预防/治疗HBV感染和HBV介导疾病的组合物

摘要

本发明涉及包含至少2种乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或编码它们的核酸的组合物，其中HBsAg在S区和/或前S1区的HBV基因型不同并且组合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或编码该抗原的核酸；以及涉及药物组合物，特别是包含那些用于预防/治疗HBV感染或HBV介导疾病的组合物的疫苗。本发明还涉及制备用于治疗性治疗乙型肝炎的患者特异性药物的方法。

说明书

本发明涉及包含至少两种乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或编码它们的核苷酸的组合物，其中HBsAg在HBsAg S区和前S1区的乙型肝炎病毒(HBV)基因型不同并且组合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)和编码该抗原的核酸；本发明涉及包含这些组合物的药物组合物，特别是疫苗以及它们在预防和治疗HBV感染和HBV介导疾病中的用途。本发明还涉及制备用于治疗性治疗肝炎的患者特异性药物的方法以及诊断HBV基因型的试剂盒。

全世界有超过2.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)。这些感染者的大部分表现出病理性结果，包括慢性肝功能不全、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。对于为何一些人发展成急性HBV感染而另一些人没有发展成急性HBV感染的原因了解甚少。临床资料以及与其它慢性病毒感染的类似性强调了细胞介导的免疫反应在控制病毒感染中的重要性，特别是包括细胞毒T淋巴细胞的免疫反应。细胞毒T细胞反应的诱导是消除急性HBV感染和预防慢性HBV感染的关键因素。病毒基因组还编码包膜蛋白前S1、前S2和S抗原(HBsAg)、聚合酶和核心蛋白(HBcAg)。

慢性乙型肝炎是慢性迁延性和慢性活动性进程的肝脏进行性炎症。慢性迁延性肝炎表现为限定在肝脏中的具有增加形成纤维组织的扩大的门区浸润；在临床上迁延性肝炎的病征维持数年(长达10年)，大约80％的病例为HBsAg阳性。发病机制可能是基于细胞免疫系统功能不全和持续性病毒感染。

乙型肝炎的小表面抗原(HBsAg)是一个226个氨基酸的蛋白质(p24/gp27或S蛋白)，它是一个重要的HBV抗原，其自身装配在20-30nm的脂蛋白颗粒中，其中100-150个亚单位通过多重分子间和分子内二硫键交联起来。来自不同亚型和基因型的HBV株的S蛋白的变异性是有限的。四个稳定HBsAg亚型adw、ayw、adr和ayr涉及邻近免疫显性“a-决定簇”(包含残基124-147的亲水区)的位置122和160的单一氨基酸互换。这些亚型先前未曾确定在HBV感染中具有任何生物学或发病机制上的差异。

从慢性HBsAg携带者血浆获得的疫苗于1982年在联邦德国第一次获得批准。自那次以后，疫苗可以通过遗传技术生产并且用于危险人群的主动免疫。在接种前为血清反应阴性的人群中有95％的人在一年后表现出免疫反应。所使用的所有乙型肝炎疫苗包含高浓度的纯化HBsAg蛋白质(对应于乙型肝炎病毒的非感染性外壳)并且不合病毒DNA或者是福尔马林灭活的。

先有技术的缺点是：在进行免疫的人群中有至少5％为不表现出免疫反应的“非反应者”。此外，迄今为止在已知的疫苗中没有一个能够治疗慢性迁延性肝炎。

WO 01/40279和WO 01/38498描述了基于乙型肝炎病毒基因型G的疫苗，但是两个专利的说明书没有提到不同基因型的组合。

Michel等，PNAS92(1995)，5307-5311和Mancini等，PNAS93(1996)，12496-12501涉及基于HBsAg的DNA疫苗。文件中没有提到不同HBV基因型的HBsAg的组合。

因此本发明基于提供预防/治疗HBV感染或HBV介导疾病改进手段的问题。本发明还基于提供治疗性治疗肝炎的患者特异性药物的问题。本发明进一步的目标是提供诊断HBV感染的改良试剂盒。

通过提供包含至少两种乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或编码它们的核酸的组合物来解决本发明潜在的问题，其中HBsAg在HBsAgS区和/或前S区的乙型肝炎病毒(HBV)基因型不同并且组合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或编码该抗原的核酸。

本发明基于以下令人惊奇的发现：在肝中组成型表达HBsAg亚型ayw的转基因小鼠可以当作评价针对慢性HBV感染的特异免疫治疗方案的效率的潜伏期模型。此种小鼠因为持续性抗原血症而产生大量HBsAg，并且它们基本上耐受HBsAg。一方面，本发明人现在已经用其HBsAg基因型恰恰为转基因小鼠基因型(ayw)的疫苗免疫了HBsAg转基因小鼠，另一方面，用包含与转基因小鼠基因型不同的HBsAg基因型的疫苗免疫了HBsAg转基因小鼠。尽管用对应于其自身HBsAg的HBsAg抗原重复免疫转基因小鼠，却没有观察到细胞毒T细胞反应。相反，用不同于其自身基因型的HBsAg基因型免疫转基因小鼠导致产生针对HBsAg的基因型特异和交叉反应的细胞毒T细胞反应。这表明天然存在的HBsAg变体可以通过引发交叉反应性T细胞免疫而打破“耐受”。细胞毒T细胞免疫的活化导致HBsAg ayw抗原的降低并因此导致产生了相当于HBV被有效控制的急性肝炎的肝特异性病症和综合征。由于HBsAg ayw抗原的氨基酸序列与HBsAg adw2抗原的氨基酸序列仅在少数位置不同，因此所观察到的免疫反应特别明显。本发明已经证实，甚至T细胞表位内的氨基酸的少量保守交换会导致针对该表位的T细胞反应的变化。

对蛋白质抗原的T细胞反应的特异性和有效性在多种水平受到控制，特别的决定性因素为：(i)表位(或抗原肽)的蛋白水解释放；(ii)抗原肽对主要组织相容性复合物(MHC)的递呈糖蛋白的亲和性；和(iii)对同一抗原不同表位的竞争性发展的T细胞反应的负面干扰。蛋白质抗原的天然变体(通过表位或表位侧翼中关键序列的单个氨基酸交换或者通过新表位的产生)以下列四种方式诱导T细胞反应：

(i)来自蛋白质的抗原肽的更有效蛋白水解加工(释放)；

(ii)抗原肽与递呈MHC分子的高亲和性结合；

(iii)通过与(i)和/或(ii)中提到的过程相类似的过程消除能够减弱表位免疫原性的免疫显性表位(免疫显性表位抑制了对同一蛋白质抗原不同表位的反应)；

(iv)产生新表位。

在本发明上下文中已经证明HBsAg天然变体(通过基因型所表现出来的)对其所刺激的T细胞反应具有相对广谱的特异性。

与本发明有关的术语“HBV基因型”意思是指乙型肝炎病毒基因组的全部。HBV基因型优选通过全部测序和系统发生分析确定。当前已知8个标准基因型。该8个基因型彼此的核苷酸变化为8％；见Bartholomeusz，Rev.Med.Virol.13(2003)，1-14。优选地，HBV基因型A具有参考核酸序列Genbank X02763或者HBV基因型A_afr具有参考核酸序列GenbankAF297621。对于HBV基因型Ba，参考核酸序列为Genbank D00330并且对于基因型Bj参考核酸序列为AB073858。对于HBV基因型C，参考核酸序列为Genbank AY206389，并且对于基因型C_aus，参考核酸序列为Genbank AB048704。对于基因型D，参考核酸序列为Genbank X02496。基因型E的参考核酸序列为X75657。基因型F的参考核酸序列为X69798。基因型G的参考核酸序列为AF160501并且基因型H的参考核酸序列为AY090454。

关于上面提到的基因型，在基因型和亚型之间存在一定的相关性，如下：基因型A与亚型adw2、ayw1相关；基因型B与adw2、ayw1相关；基因型C与adw2、adrq+、adrq-、ayr、adr相关；基因型D与ayw2、ayw3、ayw4相关；基因型E与ayw4相关；基因型F与adw4q-、adw2和ayw4相关；基因型G与adw2相关且基因型H与adw4相关。

通过借助于单特异抗体例如抗d、抗y、抗r、抗a(w)的血清学方法确定感染患者的HBV亚型。可以以琼脂凝胶扩散测试形式或者放射免疫分析法形式实现确定；(“HBs Antigen Subtypes”，由Couroucé，A.M.，Holland，P.V.，Muller，J.Y.和Soulier，J.P.出版，Biblotheca Haematologica no.42，S.Karger，Basel，1976)。

还可以通过对来自患者血清的编码HBsAg的DNA进行测序来确定亚型。然后从所确定核酸序列得到HBsAg的氨基酸序列。然后通过如Magnius，L.O.和Norder，H.(“Subtypes，Genotypes and molecularepidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability ofthe S-gene”Intervirology，38(1-2)：24-34)所描述的位置122和160的氨基酸来确定亚型。

与本发明有关的表述“乙型肝炎病毒表面抗原”(HBsAg)指HBV的小表面抗原或者S蛋白(p24/gp27)。HBsAg还可以包括前S1蛋白结构域。优选地，HBsAg由S蛋白和/或前S1蛋白结构域组成。

关于HBsAg的编号，使用了依据Kidd-Ljunggren等人J.Gen.Virol.83(2002)，1267-1280的系统。

根据本发明的术语“片段”包括HBsAg的片段。片段优选包含至少5个氨基酸并且包含T细胞表位，优选至少10个、特别地至少20个、更加特别地至少50个氨基酸。依照优选实施方案，组合物包含至少2种HBsAg或2种其片段。此种组合物特别适宜用作基于多肽的疫苗。特别是在组合物包含来自不同HBV基因型HBsAg的2种片段的情况下，第一种和第二种片段共同具有至少10个氨基酸、优选20个氨基酸但是彼此之间至少有一个氨基酸不同。

如上所提到，本发明基于这样一种认识，即不同基因型所产生抗原(HBsAg)中甚至十分小的差异会导致产生这样一种修饰T细胞表位，所述的修饰T细胞表位彼此之间仅稍稍不同但能够导致T细胞反应极大变化。因此彼此之间至少一个氨基酸差异的两种片段可以通过与已知HBsAg基因型的简单序列比较容易地检测。彼此间至少一个氨基酸不同的适宜片段可以用于本发明的组合物中。片段优选包含至少一个T细胞表位，特别是人T细胞表位。确定T细胞表位的方法是已知的，例如Lauer等，J.Virol.76(2002)，6104-6113。

依据优选的实施方案，组合物包含至少2种HBsAg和/或至少2种其片段。

优选地还提供了至少包含第一种HBsAg或其片段和编码第二种HBsAg或其片段的核酸的组合物，其中第一种和第二种HBsAg的HBV基因型不同。

依据进一步优选的实施方案，组合物至少包含编码2种HBsAg的2种核酸，其中HBsAg的HBV基因型不同。核酸还可以是编码如上所定义片段的核酸。核酸可以是病毒DNA或合成DNA，合成DNA应当理解为包括含有修饰核苷间键的那些DNA序列。核酸还可以是RNA分子，所述RNA分子对于通过重组载体系统方式的表达是必需的。此外，依据本发明混合DNA/RNA分子也考虑作为核酸。

依据优选实施方案，基因型选自已知基因型A、B、C、D、E、F、G和H。关于各个参考核酸序列可以参照上面定义部分。通常，通过与参考核酸序列具有8％核苷酸变异的方式确定基因型，也就是说与参考核酸序列具有至少92％同一性的核酸也被理解为与所定义一致的基因型。相对于参考核酸序列具有至少95％、特别是98％同一性是特别优选的。相对于参考核酸序列的“同一性”在这里可以借助于已知方法进行确定。一般使用具有考虑特殊需求的算法的特殊计算机程序。

首先，使用确定同一性的优选方法产生了被比较序列间的最大一致性。确定同一性的计算机程序包括但不限于包括GAP在内的GCG程序包(Deveroy，J等，Nucleic Acid Research 12(1984)，387；Genetics ComputerGroup University of Wisconsin，Medicine(WI))；和BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215(1990)，403-410)。BLASTX程序可以从国立生物技术信息中心(NCBI)或其它来源(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul，S.等；见上)获得。同样可以使用已知的Smith-Waterman算法确定同一性。

用于核酸比较的优选参数包括下列：

Needleman和Wunsch算法，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453

比较矩阵：

匹配＝+10

错配＝0

开口罚分：50

开口长度罚分：3

同样GAP程序也适宜使用上面的参数。在核酸序列比较中上面的参数是默认参数。算法、开口罚分、开口延伸罚分和比较矩阵的另外实例包括程序手册Wisconsin软件包(版本9，1997年9月)中的那些实例。对其的选择取决于所进行的比较，同样还取决于比较是否在序列对(当使用GAP或Best Fit时)或者序列和大的序列数据银行(当使用FASTA或BLAST时)之间进行。

依据上述算法的92％的一致性代表着与本发明序列具有92％的同一性。同样适用于更高的同一性。

优选地，根据本发明的组合物的特征在于：变体编码其活性基本上相当于参考核酸序列所编码聚合酶活性的聚合酶和/或变体编码其免疫反应性基本上相当于参考核酸序列所编码HBsAg免疫反应性的HBsAg。

聚合酶活性在这里可以依据Kim等人Biochem.Mol.Biol.Int.1999；47(2)：301-308确定。HBsAg免疫反应性可以通过商业可得的抗原ELISA确定。“基本上通过参考核酸所编码HBsAg的免疫反应性”意思是指抗体同参考HBsAg的结合基本上与抗体同变体所编码HBsAg的结合亲和性相同。

根据优选实施方案，组合物包含至少3种、优选至少5种不同HBsAg、其片段和/或编码它们的核酸。

特别优选地，组合物包含所有已知HBV基因型的HBsAg、其片段和/或编码它们的核酸。

根据本发明组合物的进一步优选的实施方案，编码HBsAg或其片段的核酸存在于适于HBsAg在哺乳动物细胞(优选人细胞)表达的启动子控制下的载体中。如果组合物包含至少2种编码HBsAg或其片段的核酸，则这些核酸可以存在于同一载体(双元载体)中或者分别位于彼此不同的载体中。适宜载体例如质粒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、麻疹病毒和逆转录病毒。载体一般包括影响载体在所转染哺乳动物细胞中复制的复制源。

适宜启动子可以是组成型启动子和可诱导型启动子。优选启动子为来自CMV和SC-40的启动子。

上述组合物可以通过简单混合各个成分得到，因此可以十分简单地制备。适宜溶剂和载体取决于组合物(多肽和/或核酸)的性质。原则上，优选包含水的系统。可以合成制备或通过重组制备HBsAg或其片段。所制备多肽可通过色谱方法纯化。

备选地，可以通过重组表达系统中编码HBsAg或其片段的至少2种核酸的共表达而得到组合物。本领域技术人员熟知多种表达系统和方法；优选地使用酵母作为宿主细胞，特别优选地使用多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。核酸可以存在于一个载体中或者分别存在于彼此分开的两个载体中。适宜载体和启动子如上所述。

根据本发明的另一方面，制备了包含本发明组合物和可药用载体的药用组合物。可药用载体是本领域技术人员已知的。实例为铝盐、磷酸钙、添加或不添加多糖的HBsAg冻干物、水包油乳剂、聚丙交酯共甘醇酸酯。如果此种载体本身不具有佐剂作用，则它们可以与另外的佐剂如脂质A模拟物、免疫刺激性核苷酸或细菌毒素混合。

根据本发明的药物组合物优选为疫苗。根据本发明，药物组合物、尤其是疫苗适宜治疗性治疗HBV感染或HBV介导疾病。药物组合物、尤其是疫苗还适宜预防性治疗HBV感染或HBV介导疾病。HBV感染尤其是慢性迁延性乙型肝炎感染。HBV介导疾病可以是急慢性乙型肝炎感染。另外的HBV介导疾病为肝硬化和原发性肝细胞癌。疫苗适合施用于临床不明显HBV携带者，即未患有真正意义上的疾病但具有将来发展成HBV介导疾病的高危险性的携带者。

药物组合物可以肌内、皮下、真皮内、静脉内、粘膜或口服施用，但是此种施用仅仅为优选的并且不是对施用方式的限制。

药物组合物包含剂量范围为0.1-1000μg HBsAg或其片段、优选2.5-40μg HBsAg或其片段的至少2种HBsAg或其片段。

当药物组合物包含编码HBsAg或其片段的核酸时，它们存在的剂量范围为10-1000μg编码HBsAg或其片段的核酸。

本发明的另一方面提供了制备用于治疗性治疗乙型肝炎的药物的方法，其包括以下步骤：

a)确定患者所感染HBV的基因型；和

b)提供包含至少一种HBV基因型的HBsAg、HBsAg片段或编码HBsAg或其片段的核酸的药物，其中HBV基因型不同于根据a)

所确定的患者内HBV的基因型。

如上所述，本发明的重要的认可是：在慢性迁延性肝炎潜伏期模型中，已经通过使用来自与转基因动物基因型不同的HBV基因型的HBsAg处理转基因动物实现了治疗效果。

通过以下方法可以确定基因型：对全HBV基因组或者至少编码HBsAg的部分进行测序以及系统发生分析、限制性片段长度多态性(RFLP)、多重PCR。

以本身已知的方式通过配制至少一种HBsAg、其片段或者编码HBsAg或其片段的核酸实现药物供应。

根据另一方面，本发明提供了诊断HBV感染基因型的试剂盒。试剂盒包含至少2种HBsAg特异性结合物，其特征在于2种HBsAg特异性结合物是对不同HBV基因型特异的。至少2种HBsAg特异性结合物可以是HBsAg基因型特异性引物和/或特异性抗体。引物长度为10-30个核苷酸并且与各个基因型的已知HBsAg序列互补。抗体可以是通过以下步骤得到的抗体，例如免疫实验动物(例如具有对应于目的HBsAg基因型的各个HBsAg的小鼠)、以本身已知的方式制备杂交瘤和筛选亚型特异性单克隆抗体。

附图简述

图1：HBsAg变体。(A)显示了乙型肝炎小表面抗原(HBsAg)ayw(1)(对应于基因型D)和adw2(2)(对应于基因型A)的氨基酸序列。(B)来自HBsAg ayw和adw2的k^b限制性表位序列。表位1(S_208-215)仅由加工外源性HBsAg的细胞递呈，而表位2(S_190-197)仅由加工内源性HBsAg的细胞递呈。

图2：将表位1或表位2特异性细胞毒性T细胞系(CTLL)转移入HBs转基因(HBs-tg)宿主导致暂时性肝脏损伤。从pCI/S_ayw DNA免疫的B6小鼠取出脾细胞并且用同系基因RBL5细胞在体外再刺激，其中RBL5细胞已经用K^b/S_208-215结合肽1(ILSPFLPL)或K^b/S_190-197结合肽2(VWLSVIWM)负载或用ConA刺激。以每只小鼠5×10⁶个CD8⁺CTLL的量静脉(i.v.)注射入HBs-tg小鼠并且测定平均血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。

图3：免疫小鼠肝脏和脾脏内存在HBsAg特异性CD8⁺T细胞的间接体内证明。通过单次注射100μg pCI/S_ayw DNA肌内免疫C57BL/6小鼠。在免疫后12天证明特异性CD8⁺T细胞的存在。用K^b/S_208-215结合肽1(ILSPFLPL)或者K^b/S_190-197结合肽2(VWLSVIWM)体外再次刺激分离肝脏单核细胞(MNC)和脾细胞4小时(在布雷菲尔德菌素A存在的情况下)。显示了每组4-6只小鼠的CD8⁺IFNγ⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均频率±标准差(来自彼此独立的两个实验)。

图4：在HBs-tg小鼠中HBsAg特异性CD8T细胞对表位1的反应。用编码HBsAg亚型ayw(pCI/S_ayw)或adw2(pCI/S_adw2)的DNA疫苗或者用阴性对照载体pCI(没有插入片段的载体)肌内免疫在其肝脏中表达HbsAg_ayw的HBs-tg小鼠三次(免疫间隔为4周)。在最后一次免疫后12天从免疫小鼠中取出脾细胞并用RBL5细胞体外再次刺激4小时(在布雷菲尔德菌素A存在的情况下)，其中RBL5细胞是用ayw(RBL5/S^P_ayw)或adw2(RBL⁵/SP_adw2)亚型的HBsAg颗粒再刺激或者用HBsAg_ayw(ILSPFLPL)或HBsAg_adw2(IVSPFIPL)的K^b/S_208-215结合肽1再刺激。显示了每组4-6只小鼠脾脏IFNγ⁺CD⁸+T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均数量±标准差(来自彼此独立的两个实验)。

图5：在HBs-tg小鼠中HBsAg特异性CD8T细胞对表位1的反应。从如图4的图例中所描述的已免疫小鼠中取出脾脏细胞，并且用同系基因RBL5/S_ayw或RBL5/S_adw2转染子或者HBsAg_ayw(VWLSVIWM)或HBsAg_adw2(VWLSAIWM)的K^b/S_190-197结合肽2再刺激。显示了每组4只小鼠脾脏IFNγ⁺CD8⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均数量±标准差。

图6：S_208-215特异性CD8⁺T细胞在所免疫HBs-tg小鼠肝脏中存在的证明。用编码HBsAg_adw2的DNA疫苗(pCI/S_adw2)免疫转基因HBs-tg小鼠三次(免疫间隔为4周)。在最后一次注射后12天从所免疫小鼠中取出肝脏和脾脏细胞并且用K^b/S_208-215结合肽ILSPFLPL体外再刺激。显示了每组4只小鼠脾脏IFNγ⁺CD8⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均数量±标准差。

图7：用pCI/S_adw2DNA疫苗免疫的HBs-tg小鼠肝脏组织病理学。在B6小鼠(A，B)中没有观察到病理性的肝脏组织学。HBs-tg小鼠(C，D)表现为中等的细胞增大并且细胞质表现出毛玻璃的外观(D)。肝细胞的细胞核表现为中等程度的多形性。门管周浸润罕见。用pCI/S_adw2 DNA重复免疫引起严重的肝脏组织形态学改变(E-I)，这种改变与急性病毒性肝炎引起的改变相一致。位于小叶实质(F)和门管周区(G)的炎性细胞浸润包括Kupfer细胞、淋巴细胞和少量多形核颗粒细胞。肝细胞出现水肿并且常常具有固缩核，这是凋亡早期阶段的征兆(F，箭头)。嗜酸小体(H，箭头)，即凋亡的肝细胞普遍或者常常被病灶炎性细胞浸润包围。许多肝细胞表现出明显的空泡化(I，箭头)。对福尔马林固定并且用石蜡包埋的组织用HE染色。原始放大倍数：A、C和E为10倍；B、D和F为40倍；G-I为63倍。

图8：HBs-tg小鼠中HBsAg特异性血清抗体反应的诱导。用编码HBsAg_adw2(pCI/S_adw2)或HBsAg_ayw(pCI/S_ayw)的DNA疫苗肌内免疫B6小鼠和转基因HBs-tg小鼠，3周后用相同的疫苗加强免疫。在最后一次注射后4周，测试血清样品中的HBsAg抗原(A)或者HBsAg特异性抗体(B)。显示了每组4-6只小鼠的平均抗体滴度(mIU/ml)和血清HBsAg水平(ng/ml)±标准差。

图9：在正常B6和HBs_ayw-tg小鼠中，HBsAg特异性CD8⁺T细胞对表位1(S_208-215)和表位2(S_190-197)的反应。用亚型ayw或adw2的HBsAg蛋白质颗粒(S^P)肌内免疫动物三次(免疫间隔为21天)。每个蛋白质疫苗与作为佐剂的CpG寡核苷酸(ODN)或者RC-529混合。PBS用作阴性对照。在最后一次免疫后12天从动物中取出脾脏，然后将分离的脾细胞用预先用HBsAg特异性肽负载的RBL5细胞体外再刺激4小时(在布雷菲尔德菌素A存在的情况下)。为了实现该目的，使用了HBsAg_ayw(ILSPFLPL)或HBsAg_adw2(IVSPFIPL)的K^b/S_208-215结合肽1或者HBsAg_ayw(VWLSVIWM)或HBsAg_adw2(VWLSAIWM)的K^b/S_190-197结合肽2。显示了每组4-6只小鼠脾脏IFNγ⁺CD8⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均数量±标准差(来自彼此独立的两个实验)。

图10：HBS_ayw-tg小鼠中HBsAg特异性CD8+T细胞对表位1(S_208-215)的反应。

A.用编码单独的HBsAg亚型ayw(pCI/S_ayw)或三种亚型ayw(pCI/S_ayw)、adw2(pCI/S_adw2)和adr(pCI/S_adr)的DNA疫苗或者阴性对照载体pCI(没有插入片段的载体)肌内免疫在其肝脏中表达HBsAg_ayw的HBs-tg小鼠3次(免疫间隔为4周)。在最后一次免疫后12天从动物中取出脾脏。将分离的脾细胞用预先用HBsAg_ayw(ILSPFLPL)或HBsAg_adw2(IVSPFIPL)的K^b/S_208-215结合肽1负载的RBL5细胞体外再刺激4小时(在布雷菲尔德菌素A存在的情况下)。显示了每组4-6只小鼠脾脏IFNγ⁺CD8⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均数量±标准差(来自彼此独立的两个实验)。

B.用亚型ayw的HBsAg蛋白质颗粒(S^P)或亚型ayw、adw2和adr的HBsAg蛋白质颗粒混合物肌内免疫HBsayw-tg小鼠三次(免疫间隔为21天)。每个蛋白质疫苗与作为佐剂的CpG寡核苷酸(ODN)或者RC-529(仅显示了与亚型混合物的混合)混合。PBS用作阴性对照。在最后一次免疫后12天从动物中取出脾脏。将分离的脾细胞用预先用HBsAg_ayw(ILSPFLPL)或HBsAg_adw2(IVSPFIPL)的K^b/S_208-215结合肽1负载的RBL5细胞体外再刺激4小时(在布雷菲尔德菌素A存在的情况下)。显示了每组4-6只小鼠脾脏IFNγ⁺CD8⁺T细胞/10⁵CD8⁺T细胞的平均数量±标准差(来自彼此独立的两个实验)。

图11：HBs-tg小鼠中HBsAg特异性血清抗体反应的诱导。

用亚型ayw或adw2的HBsAg蛋白质颗粒疫苗(S^P)或亚型ayw、adw2和adr的HBsAg蛋白质颗粒混合物疫苗肌内免疫B6小鼠和转基因HBs-tg小鼠，3周后用相同的疫苗加强免疫。蛋白质疫苗包含作为佐剂的添加物CpG寡核苷酸(ODN)。在加强免疫注射后4周，测试血清样品中的HBsAg抗原(A)和HBsAg特异性抗体(B)。显示了每组4-6只小鼠的平均抗体滴度(mIU/ml)和血清HBsAg水平(ng/ml)±标准差。

本发明将在以下更加详细地描述实施例。然而实施例不是旨在限制本发明。

实施例：

材料和方法

概述

正在研究的HBV亚型adw2对应于基因型A。HBV亚型ayw对应于基因型D。HBV亚型adr对应于基因型C。

小鼠

将C57BL/6Jbom(B6)小鼠(H-2^b)置于标准的无病原体条件下。

C57BL/6J-TgN(Alb1HBV)44Bri转基因(HBs-tg)小鼠、HBsAg_ayw(由具有保藏号V01460 J02203的HBV序列编码)从Jackson实验室(BarHarbour，ME)得到。使用8-16周龄的雌性和雄性小鼠。

细胞、重组HBsAg颗粒和抗原性HBsAg肽

所使用的H-2^b细胞系RBL5描述于[10]。制备了表达相似数量HBsAg_ayw和HBsAg_adw2的稳定RBL5转染子(数据未显示)。亚型ayw、adw2和adr的重组体HBsAg颗粒从Rhein Biotech GmbH(Düsseldorf，德国)得到。如所述[3]纯化在多形汉逊酵母宿主RB10株中制备的HBsAg颗粒。合成的K^b结合S_208-215ILSPFLPL(ayw)或IVSPFIPL(亚型adw2)肽和K^b结合S_190-197VWLSVIWM(ayw)或VWLSAIWM(adw2)肽从JeriniBioTools(Berlin，德国)获得。将肽以10mg/ml的浓度溶于DMSO溶液并在使用前用培养基稀释。

质粒和DNA免疫

如所述[4；5]将HBsAg_ayw、HBsAg_adw2和HBsAg_adr克隆入pCI(Promega)和BMGneo载体。作为DNA疫苗，使用了表达HBsAg_ayw、HBsAg_adw2和HBsAg_adr同样好的质粒pCI/S_ayw、pCI/S_adw2、pCI/S_adr。从来自用这些质粒瞬时转染细胞中对HBsAg进行的免疫沉淀证明了这一点(数据未显示)。因此，HBsAg表位免疫原性的不同不能解释为由DNA疫苗所表达HBsAg的量不同或者转染子不同。对于肌内核酸免疫，如所述[4]将包含1μg/μl质粒DNA的50μl PBS(磷酸缓冲盐溶液)注射入每一胫骨前肌。通过注射包含1μg/μl pCI/S_ayw、1μg/μl pCI/S_adw2和1μg/μlpCI/S_adr的50μl PBS实现HBsAg亚型混合物免疫。

用HBsAg蛋白质颗粒免疫

向每只小鼠皮下注射5μgHBsAg蛋白质颗粒和溶于100μl PBS(磷酸缓冲盐溶液)的30μg CpG寡核苷酸(ODN1826，MWG Biotech，Ebersberg，德国)或8μg RC-529(Corixa Corp.Settle，WA，美国)。对于用HBsAg亚型混合物进行免疫，在一次中皮下注射5μgHBsAg_ayw、5μg HBsAg_adw2和5μg HBsAg_adr蛋白质颗粒以及溶于100μl PBS的30μg CpG寡核苷酸佐剂或8μg RC-529。

特异性脾脏和肝脏CD8⁺-T细胞频率的确定

脾细胞悬液[1]和肝脏NPC(非实质)细胞制备描述于[6；7]。将脾细胞和肝脏NPC(1×10⁶/ml)在具有5μg/μl HBsAg衍生肽或HBsAg表达转染子(10⁶/ml)或HBsAg颗粒负载的细胞的RPMI-1640培养基孵育1小时。然后加入5μg/μl的布雷菲尔德菌素A(BFA)(目录号15870；Sigma)并且将培养物进一步孵育4小时。收获细胞并且用抗CD8 mAb对其表面进行染色，然后固定、透性处理和细胞质IFNγ染色。通过FACS分析确定CD8⁺IFNγ⁺CTL的频率。显示了10⁵个脾脏或肝脏T细胞中CD8⁺IFNγ⁺T细胞的平均值。

特异性CD8⁺T细胞系的转移

从用pCI/S_ayw DNA疫苗免疫的B6小鼠脾脏获得CD8⁺T细胞系。使用经K^b/S_208-215结合肽1(ILSPFLPL)或K^b/S_190-197结合肽2(VWLSVIWM)负载的同系基因RBL5细胞体外再刺激脾细胞。在体外刺激大约2周的细胞系中，超过80％的CD8⁺T细胞具有预期的表位特异性，这如特异性IFNγ表达测试所证明。洗涤细胞并且用这些细胞系的5×10⁶个细胞静脉内注射。对照细胞是从ConA刺激3天的培养物分离的非特异性CD8⁺T母细胞(blast)。

血清中转氨酶、HBsAg和抗HBsAg抗体的确定

通过在注射后一定时间点自尾静脉抽取血液从各个免疫小鼠或对照小鼠中重复获得血清抗体。使用Reflotron^测试(目录号745138；RocheDiagnostics GmbH)测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。通过商业ELISA AUSZYME II测试(ABBOTT Laboratories，Wiesbaden，德国)测定转基因小鼠血清中的HBsAg浓度。使用商业IMxAUSAB测试(目录号7A39-20；Abbott，Wiesbaden，德国)测定抗HBsAg抗体。

使用6份标准血清定量抗体水平。将测试血清稀释以致于所测定的OD值在标准血清1和6的数值之间。用血清稀释倍数乘以所测定抗体水平(mIU/ml)得到此处所示数值。所给出的血清滴度对应于4只单个小鼠的平均值±标准差。

组织学

薄的肝脏组织切片(＜3mm)用4％福尔马林(pH 7.0)固定24小时并且用石蜡包埋。将2μm厚的石蜡切片用苏木精-伊红(H&E)染色。

HBsAg肽与K^b的结合

如所述[8，9]，在3μM人β2m存在的条件下，将亲和纯化的MHC I类分子K^b与浓度递增的测试肽和限定浓度(大约2nM)放射性标记的VSVNP 52-59指示肽于18℃孵育48小时。然后，通过Sephadex G50柱凝胶过滤[8]确定肽与MHC I类分子的结合。放射性标记的VSV NP 52-59肽位于排斥体积(MHC结合肽)和内含体积(inclusion volume)(游离肽)。这可以通过γ放射光谱学测定，并且确定结合MHC分子的测试肽相对于测试肽总量的比例。确定了达到指示肽结合50％抑制所需要的测试肽浓度(IC50值)。IC50值越低，则测试肽的结合越好。为了防止配体耗尽，在所有结合实验中使用的MHC体积足以实现至多15-25％结合。在这些条件下，IC50值接近于解离常数(K_d)。所有结合实验均作为抑制实验进行。

实施例1：表位1或表位2特异性K^b限制性CD8⁺T细胞系过继转移入

HBs-tg B6小鼠导致肝脏损伤

从使用pCI/S_ayw质粒DNA免疫的B6小鼠脾脏产生对HBsAg表位1或表位2(图1B)特异性的短期CD8⁺T细胞。在这些细胞中有＞95％的细胞为CD8⁺，并且在这些CD8⁺T细胞中有＞80％的细胞能诱导表达IFNγ。将这些细胞系的5×10⁶个细胞过继转移入在肝脏中从转基因表达HBsAg_ayw的同类系B6宿主中导致急性肝损伤，如通过血清转氨酶的短期且极大升高所示(图2)。在转移后5-6天，血清转氨酶水平恢复正常，此时在宿主中检测不到CD8⁺T细胞。转移相同数量的多克隆(丝裂原刺激的)CD8⁺T母细胞没有表现出肝损伤。因此，可以确定(i)在HBs-tg小鼠中特异性CD8⁺T细胞诱导肝损伤(如在[2]中所述)；(ii)在表达转基因的肝脏中出现了通过内源或外源HBsAg加工产生的HBsAg表位；和(iii)过继转移进入的CD8⁺T细胞被迅速地从转基因宿主中去除。所转移的CD8⁺T细胞具有不同的HBsAg特异性，因此可以进入肝脏并被原位活化，但是不能被稳定吸引。

实施例2：在脾脏和肝脏中观察到识别HBsAg表位1和2的K^b限制性CTL

开展了关于疫苗所致敏HBsAg特异性CD8⁺T细胞是否能够进入正常或表达转基因HBsAg(HBs-tg)的B6小鼠肝脏的研究(图3)。从预先用pCI/S_ayw疫苗免疫12-15天的B6小鼠中分离脾细胞和非实质肝细胞(NPC)。从来自正常B6小鼠的脾脏和肝脏CD8⁺T细胞群中发现了表位1或表位2特异性的CD8⁺T细胞(图3A)。虽然在肝脏CD8⁺T细胞群中HBsAg特异性CD8⁺T细胞的频率高，但是它们的绝对值比脾脏中的小(数据未显示)。相反，在用编码HBsAg_ayw的DNA疫苗免疫的HBsAg_aywtgB6小鼠中没有CD8⁺T细胞反应(图3B)。用DNA疫苗三次加强免疫注射(间隔为3周)和用HBsAg抗原颗粒及寡核苷酸佐剂重复免疫均不能在HBs-tg小鼠中产生HBsAg特异性CD8⁺T细胞免疫(数据未显示)。因此，使用小鼠所耐受的相同HBsAg变体进行接种的方案不能引发有效的抗病毒CD8⁺T细胞免疫。

实施3：K^b限制性T细胞对HBsAg_ayw和HBsAg_adw2变体的反应

具有226个氨基酸的HBV株HBsAg_ayw和HBsAg_adw2蛋白质不同之处在于16个氨基酸残基(相应的氨基酸同一性为93％)。所使用的HBsAg_ayw蛋白质的序列与HBs-tg B6小鼠所表达的转基因编码的HBsAg_ayw的序列相同。所选择的HBsAg_ayw和HBsAg_adw2的K^b结合表位1和2的序列不同之处分别在于表位内的1个和2个氨基酸残基，但是它们的侧翼序列是相同的(图1A，1B)。HBsAg_ayw和HBsAg_adw2的S_208-215表位1存在2个位置的不同：adw2中位置2上的缬氨酸(V)被亮氨酸(L)取代，并且位置6上的异亮氨酸(I)被亮氨酸(L)取代(图1B)。表位1的K^b结合亲和力相当低；与表位的HBsAg_ayw变体相比，表位1的HBsAg_adw2变体表现出更高的K^b结合亲和力(表1)。相反，表位2的K^b结合亲和力高(表1)。

  表1：免疫原性HBsAg表位对K^b的结合亲和力

  表位1  HBsAg变体ayw  肽序列ILSPFLPL  K^b结合(nm)3400  1  adw2  IVSPFIPL  773  2  ayw  VWLSVIWM  54

用pCI/S_ayw或pCI/S_adw2DNA疫苗免疫的B6小鼠表现出对K^b结合表位1的CD8⁺T细胞反应，这是在对已经用HBsAg_ayw或HBsAg_adw2颗粒或者用HBsAg_ayw或HBsAg_adw2抗原肽S_208-215负载的致敏脾脏CD8⁺T细胞进行间接体内再刺激5小时后观察到的(图4A，组2，3)。表位1的ayw和adw2变体交叉反应，因为(i)通过pCI/S_ayw或pCI/S_adw2能够使表位1特异性CTL致敏；和(ii)已经用HBsAg_ayw或HBsAg_adw2颗粒或者已经用肽ILSPFLPL(ayw)或肽IVSPFIPL(adw2)负载的细胞向致敏CD8⁺T细胞递呈表位1。因此，8-mer表位1内的2个替代不能表现出有效的表位加工、K^b结合或递呈。

已经用pCI/S_ayw DNA疫苗致敏的CD8⁺T细胞识别HBsAg_ayw或HBsAg_adw2的表位2(S_190-197)(图5A；组2)。这可以通过使用负载肽的细胞或者表达HBsAg_ayw的转染子间接体内再刺激5小时后得到证明。致敏CD8⁺T细胞不识别表达内源性HBsAg_adw2的转染子。用pCI/S_adw2DNA疫苗免疫不能使表位2特异性T细胞致敏(图5A，组3)。用pCI/S_adw2(而不是pCI/S_ayw)DNA疫苗致敏的CD8⁺T细胞能够识别转染子所递呈的表位/限制特异性未知的adw2特异性表位(图5，组3)。因此第5位氨基酸的替换(将疏水的缬氨酸V交换成疏水的丙氨酸A)抑制表位2的产生，但是不抑制由K^b分子的递呈[1]。

实施例4：交叉反应性K^b限制性CD8⁺T细胞对HBsAg表位1的反应在HBs-tg B6小鼠中致敏

HBs-tg B6小鼠在肝脏中从转基因表达HBsAg_ayw。HBs-tg小鼠用HBsAg_ayw(pCI/S_ayw)或HBsAg_adw2(pCI/S_adw2)免疫(图4，5B)。使用pCI/S_aywDNA疫苗重复免疫HBs-tg B6小鼠没有得到CD8⁺T细胞反应(图4，5B，组2)。相反，使用pCI/S_adw2DNA疫苗免疫HBs-tg B6小鼠则产生了对HBsAg的CD8⁺T细胞反应(图4B，组3)。这种交叉反应性的CD8⁺T细胞反应识别已经用HBsAg_ayw或HBsAg_adw2颗粒或者用表位1的肽形式的ayw或adw2变体负载的细胞(图4B，组3)。这些CD8⁺T细胞不识别RBL5/S_ayw转染子或者K^b结合表位2S_190-197(图5B，组3)。CD8⁺T细胞表现出对由RBL5/S_adw2转染子(而非RBL5/S_ayw转染子)递呈的未确定决定簇的亚型特异性反应(图5B，组3)。这显示HBsAg的天然变体能够通过交叉反应性T细胞免疫的致敏而“打破耐受”。

对于特异性CD8⁺T细胞群是否存在于已经用pCI/S_adw2免疫的转基因小鼠的产生抗原的肝脏中开展了研究。在已经用pCI/S_adw2免疫的HBs-tg B6小鼠的脾脏和肝脏NMC中，特异性CD8⁺T细胞反应性可以存在数月的时间阶段(图6)。因此，与过继转移的CD8⁺T细胞(图2)相比，疫苗致敏的抗HBV特异性CD8⁺T细胞已经进入和表现出稳定吸引进入生产抗原的靶器官中达至少3个月。

实施例5：表现出对HBsAg表位1具有特异性CD8⁺T细胞反应性的已免疫HBs-tg小鼠肝脏的组织学

HBsAg特异性CD8⁺T细胞在产生HBsAg的肝脏中诱导炎性反应。未处理的B6小鼠表现出正常肝脏组织学(图7A，B)。来自HBs-tg B6小鼠的肝细胞增大并且表现精细颗粒、浅色嗜酸性胞质，这是在人HBV感染病例中观察到的“毛玻璃肝细胞”的特征(图7C，D)。没有观察到炎性细胞浸润。

已经用pCI/S_adw2(而非pCI/S_ayw)DNA疫苗免疫的HBs-tg小鼠表现出严重的肝脏组织病理学(图7E)。在实质(图7F)和门管周(图7G)区发现的炎性细胞浸润主要由单核细胞组成(图7F)。大量小的淋巴样细胞分布于实质和门管周区。局部化的炎性细胞群围绕着凋亡肝细胞(图7H)。与未处理HBs-tg小鼠相比，免疫的HBs-tg小鼠肝细胞的增大和水肿更甚。一些小的细胞核表现出浓缩的染色质和核周晕(图7F，箭头)，这表明处于凋亡早期。此外，可观察到多数Councilman小体、正在凋亡的肝细胞(图7H，箭头)。一些肝细胞出现核液泡化(图7，箭头)。没有出现明显的胆汁郁积。

实施例6：HBs-tg小鼠中HBsAg特异性CD8⁺T细胞的致敏与抗原血症的降低相关

未处理HBs-tg小鼠表现出30-50ng/ml的HBsAg血清水平(图8A)。在HBsAg_adw2免疫后发展出对表位1具有交叉反应性的CD⁺T细胞的小鼠表现出降低的抗原血症(抗原水平范围为5-15ng/ml)，而在HBsAg_ayw免疫后未发展出任何HBsAg特异性CD8⁺T细胞免疫的动物中抗原血症水平没有变化(图8A)。因此，在免疫的转基因小鼠中抗原血症的部分控制与特异性CD8⁺T细胞的出现相关。

实施例7：在已经使用HBsAg_adw2免疫的HBs-tg小鼠中出现了抗HBsAg血清抗体

除了T细胞免疫以外，抗HBsAg体液免疫在监测抗原血症中也起着作用。在疫苗免疫的正常和转基因小鼠中观察到抗HBsAg血清抗体的存在。用pCL/S_ayw或pCL/S_adw2DNA疫苗免疫正常(非转基因)B6小鼠和同系基因HBs-tg B6小鼠两次。在最后一次免疫2周后，使用能够确定HBsAg不同亚型的ImxAUSAB测试(Abbott)确定对HBsAg特异性的血清抗体滴度。在已经用pCL/S_ayw或pCL/S_adw2质粒DNA免疫的非转基因小鼠中发展出高水平的抗HBsAg血清抗体，而HBs-tg小鼠仅在用pCL/S_adw2(而非pCL/S_ayw)质粒DNA免疫后表现出抗HBsAg的血清抗体反应(图8B)。在用HBsAg_ayw或HBsAg_adw2颗粒免疫的小鼠中观察到相似的抗体反应(数据未显示)。亚型特异性ELISA(使用HBsAg_ayw或HBsAg_adw2颗粒包被的板)表明：在正常小鼠中，由所有疫苗产生的＞95％的抗体反应是针对HBsAg“a”决定簇的；在HBs-tg小鼠中，＞90％的抗体反应是针对adw2特异性决定簇的(数据未显示)。

实施例8：在用HBsAg蛋白质颗粒免疫的HBs-tg B6小鼠中针对HBsAg表位1的交叉反应性K^b限制性CD8⁺T细胞反应的有效致敏

使用亚型ayw或者adw2的HBsAg蛋白质颗粒免疫正常B6小鼠导致针对K^b结合表位1(S_208-215)的CD8⁺T细胞介导的免疫反应(图9A)。因此可以看出，不论疫苗的性质如何(蛋白质颗粒或者DNA)，具有不同序列的表位能够引发交叉反应性T细胞反应。与使用DNA疫苗免疫(图5)相类似，使用亚型ayw的HBsAg蛋白质颗粒接种B6小鼠引发了针对HBsAg K^b限制性表位2(S_190-197)的CD8⁺T细胞反应，而使用亚型adw2的HBsAg蛋白质颗粒接种则不能引发这种反应(图9A)。

使用相当于亚型ayw或者亚型adw2的HBsAg蛋白质颗粒疫苗免疫HBs_ayw-tg小鼠。用HBsAg_ayw蛋白质疫苗重复免疫后没有产生CD8⁺T细胞反应，而用异源HBsAg_ayw蛋白质抗原免疫则产生了针对表位1的HBsAg特异性CD8⁺T细胞反应(图9B)。因此，表明HBsAg的天然变体能够通过交叉反应性T细胞反应的引发和通过蛋白质亚单位接种打破存在的耐受。

实施例9：在用HBsAg天然变体混合物免疫的HBs-tg B6小鼠中针对HBsAg表位1的交叉反应性K^b限制性CD8⁺T细胞反应的有效致敏

使用编码三种HBsAg亚型ayw(pCI/S_ayw)、adw2(pCI/S_adw2)和adr(pCI/S_adr)的DNA疫苗(图10A)以及含有亚型ayw、adw2和adr混合物的HBsAg蛋白质颗粒(图10B)免疫HBs_ayw-tg小鼠。在用DNA和蛋白质颗粒免疫后，HBsAg天然变体混合物均引发了针对表位1的交叉反应性K^b限制性CD⁺T细胞反应。

实施例10：在用HBsAg天然变体混合物免疫之后，HBs-tg小鼠中抗原血症降低

在未处理HBs-tg小鼠中，观察到30-50ng/ml的血清抗原水平。在用异源性HBsAg疫苗(HBsAg_adw2)或者天然HBsAg变体混合物(HBsAg_ayw+HBsAg_adw2+HBsAg_adr)免疫之后发展出针对表位1的交叉反应性CD8⁺T细胞反应的动物中，抗原血症降低了(HBsAg水平为5-17ng/ml)。在单独用同源性HBsAg_ayw免疫并且因此不能够产生HBsAg特异性T细胞免疫的动物中，血清抗原数量没有变化。使用HBsAg天然变体的混合物免疫相应地导致抗原血症降低。

实施例11：用HBsAg天然变体的混合物免疫之后，HBs-tg小鼠中抗HBsAg血清抗体的诱导

在用HBsAg_ayw、HBsAg_adw2、HBsAg_adr以及三种亚型的混合物免疫之后，正常B6小鼠出现明显的抗体反应(未显示)。

研究了免疫之后HBs-tg小鼠中HBsAg特异性血清抗体的形成。HBs-tg小鼠仅在用天然HBsAg变体混合物或者用异源亚型adw2免疫之后才出现血清抗体反应。在用同源性亚型ayw免疫之后没有诱导抗HBsAg反应。亚型特异性ELISA(使用HBsAg_ayw和HBsAg_adw2蛋白质颗粒包被的微量滴定板)表明在HBs-tg小鼠中＞90％的HBsAg特异性抗体反应针对adw2特异性决定簇(数据未显示)。

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                            序列表

<110>莱因新生物技术工艺和产品有限公司

<120>预防/治疗HBV感染和HBV介导疾病的组合物

<130>PCT-2069HVTF

<140>

<141>

<150>DE10339927.5

<151>2003-08-29

<160>7

<170>PatentIn版本2.1

<210>1

<211>226

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型adw2/基因型A的HBsAg多肽

<400>1

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

  1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

             20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

         35                  40                  45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

     50                  55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

 65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val

                 85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145                 150                 155                 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

        195                 200                 205

Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile

225

<210>2

<211>226

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型ayw/基因型D的HBsAg多肽

<400>2

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

  1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

             20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys

         35                  40                  45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

     50                  55                  60

Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

 65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val

                 85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys

145                 150                 155                 160

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

        195                 200                 205

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile

225

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型adw2HBsAg表位190-197

<400>3

Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met

  1               5

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型ayw HBsAg表位190-197

<400>4

Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met

  1               5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型adw2HBsAg表位208-215

<400>5

Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu

  1               5

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型ayw HBsAg表位208-215

<400>6

Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu

  1               5

<210>7

<211>225

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<220>

<223>HBV亚型adr/基因型C的HBsAg多肽

<400>7

Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

  1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

             20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Ala Cys

         35                  40                  45

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Leu Thr Ser

     50                  55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

 65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Thr Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val

                 85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

            100                 105                 110

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145                 150                 155                 160

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

        195                 200                 205

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile

225