人β－珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体及其应用

摘要

本发明公开了一种人β－珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体及其制备方法与应用。其目的是涉及一种人β－珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体及其制备方法与其在制备β－地中海贫血症治疗性药物中的应用。该人β－珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体，是含有人β－珠蛋白基因簇(Beta－globin gene cluster，BGGC)的重组人源染色体靶向BAC载体，所述人β－珠蛋白基因簇的GenBank号为NG_000007，用于构建所述含有人β－珠蛋白基因簇的重组人源染色体靶向BAC载体的出发载体为人源染色体靶向BAC载体BACMS。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因打靶载体及其应用，特别是涉及一种人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体及其制备方法与其在制备β-地中海贫血症治疗性药物中的应用。

背景技术

人类珠蛋白基因家族分为α和β两个基因簇。位于16号染色体近端粒区(16p13.3)的人α-珠蛋白基因簇以5′-ζ2-φζ1-φα2-φα1-α2-α1-θ1-3′的顺序排列，全长约40kb，其中ζ为胚胎型功能基因，α为胎儿型和成年型功能基因。位于11号染色体p15.5区的人β-珠蛋白基因簇以5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′的顺序排列，全长约75kb，其中ε为胚胎型功能基因，Gγ和Aγ为胎儿型功能基因，δ与β为成年型功能基因。在发育过程的不同阶段，珠蛋白基因表达产物可组成6种血红蛋白四聚体，其中三种为胚胎型：Hb Gower(ζ₂ε₂)，Hb Gower(α₂ε₂)和Hb Portland(ζ₂γ₂)；一种为胎儿型：HbF(α₂γ₂)；一种为主要成人型：HbA(α₂β₂)；还有一种为次要成人型：HbA₂(α₂δ₂)。

人珠蛋白基因表达具有红系组织特异性、发育阶段特异性和α-、β-两类珠蛋白基因的表达终产物始终维持平衡的特性。在发育过程的任何一个阶段，如果平衡失调则导致地中海贫血症(简称地贫)，β-链合成减少或完全不能合成称β⁺-或β⁰-地贫。β-地贫是一种常见的造血系统遗传性疾病，已知在β-珠蛋白基因簇中有多种分子缺陷可导致β-地贫。

β-珠蛋白基因的正确表达依赖三种调控元件：红系特异和通用的反式因子、β-珠蛋白基因的近端顺式元件(启动子)及β-珠蛋白基因簇的远端顺式元件-基因座控制区(locus control region，LCR)序列。LCR是β-珠蛋白基因簇中维持珠蛋白基因正常表达的远端调控元件。完整LCR长约20kb，由四个红系特异、发育阶段稳定的DNaseI高敏位点(HS1-HS4)组成。每个HS包含一个长度介于200-400bp的核心序列，是体现HS功能活性的关键部位。对单一HS的功能研究表明：HS2具有典型的红系增强子活性；HS3在整合状态下表现出增强子活性，优先促进胎儿期功能基因的表达，具有一定的染色质开放活性；HS4在整合状态下促进成人期功能基因的表达；HS₁与其它高敏位点共同存在时，增强β-珠蛋白基因表达的活性达到最大，5’HS5也是LCR的构成部分，非红系特异，表现为组成型存在。LCR的功能表现为：激活β-珠蛋白基因簇呈现活性染色质结构；赋予珠蛋白基因在红系细胞中特异性表达的特性；具有红系增强子活性，使珠蛋白基因呈现高水平的表达。

β-地贫是一种常见的造血系统单基因遗传性疾病，近几年来对β-地贫发生的分子机制有了比较深入的了解。已知在β-珠蛋白基因簇中有多种分子缺陷可导致β-地贫，有的使正常的β-珠蛋白肽链合成完全终止(β⁰)，有的只是部分减少了它的合成(β⁺)。现在已发现有超过200种的分子损伤与β地贫有关，其中90％是点突变或一到几个碱基的增加或缺失，大片段的缺失会丢失整个LCR或与β地贫相关的重要元件。大片段和相对较小片段的缺失完全抑制了基因的表达并产生了β⁰地贫的表型。基因启动子上的点突变会减少基因的转录，主要通过减少与正调节因子的结合或增加负调节因子的结合而造成轻度地中海贫血。目前，对β-地贫的临床治疗主要有输血治疗、脾切除及干细胞或骨髓移植，但这些传统的治疗方法都有一定的局限性。因此，迫切需要一种安全、有效的基因治疗性药物。

β-地贫基因治疗性药物应满足如下几个条件：(1)珠蛋白基因的高效转移；(2)在靶细胞中的高比例的整合；(3)β-珠蛋白基因呈红系组织特异性的高水平表达；(4)安全性。将药物中所含的正常人β-类珠蛋白基因导入患者HSC中，随HSC的自我更新、分裂和分化，导入的正常基因能够在体内长期存在，并且能够代偿缺陷基因行使正常功能，从而达到β-地贫基因治疗性目的。目前，限于载体的容量，常用HS4、HS3和HS2核心序列或核心序列辅以较短片段的旁侧序列的组合作为载体构建中的调控序列(″Genetic treatment of the haemoglobinopa-thies：recombinations and new combinations.″，Br J Haematol，98(2)：247-53，1997；″Genetic treatment of severe hemoglobinopathies：the combat against transgenevariegation and transgene silencing.″，Semin Hematol，35(2)：112-25，1998)，同时根据不同β-地贫类型选择相应的功能基因进行基因转移。早期的病毒载体介导的珠蛋白基因转移研究发现仅携带近端调控元件的珠蛋白基因在小鼠体内表达水平极低，且病毒载体自身仍存在着整合位点随机、基因整合不稳定等问题；更为重要的是，目前所有用于β-地贫基因治疗性药物只是对珠蛋白基因簇中单个功能基因及其上游的部分必要的调控元件进行转移，从而导致转移的基因表达水平低。因此寻找更安全、有效、自主调控表达和大容量的新型载体用于制备β-地贫的基因治疗性药物，是科研工作者共同关心的课题。

夏家辉院士于1981年就发现2个携带额外双随体小染色体(bisatelliteminichromosome，BM)而表型正常的家系，并提出利用该小染色体作为基因治疗载体的设想。通过显微切割、探针池和FISH等技术证明BM来源于D、G组染色体短臂(即核仁组织区，nucleolus organization region，NOR)。

人核糖体DNA(rDNA)位于D、G组染色体短臂次缢痕区，次缢痕参与细胞内核仁形成。不同的细胞中，参与核仁形成的染色体数目不同，造成核仁数目和大小的差异，及胞质中核糖体数量的不同，最终引起蛋白质合成水平的差异。因此D、G组染色体短臂可通过控制核糖体的形成来调节细胞内蛋白的合成。另有研究表明rDNA序列可以为外源基因的表达提供合适的染色质环境(″A Drosophila rRNA gene located ineuchromatin is active in transcription and nucleolus formation″，Genes Dev，2(12B)：1745-63，1988)。1981年夏家辉院士对长沙市3所医院连续出生的新生儿染色体检查中发现有一例45，X，ter rea(y；13)(q1200；p11)和两例46，XY，t(y；15)(q1110；p12)的新生儿，经过近20年的临床追踪观察，三例染色体异常携带者均未发现任何异常体征；另外，从目前发现和鉴定的来自全国189个实验室的470位临床细胞遗传学工作者所申报的732种世界首报核型中，有41种涉及D、G组染色体短臂，但不论易位到此区的染色体片段来源于哪一号染色体、片段多长、所含基因从1个到上千个，携带者本人的表型都是正常的，这些数据充分说明NOR区不但可接受外源基因，而且能让易位到该区的外源基因正常表达。因此，将D、G组染色体短臂作为基因治疗的靶位点应该是安全可行的。

夏家辉教授利用从BM上获得的特异性片段构建了一种人D、G组染色体靶向性人源BAC靶向载体(BACMS)，构建方法参见专利“治疗血友病B的基因药物及其制备方法”(专利号：01102830.0)，其物理图谱如图1所示，这种靶向载体的基本骨架是细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes，BAC)，该载体含有两段来源于D、G组染色体的靶向序列(Targeting Leading Sequence，TGLS1&TGLS2)，同源臂之间为正筛选标记基因Neo，并有一NheI位点可允许外源基因的插入，同源臂以外有一负筛选基因tk，携带外源基因的靶向载体转染细胞后，通过同源重组整合于细胞染色体，经过G418进行正筛选，GCV进行负筛选，所获得的细胞克隆即为外源基因定向整合克隆。

为了证实上述靶向载体的安全性和有效性，研究人员将人凝血因子IX(FIX)和组织纤维蛋白溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator，TPA)基因分别克隆到此载体导入人纤维肉瘤细胞HT1080，PCR、FISH及染色体G显带技术证明FIX和TPA基因均被定点整合到了D、G组染色体短臂，活性检测表明，FIX和TPA基因不但获得了高效表达，而且经过500余次传代仍表达稳定。它们用跨内含子的RT-PCR检测FIX的mRNA水平的表达，并用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)定量，Western定性，检测到FIX表达水平为500ug/24h.10E6细胞，而对照细胞几乎检测不到表达，证实了该载体的安全与有效性。除此之外，该载体还具有容量大(可达300Kb)、易于操作、稳定性强和无免疫原性等优点，是一种非常有潜力的可制备基因治疗性药物的载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体。

本发明所提供的人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体，是含有人β-珠蛋白基因簇(Beta-globin gene cluster，BGGC)的重组人源染色体靶向BAC载体，所述人β-珠蛋白基因簇的GenBank号为：NG 000007，用于构建所述含有人β-珠蛋白基因簇的重组人源染色体靶向BAC载体的出发载体为人源染色体靶向BAC载体BACMS。

所述人β-珠蛋白基因簇在人源染色体靶向BAC载体BACMS中的位置可为Neo基因上游与TGLS2之间的NheI酶切位点或Neo基因下游与TGLS1之间的NotI酶切位点。

所述人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体为BACMS/BGGC。

本发明的第二个目的是提供一种所述人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体的构建方法。

本发明所提供的人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体的构建方法，是将人β-珠蛋白基因簇插入到出发载体为人源染色体靶向BAC载体BACMS中得到的重组载体。

所述人β-珠蛋白基因簇在人源染色体靶向BAC载体BACMS中的位置可为Neo基因上游与TGLS2之间的NheI酶切位点或Neo基因下游与TGLS1之间的NotI酶切位点。

整合有本发明所述载体的细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种β-地中海贫血症的基因治疗性药物。

本发明所提供的β-地中海贫血症的基因治疗性药物，它的活性成分为上述人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体。

本发明所提供的人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体，是以完整的人β-珠蛋白基因簇为目的DNA，以新型人源染色体靶向载体BACMS作为基因转移载体构建的。本发明利用BAC载体的大容量，将完整的人β-珠蛋白基因簇亚克隆至新型人源染色体靶向载体BAC中，通过TGLS的引导作用，可能在D、G组染色体短臂BAGE基因区或在7号染色体长臂末端MLL3基因的最后一个内含子之间发生同源重组，实现人β-珠蛋白基因簇的定点整合；利用其LCR强大的染色质开放活性，有利于为目的基因提供野生型的染色质微环境，能够为连锁基因提供整合位点不依赖的，拷贝数依赖的可调控表达；且发生同源重组后，新型BAC靶向载体BACMS中的两个TGLS及其之间的目的基因整合入人的染色体中，同源臂外的载体序列(包括BAC骨架、负筛选基因tk等DNA序列)在同源重组过程中缺失，不与染色体DNA发生重组或插入基因组DNA中，有效避免了因随机整合或插入突变带来的安全性问题，同时也避免了因外源基因导入而编码的外源蛋白引起的免疫反应。本发明可制备成药物，对靶细胞实现完整的人β-珠蛋白基因簇的转移作为基因替代治疗，有利于基因治疗各种β-地中海贫血症。本发明也为研究成簇基因转移、目的DNA定点整合及目的基因的可调控性表达提供了基础。

附图说明

图1为人D、G组染色体靶向性人源靶向载体BACMS的物理图谱

图2为TGLS1和TGLS2序列的染色体定位图谱

图3为人源染色体BAC靶向载体BACMS中同源臂TGLS1和TGLS2及正、负筛选基因的结构示意图

图4为重组子的原位菌落斑点杂交检测结果

图5为用限制性内切酶NotI对经原位菌落斑点杂交试验检测为阳性的单克隆的酶切鉴定结果

图6A为分别用限制性内切酶NotI、MluI、SalI和XhoI对阳性克隆进行酶切的预期结果分析

图6为对用限制性内切酶NotI酶切鉴定为阳性克隆的分别用限制性内切酶MluI、SalI和XhoI作进一步酶切鉴定的结果

图7为重组载体中人β-珠蛋白基因簇的完整性的Southern blot鉴定结果

图8为人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体的部分物理图谱

图9为12株抗G418的单克隆细胞株的PCR检测结果

图10为用Southern blot进行β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体中β-珠蛋白基因簇的整合位点分析结果

图11为用HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γ^A-珠蛋白为模板标记探针对细胞克隆基因组DNA进行Southern blot分析结果

图12为以β-珠蛋白基因簇中HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γ^A-珠蛋白为横坐标，各杂交带分别与单拷贝质粒DNA中对应的各杂交带密度的比值为纵坐标，对5株细胞克隆和K562细胞作柱状图

图13为人源染色体靶向载体BACMS/BGGC通过缺口平移法标记DNA-FISH探针

图14为为单克隆细胞IIG2的DNA FISH分析结果

图15为单克隆细胞IIG2的G-带-DNA FISH分析结果

图16为单克隆细胞IIG12的G-带-DNA FISH分析结果

图17为单克隆细胞IC1的G-带-DNA FISH分析结果

图18为经Hemin诱导和未经Hemin诱导的各单克隆细胞的RPA分析图谱

图19为未经Hemin诱导的K562细胞的RPA检测结果分析柱状图

图20为经Hemin诱导的K562细胞的RPA检测结果分析柱状图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体的构建及鉴定

对人源染色体BAC靶向载体BACMS中的两个同源臂TGLS1和TGLS2进行同源性分析及染色体定位，染色体定位图谱如图2所示(图中A表示定位于21p11，B表示定位于7q36.2)，表明它们除了与D、G组染色体短臂人黑色素瘤抗原基因(B melanomaantigen，BAGE)高度同源外，还与人7号染色体长臂末端7q36.2的人髓性/淋巴性白血病3(Homo sapiens myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3，MLL3)基因高度同源，TGLS1和TGLS2序列与MLL3基因的最后一个内含子的同源性为97％，因此认为利用该载体构建新的人源染色体靶向载体可介导外源DNA同源重组后既能够定点整合到D、G组染色体的BAGE基因区，也能够定点整合到7q36.2的MLL3基因区内。

一、人源染色体BAC靶向载体BACMS的构建

人源染色体BAC靶向载体BACMS的构建方法参见专利“治疗血友病B的基因药物及其制备方法”(专利号：01102830.0)进行，即利用人BAC文库中BAC克隆RP11-208G20获得同源臂TGLS1和TGLS2，亚克隆到BAC载体中，并在两个同源臂中插入正筛选基因Neo的完整表达框，在同源臂外侧插入负筛选基因HSVtk的表达盒(图3)，得到人源染色体BAC靶向载体BACMS，其物理图谱如图1所示。

二、人β-珠蛋白基因簇的获得

用限制性内切酶NotI酶切质粒β^D(构建方法参见“BAC介导的含97kb人β类珠蛋白基因簇转基因鼠模型的建立”，中国医学科学院学报，25(2)：117-21，2003)，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶脉冲场电泳检测，用Millipore Microcon YM-30(购自Millipore公司)浓缩并回收长度为97Kb的人β-珠蛋白基因簇DNA。

三、人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体的构建及其鉴定

1、将步骤一构建的人源染色体BAC靶向载体BACMS用限制性内切酶NotI酶切后，用低熔点琼脂糖凝胶回收线性的载体片段，并用CIAP(TaKaRa)对回收载体片段的末端进行去磷酸化处理。再将该载体片段与步骤二获得的人β-珠蛋白基因簇DNA片段按3∶1的比例进行连接，将连接产物用电转化法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞(每50μL感受态细胞加入4μL连接产物)，将转化后的DH10B细胞涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB抗性平板上，37℃培养12-24小时。用接菌环挑取冻存的β^D细菌，在含有25μg/mL氯霉素的LB抗性平板上划线，获得单个β^D细菌菌落。在无菌条件下，挑取长出的单菌落，将其接种到新的已分区的LB平板上，同时接种三个含有β^D的菌落为阳性对照，成不规则的三角形。以人β-珠蛋白基因簇5’HS2为探针进行原位菌落斑点杂交试验，结果如图4所示，图中三角形的顶点A、B和C是接种β^D的菌落的阳性对照，平板上90％以上是阳性菌落。

2、酶切鉴定

从原位菌落斑点杂交平板上挑取12个经原位菌落斑点杂交试验检测为阳性的克隆，小量提取质粒DNA，用限制性内切酶NotI酶切进行初步鉴定，对酶切产物行1％琼脂糖凝胶脉冲场电泳检测，结果如图5所示，泳道1-12表示从平板上挑取的单个菌落，泳道Bd为β^D质粒的NotI酶切图谱，得到7kb和97kb两条电泳带；泳道T为BACMS质粒用NotI酶切线性化后的图谱，得到一条14kb电泳带。待鉴定的克隆质粒经NotI酶切可得到14kb和97kb大小片段的为阳性克隆，在所选的12个单克隆中，除9号和11号克隆的酶切结果不确定外，其余10个克隆均是阳性克隆。

3、不同酶切鉴定

由于目的DNA和载体都是用NotI单酶切，并通过该切点进行粘性末端连接，有可能存在两种连接方向：人β-珠蛋白基因簇和载体中的Neo的转录方向相同或相反。为鉴定所构建的人β-珠蛋白基因簇的人源染色体打靶载体的完整性和人β-珠蛋白基因簇DNA插入载体的方向，分别用限制性内切酶MluI、SalI和XhoI消化经步骤2鉴定的阳性克隆(1号、2号和3号克隆)的质粒DNA，对酶切产物行1％琼脂糖凝胶脉冲场电泳检测，结果如图6所示，泳道M，X，S和N分别表示上述三个克隆的MluI、SalI、XhoI和NotI酶切产物，泳道Bd/N表示β^D质粒的NotI酶切产物，泳道T/N表示BACMS质粒的NotI酶切产物。阳性克隆的预期酶切分析结果如图6A所示。酶切鉴定结果表明1、2号克隆的酶切结果与预期有差异，原因可能是在载体重组过程中大片段人β-珠蛋白基因簇出现了缺失，得到了意外的酶切结果。3号克隆的酶切结果与预期结果一致，表明人β-珠蛋白基因簇插入方向与Neo的转录方向相同，选择3号克隆提质粒用下述方法作进一步鉴定。

4、Southern blot鉴定重组载体中人β-珠蛋白基因簇的完整性

完整的β-珠蛋白基因簇除含有ε-、γ^G、γ^A、δ和β等功能基因外，5’末端及3’末端还含有重要顺式作用元件，如5’HS432、HS5和3’HS1等，对于功能基因的时空表达调控起非常重要的作用。为确定功能基因和顺式作用元件在载体构建过程中是否有缺失，分别用HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γ^A-珠蛋白基因等为模板标记探针，对构建的人β-珠蛋白基因簇的靶向BAC载体在经限制性内切酶EcoRI酶切后进行Southern blot分析，以经EcoRI酶切的含β^D的质粒为阳性对照。杂交后可得到10.5kb的HS432基因、6.98kb的β-珠蛋白基因、5.5kb的γ.^A-珠蛋白基因、3.3kbHS5基因和1.0kb的3’HS1基因五条特异性杂交带，结果如图7所示。与阳性对照β^D/EcoRI结果比较，所构建的新靶向载体包含有人β-珠蛋白基因簇关键的顺式作用元件、β-珠蛋白及γ-珠蛋白等功能基因。

上述对重组BAC载体不同酶切结果及Southern blot分析结果表明已获得含有完整人β-珠蛋白基因簇、且其连接的方向与Neo的转录方向一致的人源染色体靶向载体，将其命名为BACMS/BGGC，其部分物理图谱如图8所示。

实施例2、单克隆细胞株的获得及其基因组DNA的结构分析

一、单克隆细胞株的获得

将实施例1构建的包含有人完整β-珠蛋白基因簇的人源染色体BAC靶向载体(BACMS/BGGC)用脂质体法转染K562细胞(或将BACMS/BGGC用限制性内切酶SgrAI使线性化后电转K562细胞)。为防止在G418(购自Sigma公司)和GCV(购自Sigma公司)两种筛选药物同时作用下，阳性细胞克隆可能丢失的状况，采用分步筛选的方法。首先用400μg/mL的G418筛选6周后，获得12株抗G418的单克隆细胞，提取基因组并冻存各个细胞株；同时对12株细胞加用10μg/mL GCV进行负筛选。结果获得2株细胞，命名为IIG2和IIG12，能在正、负筛选压力下稳定培养和传代，对这两个细胞株用下述方法进行基因组DNA的结构分析。

二、单克隆细胞株的基因组DNA结构分析

1、PCR检测

分别以步骤一获得的12株抗G418的单克隆细胞单克隆细胞株(包括IIG2和IIG12)和正常K562细胞的基因组DNA为模板，分别用Neo、HSVtk和BAC骨架的引物，进行PCR扩增，其引物序列分别为：NeoP1：5’attcctgatcgacaagaccggc 3’和NeoP2：5’gagaggctattcggctatga 3’；HSV-tk的PCR引物：tkP1：5’tcccaaggcagtctggagcat 3’和tkP2：5’atctgcggcacgctgttgac 3’；BACMS载体BAC骨架部分PCR引物：BACP1：5’tgaagtggagcggaattatgt 3’和BACP2：5’tggtcaacgaacagatacag3’。如是阳性结果，应分别得到420bp、523bp和636bp大小的特异性扩增条带；如是靶向定点整合，Neo基因PCR结果阳性，而HSVtk基因和BAC骨架PCR结果为阴性；如是随机整合，除Neo基因PCR结果阳性外，HSVtk基因和(或)BAC骨架PCR结果也为阳性。反应结束后，对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示(泳道N，K，B，R分别为阴性对照，K562细胞，BACMS质粒和BACMS/BGGC质粒的PCR产物；泳道1-12分别表示所获得的12株细胞克隆的PCR产物，其中，泳道8和泳道9分别表示IIG2和IIG12细胞克隆，泳道m表示DL2000 DNAMarker)，在获得的12株细胞克隆中，IIG2和IIG12的PCR检测结果表明Neo呈阳性、HSVtk和BAC骨架为阴性，其余克隆除Neo呈阳性外，HSVtk和(或)BAC骨架也出现了阳性结果。通过正、负筛选后得到的2株细胞克隆IIG2和IIG12的经PCR检测表明是定点整合克隆外，对其它的细胞克隆仍需作进一步的鉴定。

2、Southern blot分析

1)整合位点分析

由于该人源染色体靶向载体中的同源臂是来自人BAC文库RP11-208G20(包含有人7号染色体长臂末端7q36.1)，在靶向载体介导目的DNA进行同源重组时，将目的DNA定点整合于该区域(定位在7q36.1的MLL3基因最后一内含子)，同源臂外侧是染色体本身的序列，该序列与RP11-208G20中第二个同源臂下游序列一致。选择Neo基因中一段DNA作为杂交的探针，BglII酶切细胞克隆基因组。RP11-208G20中在第二个同源臂下游3345bp的位点出现第一个BglII酶切点。在该重组载体上有两个BglII酶切位点即97296位点以及102367位点。97296位点位于Neo基因下游人β-珠蛋白基因簇5’端；102367位点位于tk基因的内部。如重组载体与基因组发生包含tk的随机整合，BglII酶切基因组后与探针杂交得到一条5071bp的杂交带；如发生定点整合，载体97296 BglII酶切位点距第二个同源臂下游3345bp的位点长度是7871bp，Neo基因探针杂交得到7871bp的杂交带。

用BglII对12株单细胞克隆及正常K562细胞基因组DNA进行酶切、电泳、转膜和杂交，同时用BglII进行酶切后的BACMS/BGGC质粒作为对照，如图10所示(泳道B为BACMS/BGGC质粒的BglII酶切产物，泳道1-9为9株单克隆细胞，其中泳道2表示IC1细胞克隆，泳道4和泳道7分别表示IIG2和IIG12细胞克隆)，结果表明正常的K562细胞基因组无特异杂交带；BglII进行酶切后的BACMS/BGGC质粒出现约5kb的杂交带；PCR检测证实定点整合的两株细胞克隆IIG2和IIG12均有一条约8.0kb的特异杂交带；有一株单细胞克隆IC1则出现两条特异的、大小分别约是5.0kb和8.0kb杂交带；其余9株单细胞克隆都出现一条约5kb大小的杂交带。单细胞克隆IC1出现两条特异性杂交带，原因可能是在该细胞株中，靶向载体介导目的DNA转移时既有定点的同源重组，同时又有随机整合；或者是在分离单个细胞克隆时，得到了定点整合和随机整合的混合细胞克隆。此结果尚需DNA-FISH进一步证实。

2)转移DNA完整性分析

为确定功能基因和顺式作用元件在同源重组过程中是否有缺失，分别用HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γ^A-珠蛋白等为模板标记探针，对细胞克隆基因组DNA经EcoRI酶切后进行Southern blot分析，结果如图11所示(泳道1-5分别为单细胞克隆IB7、IC1、IIG2、IIG12和VIA9，泳道0.1T表示0.1拷贝的质粒BACMS/BGGC DNA，泳道1T表示1拷贝的质粒BACMS/BGGC DNA，泳道K表示K562细胞)，0.1拷贝酶切质粒DNA的杂交带不明显，不作进一步分析。使用图象分析软件UVISoft UVIBandApplication V97.04进行图谱分析，计算所有泳道杂交带总密度，并与一个拷贝质粒DNA对应的杂交带总密度比较得到比值，结果如表1所示：

              表1细胞克隆的拷贝数分析结果

  杂交的DNA  HS432  β-珠蛋白  γ^A-珠蛋白  HS5  3’HS1  1B7细胞株  1C1细胞株  2G2细胞株  2G12细胞株  6A9细胞株  K562细胞  单拷贝质粒  2.33  3.37  2.63  2.42  2.44  1.38  1.00  2.01  3.05  2.03  1.85  2.12  1.58  1.00  3.06  3.83  3.73  4.16  4.19  2.25  1.00  3.04  3.20  3.40  3.36  3.97  1.81  1.00  2.18  3.07  2.33  2.24  2.34  1.44  1.00

以β-珠蛋白基因组中HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γ^A-珠蛋白为横坐标，各杂交带分别与单拷贝质粒DNA中对应的各杂交带密度的比值为纵坐标，对5株细胞克隆和K562细胞作柱状图(如图12所示)，结果表明无论是定点整合克隆或随机整合的细胞克隆，同源重组后β-珠蛋白基因簇中HS432、HS5、3’HS1、β-珠蛋白和γ^A-珠蛋白等组成成分的拷贝数比K562细胞1-2倍。

3、DNA FISH分析

1)将构建的人源染色体靶向载体BACMS/BGGC通过缺口平移方法标记探针(所用Nick标记试剂盒购自Sigma公司)，取1μL标记产物行PAGE电泳，标记结果如图13所示(泳道30、90、120表示Nick酶在16℃反应时间分别为30、90、120分钟；泳道M表示DL2000 DNA Marker)。主带位于300bp-500bp时，探针标记比较理想。用反应90分钟的标记探针与选用的单克隆细胞IIG2染色体进行杂交，结果如图14所示，在单克隆细胞IIG2染色体的分裂相中除11号染色体染色体易分析外，FISH信号所在其它位置较难分析。为更好地确定靶向载体转移目的DNA在染色体上确切的位置，改作高分辨率G-显带-DNA FISH技术。

2)G-带DNA-FISH分析

对经PCR和Southern blot鉴定为定点整合的单克隆细胞株IIG2、IIG12及既有定点整合又有随机整合的单克隆细胞株IC1和随机整合的细胞株IB7分别按照已确定的高分辨率方法进行细胞培养、收获细胞染色体，每个细胞克隆滴片20-50张。每株细胞首先选取3-5张玻片进行G-显带，观察各个细胞克隆的高分辨率G-带并分析。在作G-显带时，胰酶消化的时间必须严格控制，一般要求是“宁欠勿过”，即比普通的G-显带的胰酶消化时间稍短。每张玻片选取20-40个染色体形态较好、分散均匀的分裂相，拍照片并记录各分裂相在显微镜上的坐标，对各个染色体排对、记录。迅速将玻片进行脱色处理并行DNA-FISH杂交。在杂交前对染色体进行变性时，其变性的温度和时间需进行优化，变性过度，易导致染色体脱落或染色体出现“发毛”现象，变性不够时，不易获得杂交信号。一般变性温度比常规DNA-FISH低1-2℃，变性时间比常规DNA-FISH短30秒。在荧光显微镜下查找G-带时记录的坐标，对已记录的分裂相与原记录的G-带图谱比较，确定为G-显带同一分裂相后拍照片记录荧光信号。高分辨率-G-显带-DNA-FISH技术在实际操作中有非常多的影响因素，任何一个环节处理不当，在FISH杂交时均不易获得满意的结果。

对上述四株细胞进行了250多次实验，每个克隆记录分析200-300个分裂相，只获得数个比较理想FISH结果的分裂相。图15-17分别表示IIG2、IIG12和IC1细胞克隆染色体高分辨G-显带-DNA FISH。IIG2和IIG12两个细胞克隆中，杂交信号都出现在11pter和7qter位置，进一步证实了这两株细胞克隆均是定点整合，与PCR及Southern blot的结果一致；而IC1细胞克隆的杂交信号却出现在11pter、7qter和1qter的位置，说明靶向载体在介导目的DNA转移时，既有定点整合又有随机整合。

三、人γ^A-珠蛋白基因表达水平分析

用终浓度为50μM的Hemin(购自Sigma公司)诱导三株单克隆细胞IIG2、IIG12和IC1分化，4天后，提取细胞总RNA，进行RPA检测，以未经Hemin诱导的单克隆细胞和K562细胞为对照，结果如图18所示，泳道K、1、2、3分别表示K562、单克隆细胞IC1、IIG2、IIG12未经Hemin诱导的表达谱，泳道编号KH、1H、2H、3H表示上述4株细胞经过Hemin诱导后的表达谱。其中未经Hemin诱导的克隆的RPA实验结果如图19所示(纵坐标表示^Aγ-珠蛋白基因在稳定整合克隆中的表达量)，表明^Aγ-珠蛋白基因在稳定整合克隆中的表达量较对照细胞明显为高，平均可达到1.27-1.64倍；对经Hemin诱导的细胞克隆进行RPA实验的结果如图20所示，表明3个克隆的表达量是对照的1.28-1.49倍，但Hemin对K562细胞的诱导作用并没有明显的差异。