一种含苯丙素苷成分的注射剂及其制备方法和用途

摘要

一种含苯丙素苷成分的注射剂及其制备方法和用途，属于医药领域，具体地说涉及以单一植物独一味为原料提取、分离得到的含苯丙素苷类为主要活性成分制成的注射剂。它是由唇形科植物独一味提取、分离得到的提取物添加注射用的水溶性药用辅料，制成溶液型注射剂或注射用灭菌粉剂，溶液型注射剂每毫升含苯丙素苷类活性成分10～20毫克；注射用灭菌粉剂每瓶含苯丙素苷类活性成分20～40毫克。本发明具有疗效高，适合用于外科手术后的刀口疼痛、出血等急症，适合于工业化批量生产，产品质量可控等优点。

说明书

所属技术领域

本发明属于医药领域，具体地说涉及以单一植物独一味为原料提取、分离得到的含苯丙素苷类为主要活性成分制成的注射剂。本发明还涉及该注射剂的制备方法及用途。

背景技术

独一味是唇形科植物独一味Lamiophlomis ratata(Benth.)Kudo的干燥全草。用于跌打损伤，外伤出血。它具有活血止痛，化瘀止血的功能，用于多种外科手术后的刀口疼痛。出血、外科骨折、筋骨扭伤，风湿痹痛以及崩漏、痛经、牙龈肿痛、出血等。常用剂量为2～3g生药。

收载于中国药典2000年版一部的独一味片剂和独一味胶囊剂，它是由单一植物独一味的全草或根直接加工制得的口服制剂，中国专利申请号02134169.9专利公开了一种独一味的分散片，但这三种制剂都是用采用独一味的水提物制得的，它存在服用量大的缺点，一般需要口服一次3粒，每粒300mg，一日三次，相当于9g生药。中国专利申请号200410070710.8专利公开了一种独一味的注射剂，它是直接从独一味植物用乙醇提制得，其提取物的成分复杂的部位，而不是用独一味的有效部位，更不是有效成分。因此这样制成的注射水针成分复杂，因此前处理工艺较为复杂，也会导致成品的稳定性不好。

目前尚无独一味粉针剂剂型，而在实际应用中注射水针对贮藏条件有特殊要求，温度、氧和光对其质量的稳定均有较大影响，在我国北方及寒冷地区易冻结，给使用带来不便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从独一味植物提取分离出有效成分制成注射剂，可用于制备止痛止血的药物，并提供其注射剂的制备方法，以便临床用于急症。

本发明的技术方案是：采用唇形科植物独一味提取、分离得到的一种含苯丙素苷类成分的提取物，取提取物添加注射用的水溶性药用辅料，制成溶液型注射剂或注射用灭菌粉剂，溶液型注射剂每毫升含苯丙素苷类活性成分10～20毫克；注射用灭菌粉剂每瓶含苯丙素苷类活性成分20～40毫克。

本发明所说的苯丙素苷类成分物质，具体是指主要含pedicularioside A，和lamiophlomioside A二个化合物。从而可以用这两种物质作为对照品，来对产品作定性和定量鉴别。对照品pedicularioside A，和lamiophlomioside A的制备概述如下：

用下述实施例3得到的提取物，在C18制备型高效液相上反复上柱，以30％的甲醇水溶液洗脱，依次收集含量最高的两个物质，分别测定这两个物质的光谱数据，物质一的光谱数据与Phytochemistry，1991，30：3745-3747文献上报道的pedicularioside A数据完全一致；物质二的光谱数据与药学学报，1995，30(3)：206-210文献中lamiophlomioside A数据完全一致，从而得以证实这两个物质的化学结构式分别见附图1、附图2。以下用这两个物质作对照品。

测定产品中苯丙素苷类活性成分的定性定量方法为高效液相法：以对照品制作工作曲线，待测物与对照品在同一保留时间处出峰，记录其峰面积，由工作曲线计算含量。从而苯丙素苷类成分得以定性和定量鉴别。

pedicularioside A含量的测定：

对照品溶液的制备取经五氧化二磷干燥过夜的pedicularioside A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取供试品150mg，精密称定，置25ml量瓶中，摇匀，滤过，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

lamiophlomioside A含量测定：

对照品溶液的制备取经五氧化二磷干燥过夜的lamiophlomioside A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取供试品150mg，精密称定，置25ml量瓶中，摇匀，滤过，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

pediculariosideA和lamiophlomioside A的含量总和即为该供试品中苯丙素苷类成分的含量。

为了保证本发明所提供的注射剂的质量，产品中添加了注射用的水溶性药用辅料可以是由抗氧化剂和等渗剂组成的；药用辅料用量为注射剂总苯丙素苷类成分的总量的1～10％，抗氧化剂的量为药用辅料量的15～40％。制药工业中可用的水溶性药用辅料很多，本发明所用的抗氧化剂以抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种的混合物为佳；所用的等渗剂以低分子右旋糖酐、葡萄糖、乳糖、甘露醇、氯化钠、磷酸盐中的一种或两种以上的混合物为佳。

本发明提供的含苯丙素苷类成分的注射剂的制备方法是采用以下步骤进行：

(1)提取：采用唇形科植物独一味为原料，经制药工艺通用的水提取乙醇沉淀法或乙醇提取水沉淀法或乙醇渗漉提取法得到的提取液；

(2)分离：将上述(1)步骤所得的提取液通过大孔树脂吸附，待提取液全部通过树脂柱后，用水或低于20％的乙醇溶液冲洗树脂柱，至洗脱液近无色为止，续以30～80％乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液；回收乙醇后的溶液，经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附，以10～95％乙醇溶液梯度洗脱，收集30～95％乙醇溶液的洗脱液，回收乙醇后的溶液，再经粒度为80-200目的硅胶柱吸附，以10～95％乙酸乙酯的甲醇溶液梯度洗脱，收集10～80％乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液，回收溶剂后干燥即得苯丙素苷类活性成分的提取物，测定苯丙素苷类活性成分的含量；

(3)制剂的制备：取苯丙素苷类活性成分的提取物，加入注射用水充分溶解后，过滤，滤液经活性炭脱色，得澄明溶液；加适量的水溶性药用辅料于澄明溶液中，药用辅料的用量为苯丙素苷类活性成分总量的1～10％，溶液经无菌超滤，得澄明药液：

a、所得澄明溶液补充注射用水，调整1ml溶液中含苯丙素苷类活性成分的含量为10～20mg，用垂熔玻璃漏斗或微孔滤膜滤过，灌装于安瓿中，灭菌，物理降温，经检验合格包装即得本发明之溶液型注射剂；

或b、所得澄明溶液经喷雾干燥，密闭冷却后，无菌分装，分装量是每瓶含苯丙素苷类活性成分20～40mg，轧盖，经检验合格包装即得注射用灭菌粉剂；

或c、所得澄明溶液补充注射用水，调整1ml溶液中含苯丙素苷类活性成分的含量为10～20mg，无菌灌装于安瓿中，每支2ml，经冷冻干燥，轧盖，经检验合格后，包装即得注射用冻干灭菌粉针剂。

对于本发明所述的注射剂，具体优选如下制备方法：

步骤(1)提取：a.水提取乙醇沉淀法，是称取药材粗粉，混合均匀，加水煎煮2次，合并各次水煎液，浓缩至相对密度在24℃时测1.02～1.12，加乙醇调节醇浓度到30～70％，静置，待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相对密度在24℃时测1.02～1.12，备用；

b.乙醇提取水沉淀法是称取药材粗粉，加40～90％乙醇回流提取，回收乙醇，药液浓缩至相对密度在24℃时测1.02～1.12，加2～4倍量水混合搅拌均匀，静置，待沉淀完全后，倾出上清液，药液浓缩至相对密度在24℃时测1.02～1.12，备用；

C.乙醇渗漉提取法是称取独一味药材粗粉，加40～90％乙醇浸泡后，进行渗滤，收集渗漉液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度在24℃时测1.02～1.12，加2～4倍量水混合搅拌均匀，静置，待沉淀完全后，倾出上清液，药液浓缩至相对密度在24℃时测1.02～1.12，备用；

步骤(2)分离：

a.将上述(1)提取得到的药液通过大孔树脂吸附，待滤液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至水洗脱液近无色为止，续以30～80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收溶剂后即得浓缩液；大孔树脂可以采用非极性或弱极性树脂，如HPD-100、WLD、AB-8等；

b.将上述a所得的浓缩液通过聚酰胺吸附，以10％乙醇梯度变化到95％洗脱，收集30～95％乙醇部位，浓缩后的洗脱液，经粒度为80-200目的硅胶柱吸附，以10～95％甲醇的乙酸乙酯溶液梯度洗脱，收集10～80％甲醇的乙酸乙酯溶液的洗脱液，回收溶剂后干燥即得苯丙素苷类活性成分的提取物；

干燥的方法可用常规的方法如烘干法，减压干燥，喷雾干燥法或冷冻干燥法。以喷雾干燥和冷冻干燥法为佳，苯丙素苷类活性成分不易分解转化。

步骤(3)制剂的制备：水溶性药用辅料的用量可以为苯丙素苷类活性成分总量的1～10％，优选为5～10％，水溶性药用辅料是由抗氧化剂和其他辅料组成的；抗氧化剂为抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种的混合物，其用量为辅料用量的15～40％，其他辅料为低分子右旋糖酐、葡萄糖、乳糖、甘露醇、氯化钠、磷酸盐中的一种或两种以上成分。

本发明所提供的注射剂的用途，是制备止痛、止血的药物。尤其是用于制备治疗外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折等各种疼痛与出血等病的药物。

在中国药学杂志，1995，30(5)：269公开了苯丙素苷类物质具有抗肿瘤的作用，在第二军医大学学报，2004，25(8)：920又报道了苯丙素苷类物质具有抗血小板聚集等用途，但未见有报道苯丙素苷类物质有止痛止血的作用。

下面通过药效实验证明本发明所提供的含苯丙素苷类活性成分注射剂用于制备止痛、止血的药物的用途，因而更适用于治疗外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折疼痛与出血急诊用药。

一.镇痛实验：

1材料

1.1动物：Wistar大鼠，体重200-250g。

1.2主要药品和试剂：杜冷丁为药用；“独一味水提物”为自制，是用独一味药材以8倍量水煎煮三次，每次1.5小时，所得溶液浓缩到相当于2g生药/ml的浓度。

试验组样品：

试验组1是苯丙素苷类溶液型注射剂为下述实施例A所制得的样品，每ml相当于25g独一味药材。

试验组2是苯丙素苷类粉针剂为下述实施例B所制得的样品，每mg相当于25g独一味药材。

试验组3是苯丙素苷类冻干粉针剂为下述实施例C所制得的样品，每mg相当于25g独一味药材。

2.实验方法

动物随机分成6组，每组12只。正常组以生理盐水给药；独一味水提物组以相当于2g生药/ml的独一味药材水煎液给药，三组试验组的给药剂量相同，都是0.6g生药/kg。

2.1小鼠醋酸扭体法：

连续尾静脉注射给药3天，末次给药后30分钟，腹腔注射0.6％醋酸0.1ml/只，观察10分钟内引起的扭体次数。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验，并在SPSS统计软件下进行计算。

2.2  热板法：

各组按剂量连续尾静脉注射给药7天，使用热板法，分别测定末次给药的小鼠痛阈值。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验，并在SPSS统计软件下进行计算。

3结果：表1扭体实验测定不同提取物对大鼠的镇痛作用(X±SD)

  组别    剂量(g/kg)  动物数  扭体次数P  正常对照    12  42.33±9.3  杜冷丁    0.5    12  10.5±3.8＜0.01  独一味水提物    1.2    12  29.8±8.8＞0.05  试验组1    0.6    12  26.12±5.2＜0.01  试验组2    0.6    12  25.14±7.1＜0.01  试验组3    0.6    12  23.52±4.9＜0.01

表2热板法测定不同提取物对大鼠的镇痛作用(X±SD)

  组别  剂量(g/kg)  动物数  添足时间(S)P  空白对照    12  15.4±8.6  杜冷丁    0.5    12  35.9±15.2＜0.01  独一味水提物    1.2    12  21.8±12.9＜0.01  试验组1    0.6    12  23.5±8.4＜0.05  试验组2    0.6    12  25.4±10.6＜0.05  试验组3    0.6    12  28.6±11.2＜0.05

结果显示试验组可减少小鼠的扭体反应次数，有镇痛作用，与正常相比有明显差异。

二、止血实验

1材料

1.1动物：Wistar大鼠，体重200-250g。

1.2主要药品和试剂及试验样品同镇痛试验。

2实验方法

2.1剪尾法：

连续尾静脉注射给药7天，末次给药后固定，测定鼠尾长度并标记，30-40min后分别将小鼠尾尖3mm处横断，待血液自行溢出开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴，直至血液自然停止，计算出血时间。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验，并在SPSS统计软件下进行计算。

2.2玻片法

尾静脉注射给药3天，末次给药后30分钟，于载玻片两端各滴一滴小鼠眼球血液，立即用秒表计时，每隔30秒观察是否有血丝产生，记录凝血时间，取其平均值。各组数据处理采用两样本均数比较的t检验，并在SPSS统计软件下进行计算。

3结果

表3不同提取物对正常大鼠出血时间的影响(X±SD)

组别    剂量(g/kg)  动物数  凝血时间(S)    P空白对照    12  135.83±19.77独一味水提物    1.2    12  85.6±20.8    ＜0.01试验组1    0.6    12  78.4±12.3    ＜0.01试验组2    0.6    12  75.5±11.2    ＜0.01试验组3    0.6    12  72.6±10.8    ＜0.01

表4不同提取物对正常大鼠凝血时间的影响(X±SD)

组别  剂量(g/kg)  动物数  凝血时间(S)    P空白对照    12  135.83±19.77独一味水提物    1.2    12  102.50±8.29    ＜0.01试验组1    0.6    12  95.8±6.30    ＜0.01试验组2    0.6    12  89.42±14.13    ＜0.01试验组3    0.6    12  75.42±24.19    ＜0.01

结果表明试验组止血效果较好，明显缩短大鼠的凝血时间，与空白组对照差异明显。

由药效试验证明本发明提供的注射剂可用于制备止痛、止血药物。

本发明的有益效果是：

1.将从药材独一味的粗提物进一步分离提纯到有效部位，使制备中药注射剂方便可行；2.提高了药物疗效，特别适合用于外科手术后的刀口疼痛、出血，以及外伤骨折等各种疼痛伴随出血等急症；3.制备方法适合于工业化批量生产；4.产品重量可控；5注射用灭菌粉针剂易储存，运输方便，更适合寒冷地区使用，不会出现象水针遇到寒冷的冻结现象。

附图说明

附图1是对照品pedicularioside A的结构式

附图2是对照品lamiophlomioside A的结构式

附图3是本发明实施例1所得提取物的HPLC图谱。图中A是pedicularioside A化合物的峰，B是lamiophlomioside A化合物的峰，C是木犀草甘的峰。

下面结合实施例进一步阐述本发明的方案

具体实施方式：

实施例1、称取独一味药材粗粉10kg，加水100kg煎煮2小时，药渣再加水100kg煎煮2小时，合并水煎液，浓缩至相对密度约1.09，加乙醇调节醇浓度到70％，静置。待沉淀完全后，取上清液过滤，并浓缩至相对密度约1.08。将此浓缩液过WLD大孔树脂，待浓缩液全部通过树脂柱后，用20％乙醇冲洗树脂柱，至洗脱液近无色为止，续以80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，经粒度为120-200目的聚酰胺柱吸附，以30％乙醇梯度变化到85％洗脱，收集40～80％乙醇的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，再经粒度为80-100目的硅胶柱吸附，以30％乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到85％洗脱，收集40～80％乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.06，喷雾干燥即得到提取物0.8kg。用高效液相色谱法测定苯丙素苷类成分的含量为61％，其HPLC图谱见附图3。

实施例2：

称取独一味药材的粗粉10kg，加40％乙醇80kg回流提取3次，合并醇提液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.02，加适量水混合搅拌均匀，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相对密度约1.04。将此浓缩液过HPD-450大孔树脂，待浓缩液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至洗脱液近无色为止，续以40％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附，以30％乙醇梯度变化到85％洗脱，收集40～85％乙醇的洗脱液，减压回收乙醇后的溶液，再经粒度为80-100目的硅胶柱吸附，以30％乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到85％洗脱，收集40～80％乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.06，喷雾干燥即得到提取物0.5kg。测定苯丙素苷类成分的含量为82％。

实施例3：

称取独一味药材的粗粉10kg，加80％乙醇100kg回流提取3次，合并醇提液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.08，加适量水混合搅拌均匀，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相对密度约1.08。将此浓缩液过HPD-100大孔树脂，待浓缩液全部通过树脂柱后，用20％乙醇冲洗树脂柱，至洗脱液近无色为止，续以80％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，经粒度为120-200目的聚酰胺柱吸附，以30％乙醇梯度变化到95％洗脱，收集40～80％乙醇的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，再经粒度为120-200目的硅柱吸附，以30％乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到95％洗脱，收集40～80％乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.08，喷雾干燥即得到含93％苯丙素苷类成分的提取物0.40kg。

实施例4：

称取独一味药材的粗粉10kg，混合均匀，加50％乙醇浸泡后，以5ml/分钟的速度进行渗滤，收集渗漉液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.08，加适量水混合搅拌均匀，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相对密度1.08。将此浓缩液过AB-8大孔树脂，待浓缩液全部通过树脂柱后，用20％乙醇冲洗树脂柱，至洗脱液近无色为止，续以70％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，经粒度为100-200目的聚酰胺柱吸附，以30％乙醇梯度变化到95％洗脱，收集40～80％乙醇的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，再经粒度为100-200目的硅胶柱吸附，以30％乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到95％洗脱，收集40～80％乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液，回收溶剂后浓缩至相对密度1.06，喷雾干燥即得到含64％苯丙素苷类成分的提取物0.7kg。

实施例5：

称取独一味药材的粗粉10Kg，混合均匀，加70％乙醇浸泡后，以3ml/分钟的速度进行渗滤，收集渗漉液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.1，加适量水混合搅拌均匀，静置。待沉淀完全后，倾出上清液，过滤，药液浓缩至相对密度1.06。将此浓缩液过HPD-100大孔树脂，待浓缩液全部通过树脂柱后，用水冲洗树脂柱，至洗脱液近无色为止，续以40％乙醇对树脂柱上吸附的物质进行洗脱，收集乙醇洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，经粒度为80-200目的聚酰胺柱吸附，以30％乙酸乙酯的甲醇溶液梯度变化到95％洗脱，收集40～85％乙酸乙酯的甲醇溶液的洗脱液。减压回收乙醇后的溶液，再经粒度为80-200目的硅胶柱吸附，以30％乙醇梯度变化到95％洗脱，收集40～85％乙醇的洗脱液。回收溶剂后浓缩至相对密度1.05，喷雾干燥即得到含84％苯丙素苷类成分的提取物0.50kg。

下面用上述实施例3制得的活性提取物制备各种注射剂：

实施例A、溶液型注射剂：

取所述的含有的苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末108g，加蒸馏水3000ml，加入抗坏血酸2g，再加入低分子右旋糖酐3g，在搅拌下调pH为6～7，放置2小时，过滤。滤液加活性炭0.1％，煮沸10分钟，过滤，加入注射用水至5000ml，用垂熔玻璃漏斗或0.22μm微孔滤膜滤过，灌装于安瓿中，灭菌，物理降温，即得。规格：每支2ml，含苯丙素苷类成分40mg。

实施例B、粉针剂：

取所述的含有的苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末108g，加入半胱氨酸、葡萄糖和氯化钠共10g，加蒸馏水5000ml，在40～60℃条件以蒸馏水充分溶解，调节pH为6.5～7.0，溶液经无菌超滤，得澄明药液，喷雾干燥，密闭24小时，冷却即得所需粉针剂原料，无菌分装于西林瓶中，轧盖，经检验合格后，包装即得成品。规格：每瓶含苯丙素苷类成分40mg。

实施例C、冻干粉针：

取所述的含有的苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末108g，加入谷胱甘肽2g，再加入低分子右旋糖酐和氯化钠共5g，加注射用水1000ml，搅拌使溶解，加热煮沸15分钟，放冷，冷藏24小时，超滤，收集超滤液，用10％NaOH调PH值为6.0～7.0，加注射用水补足体积至5000ml，除菌滤过，灌至10ml的西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥，压铝塑组合盖，检验，包装即得。规格：每支含苯丙素苷类成分40mg。

实施例D、溶液型注射剂：

取所述的含有的苯丙素苷类成分的提取物干燥粉末55g，加蒸馏水3000ml，加入抗坏血酸2g，再加入低分子右旋糖酐3g，在搅拌下调pH为6～7，放置2小时，过滤。滤液加活性炭0.1％，煮沸10分钟，过滤，加入注射用水至5000ml，用垂熔玻璃漏斗或0.22μm微孔滤膜滤过，灌装于安瓿中，灭菌，物理降温，即得。规格：每支2ml，含苯丙素苷类成分20mg。