瓶中的固态eNOS转录增强剂，然后在将eNOS转录增强剂加入细胞混悬液中之前将其溶解；或包含可直接加入细胞混悬液中的eNOS转录增强剂溶液。

用eNOS转录增强剂处理后获得的干细胞和/或祖细胞的混悬液可以例如通过静脉内注射或输注施用于患者，或者通过心肌内注射或冠脉内注射或输注直接施用入心脏或靠近心脏的血管。直接施用入梗塞的心肌或冠脉血管的施用可在手术过程中进行或通过导管插入法进行，其在下文有更详细的描述。合适的施用方法是本领域中已有的并且是本领域技术人员所公知的。

本文所用的术语“缺血性心脏病”应理解为包括其中心肌的一个或多个区域出现或已经出现供血不足或其中医生希望改善新血管形成或新血管生成的任何心脏病，包括的疾病有例如冠心病、冠状动脉病、急性冠状动脉综合征、心绞痛、心肌梗塞、缺血性心肌病和充血性心力衰竭，后者可以是由于缺血而导致的。可根据本发明治疗的缺血性心脏病可以是急性或慢性疾病。

实施例

eNOS转录增强剂的合成

4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺

将43.70g(258mmol)盐酸2-氨基茚满和53.43g(528mmol)三乙胺加入250ml四氢呋喃中，加入42.89g(270mmol)4-氟苯甲酰氯，将该混合物在室温下搅拌2小时。然后，将所得的混合物倒在冰/HCl混合物上，过滤获得的沉淀物，将其用NaHCO₃溶液和水洗涤并真空干燥。使粗产物从甲醇中结晶。产率：47.8g(73％)白色晶体。

熔点：167℃

质谱：256.1[M+H⁺]

¹H-NMR谱(300MHz，d₆-DMSO)：2.96(dd，2H，H1/3)，3.25(dd，2H，H3/1)，4.70(六重峰，1H，H2)，7.12-7.19(m，2H，H4，7/5，6)，7.20-7.28(m，2H，H5，6/4，7)，7.30(t，2H，H3′，5′)，7.95(dd，2H，H2′，6′)，8.68(d，1H，NH)

根据诸如以下举例性的通用方法A、B和C等方法合成了其它式I化合物。

方法A

将0.5mmol(96mg)1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.5mmol(87μl)二异丙基乙基胺(DIPEA)溶解在2.5ml二氯甲烷(DCM)中，将其加入0.5mmol各个酸在2.5ml DCM中的溶液中，在室温下搅拌10分钟。然后，加入0.7mmol各个胺并继续搅拌过夜。然后，将所得的溶液用2N HCl洗涤2次，用饱和KHCO₃溶液洗涤1次，用MgSO₄干燥并过滤。将蒸发至干后所获得的残余物用乙酸乙酯/己烷或甲醇/乙醚混合物进行结晶或用HPLC法进行纯化。

方法B

向在5ml四氢呋喃中的0.75mmol各个酸和271μl(1.575mmol)DIPEA中加入271mg(0.825mmol)O-[(氰基-乙氧基羰基-亚甲基)氨基]-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TOTU)(溶解在1ml二甲基甲酰胺(DMF)中)。在室温下搅拌15分钟后，加入0.9mmol各个胺的盐酸盐和172μl(1mmol)DIPEA在1ml DMF中的混合物。搅拌6小时后，将混合物过滤并蒸发。将残余物用乙酸乙酯吸收并相继用20ml 1N HCl和20ml 5％碳酸氢钠溶液洗涤。将所得的有机相蒸发并用制备型HPLC纯化(RP 18，乙睛/水)。

方法C

将2.5mmol各个胺与550mg三乙胺和5ml二烷混合，然后加入2.5mmol各个酰氯，将该混合物在室温下搅拌2小时。然后，将所得的混合物倒在冰/HCl混合物上，将获得的沉淀物用乙酸乙酯萃取，用硫酸钠干燥并浓缩。将如此获得的残余物用制备型HPLC进行分级分离。

以下提及的是所制得的化合物的一个实例。

2，2-二氟苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-甲酸茚满-2-基酰胺

熔点：147.5℃

质谱：318.2[M+H⁺]

¹H-HMR谱(400MHz，d6-DMSO)：2.91-2.99(m，2H，H-1/H-3)，3.22-3.30(m，2H，H-3/H-1)，4.69(六重峰，1H，H-2)，7.13-7.19(m，2H，H-4，H-7或H-5，H-6)，7.21-7.28(m，2H，H-4，H-7或H-5，H-6)，7.50(d，1H，H-6′/H7′)，7.80(d，1H，H-7′/H6)，7.88(s，1H，H4’)，8.71(d，1H，NH)。

eNOS转录活化的测定

eNOS转录的活化如Li等人，蛋白激酶Cα和/或ε的活化增强人内皮氧化氮合酶基因的转录，Mol.Pharmacol.1998，53：630-637中所详细描述的那样进行测定。简言之，将eNOS基因的起始密码子的3.5kB长的片段5’进行克隆、测序并克隆在萤火虫萤光素酶表达质粒中以通过报道基因活性来监测eNOS启动子的活化。在化合物测定中使用被稳定转染并表达该启动子报道基因构建体的人内皮细胞系。将细胞与化合物一起孵育18小时。所有化合物均事先被溶解在无菌二甲亚砜(DMSO)中。使DMSO在完全培养基中的终浓度为0.5％。根据生产商的说明书用标准萤光素酶测定系统(Promega，Madison，Wisconsin，USA；目录号E150)测定这些细胞中报道基因表达的诱导。将与化合物一起孵育的细胞中的萤光素酶诱导与只与溶剂一起孵育的细胞中的萤光素酶诱导进行比较。将两者活性的比值(转染诱导比，TIR)作为化合物浓度的函数进行作图。通常，在低浓度下TIR值从比值1开始，这表明化合物没有作用，TIR值不断升高至最大值TIR(max)，这表明eNOS转录增加。作为化合物浓度的函数，用作图法确定转录诱导比的EC₅₀值。

骨髓细胞的分离

由年龄为18至75岁的共计9名健康对照者和25名患有稳定冠心病和有心肌梗塞史的患者采集骨髓抽出物。患者必须具有局部室壁运动异常、开放的天然血管、冠状动脉旁路移植物或副动脉。由于已知心肌缺血使源自骨髓的祖细胞发生移动，所以在过去4周中发生过诱导性或静息性心肌缺血的患者被排除在外。其它的排除标准还有：存在活动性或慢性感染、在过去两个月内进行过手术或有过创伤、有恶性疾病的迹象、存在活动性胃肠道出血、超过160/100mm Hg的不可控的高血压、在过去两年内发生过中风、AV-动脉瘤、肾或肝功能不全、血小板计数＜100000/μ的血小板减少、血红蛋白＜8.5g/dl的贫血、精神发育迟缓、参加了另一个临床试验或不愿参加本试验。妊娠和绝经前妇女也被排除在外。德国法兰克福JohannWolfgang Goethe大学医院的伦理委员会批准了本研究方案，并且本研究按照赫尔辛基宣言进行。获得了每名患者的书面知情同意。

由每名参加者获得共计50ml骨髓抽出物。通过密度梯度离心法分离出骨髓干细胞和祖细胞。在两步洗涤后，将细胞重新混悬在10ml X-vivo 10培养基(无庆大霉素和酚红；Cambrex，East Rutherford，New Jersey，USA)中。细胞混悬液由包括造血祖细胞在内的不同细胞群组成。

将骨髓干细胞和祖细胞用流式细胞术进行分析。对于造血和间充质干细胞和祖细胞群的鉴别而言，使用直接轭合的针对人CD45(BectonDiclinson，Franklin Lakes，New Jersey，USA)、CD34(FITC-标记的；BDPharmingen，San Diego，California，USA)、CD133(APC-标记的；BDPharmingen)、CD14(FITC-标记的；BD Pharmingen)、CXCR4(APC-标记的，BD Pharmingen)和CD49d(APC-标记的；BD Pharmingen)的抗体。Lineage panel从BD Pharmingen获得(含有FITC-标记的CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56)并通过另外使用直接FITC轭合的针对CD15的抗体和血型糖蛋白A(均来自BD Pharmingen)来完成。

用eNOS转录增强剂进行的骨髓细胞的处理

对于与eNOS转录增强剂4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺一起进行的孵育而言，将1ml 1000000个干细胞和祖细胞在1ml X-Vivo 10细胞培养基中的混悬液与1μl 4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺在二甲亚砜(DMSO)中的溶液混合，所述溶液是通过将1.275mg 4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺溶解在1mlDMSO中制得的。4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺在所得混合物中的浓度为5μM。对于与eNOS转录增强剂4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺和eNOS抑制剂N^G-一甲基-L-精氨酸(L-NMMA)一起进行的孵育而言，除了4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺以外，还向细胞混悬液中加入L-NMMA(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)，从而得到4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺浓度为5μM且L-NMMA浓度为1mM的混合物。所述孵育在37℃的温度下、于含有5％二氧化碳空气的气氛下进行18小时。将细胞通过离心法进行分离、用PBS洗涤两次并重新混悬在X-Vivo 10中。

骨髓细胞的功能活性的测定

为了评价集落形成活性，将骨髓干细胞和祖细胞(1×10⁵/皿)接种在甲基纤维素板中(包含干细胞因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素-3、白介素-6的Methocult GF H4535；CellSystems，St.Katharinen，德国)。将所述板用相差显微镜术进行研究，孵育14天后，对集落形成单位粒细胞-巨噬细胞(CFU-GM；集落＞50个细胞)进行计数。

为了评价骨髓干细胞和祖细胞的迁移能力，将共计1×10⁶个骨髓干细胞和祖细胞重新混悬在250μl X-Vivo 10中并将其置于充满基质胶(BioCoat侵入测定法，孔径8μm，Becton Dickinson Labware，Two Oak Park，Bedford，Massachusetts，USA)的改良Boyden室的上侧室中。然后，将所述室放在24-孔培养皿中，所述培养皿中含有500μl内皮基础培养基(EBM)，其补充有磷酸缓冲盐水(PBS)、50ng/ml VEGF或100ng/ml SDF-1。在37℃下孵育24小时后，对迁移的细胞进行计数。

体内小鼠后肢缺血模型

用体重为18至22g的8至10周龄无胸腺NMRI裸鼠(The JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine，USA)在鼠后肢缺血模型中研究了骨髓干细胞和祖细胞的新血管形成能力。用7-0号丝质缝合线结扎股动脉的近端部分(包括浅表和深部分支)以及隐动脉的远端部分。用电凝固器阻塞结扎之间的所有动脉分支。用三个手术用U形针将上覆的皮肤闭合。24小时后，静脉内注射骨髓干细胞和祖细胞在X-Vivo 10中的混悬液(5×10⁴、5×10⁵或5×10⁶个细胞/小鼠；n＝5/组)。两周后测定肢的灌注。具体地，用激光多普勒血流测定仪(Laser Doppler Perfusion Imager System，MoorLDI-Mark 2，Moor Instruments，Wilmington，Delaware，USA)测定缺血(右)肢/正常(左)肢的血流比。开始扫描前，将小鼠放在37℃的加热板上以将温度变化减至最小。在两次记录激光多普勒彩色图像后，根据彩色的直方图象素计算缺血和非缺血肢的平均灌注。为了将包括环境光和温度在内的变量减至最小，将所计算的灌注以缺血与非缺血后肢灌注之比来表示。

对于组织学评价，用缺血和非缺血肢的内收肌和半膜肌的5μm冷冻切片测定组织的血管形成。将内皮细胞用直接针对CD146的FITC-标记的单克隆抗体(Chemicon，Temecula，California，USA)染色。以毛细血管/肌细胞的数量来表示毛细血管密度。通过用HLA-DR-APC-标记的抗体(BDPharmingen，San Diego，California，USA)和CD146-FITC-标记的抗体进行共染色来鉴别人骨髓干细胞和祖细胞。

将骨髓细胞施用于患者

用eNOS转录增强剂处理的骨髓细胞对患者的施用可通过以下关于祖细胞移植的导管插入法来进行。将一个尺寸大0.5mm的over-the-wire球囊导管推入预先植入的支架中。为了使注入的细胞通过内皮进行粘附和可能的迁移，将球囊低压膨胀至完全阻断血流3分钟，同时将3.3ml祖细胞混悬液通过球囊导管的中心通路从远端注入阻塞球囊。将该操作重复3次以便可注入总计10ml的祖细胞混悬液，操作之间通过将球囊放气使血液回流3分钟，以将广泛缺血减至最低。在冠脉内细胞移植完成后，重复进行冠脉血管造影，以确定血管开放并且无造影剂滞留。

用标准方法进行统计学分析。除非另有说明，否则连续变量的结果用均值±标准差表示。对于有两个以上亚组的实验，用t检验(双侧)或方差分析对组间比较进行分析。用带有Bonferroni调整的t检验(双侧)进行Posthoc范围检验和两两多重比较。通过Pearson χ²检验产生类变量比较。在对骨髓干细胞和祖细胞的体外特性进行盲法评价后，将检验结果与来自体内研究的结果合并。为了确定骨髓干细胞和祖细胞在体外新血管形式方面的体外决定因素，进行多变量线性回归分析。P值＜0.05被认为具有统计学意义。所有分析均用SPSS 11.5(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)进行。

获得了以下结果。

eNOS转录活化的测定

化合物4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺在萤光素酶测定中对eNOS转录的活化表现出的EC₅₀值为0.8μM，TIR(max)值为4.10。

化合物2，2-二氟苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-甲酸茚满-2-基酰胺在萤光素酶测定中对eNOS转录的活化表现出的EC₅₀值为0.14μM，TIR(max)值为2.7。

骨髓细胞的功能活性的测定

来自患者的骨髓干细胞和祖细胞的集落形成活性为37.3±25.0CFU-GM/皿，而来自健康对照者的所述细胞的集落形成活性为113.8±70.4CFU-GM/皿(P＝0.009)。

来自患者的骨髓干细胞和祖细胞对VEGF的迁移响应为34.0±24.2×1000个迁移细胞，而来自健康对照者的所述细胞对VEGF的迁移响应为54.8±29.3×1000个迁移细胞(P＝0.027)。

来自患者的骨髓干细胞和祖细胞对SDF-1的迁移响应为46.3±26.2×1000个迁移细胞，而来自健康对照者的所述细胞对SDF-1的迁移响应为108.6±40.4×1000个迁移细胞(P＜0.001)。

来自健康对照者的骨髓干细胞和祖细胞在用PBS处理18小时后对SDF-1的迁移响应为126.53±41.7×1000个迁移细胞，而来自健康对照者的所述细胞在用4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺(5μM)处理18小时后对SDF-1的迁移响应为111.2±38.5×1000个迁移细胞(P＜0.01)。

来自患者的骨髓干细胞和祖细胞在用PBS处理18小时后对SDF-1的迁移响应为38.0±13.7×1000个迁移细胞，而来自患者的所述细胞在用4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺(5μM)处理18小时后对SDF-1的迁移响应为74.0±20.7×1000个迁移细胞(P＜0.01)。

来自患者的骨髓干细胞和祖细胞在用4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺(5μM)和N^G-一甲基-L-精氨酸(L-NMMA)(1mM)处理18小时后对SDF-1的迁移响应为23.9±7.4×1000个迁移细胞，而来自健康对照者的所述细胞在用4-氟-N-(茚满-2-基)苯甲酰胺(5μM)处理18小时后对SDF-1的迁移响应为74.3±21.5×1000个迁移细胞(P＜0.01)。

体内小鼠后肢缺血模型

在5×10⁵个细胞/小鼠的浓度下比较干细胞和祖细胞的作用，在该浓度下来自健康对照者的骨髓干细胞和祖细胞达到最大治疗作用。

在各个试验组中，在如所述的那样施用骨髓干细胞和祖细胞后，用激光-多普勒血流测定仪测得了以下的相对血流值(以百分比表示的缺血(右)肢/正常(左)肢的血流比)。

无细胞                                  21.9±10.8％    n＝11

来自健康对照者的细胞                    72.7±18.7％    n＝24

来自患者的细胞，未经处理                40.7±12.2％    n＝24

来自患者的细胞，用5μM 4-氟-N-(茚满-2-                  n＝24

基)苯甲酰胺处理18小时                   59.1±11.6％^*

来自患者的细胞，用5μM 4-氟-N-(茚满-2-                  n＝18

基)苯甲酰胺和1mM的L-NMMA处理18

小时                                    39.7±10.3％

^*与来自患者的未经处理的细胞相比，P＜0.001。