小麦低分子量麦谷蛋白亚基的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法

摘要

本发明公开了一种小麦麦谷蛋白亚基低分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，该方法对常用的蛋白凝胶电泳方法的基础上进行改进，去除了小麦高、低分子量麦谷蛋白中醇溶蛋白对分离效果的干扰，并且样品缓冲液中不使用有臭味的β巯基乙醇；丙烯酰胺凝胶分离胶使用交连度为2.6％的10％丙烯酰胺凝胶，降低分子筛孔度，一步同时分离高、低分子量亚基，达到了更好的分离效果；电极缓冲液采用0.4M甘氨酸，增大了缓冲液电泳的离子效应，配合凝胶清晰的分离出低分子量麦谷蛋白亚基；使用清水脱色即可，节约药品成本。该方法简单，高效，能够清晰的单向一步分离低分子量麦谷蛋白亚基。

说明书

                        技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及小麦麦谷蛋白亚基的分离方法，特别涉及小麦低分子量麦谷蛋白亚基的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，。

                        技术背景

小麦麦谷蛋白亚基是小麦的一类重要的储藏蛋白。研究表明，亚基的组成对小麦面粉的加工品质和营养品质有重要影响，不同亚基和亚基组合对加工品质的影响或贡献大小不同。麦谷蛋白亚基按分子量大小分为高分子量谷蛋白亚基和低分子量谷蛋白亚基。两类亚基对品质的贡献，早先研究认为高分子量亚基的贡献较大。经过进一步研究认为低分子量亚基对品质，尤其是加工品质有相当贡献。对蛋白亚基的分离是研究亚基和亚基对品质作用的基础，也可利用麦谷蛋白亚基对小麦种质资源进行分类研究。

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，经过国内外研究者的创立和改良，目前是应用最为广泛的分离麦谷蛋白亚基的技术，在分离构成多采用β巯基乙醇来打破二硫键，解聚蛋白质。在我国，对麦谷蛋白亚基的研究多集中于对高分子量亚基的电泳分离和研究，主要原因之一在于低分子量麦谷蛋白亚基难以分离或分离不清。因此要进一步扩大我国在蛋白亚基、品质、品质育种等方面的成就，必须在研究高分子量麦谷蛋白亚基的同时，注意对低分子量谷蛋白亚基的研究，分析其对品质的影响和其与高分子量亚基之间的相互作用。这就意味着必须要改良现有凝胶电泳技术体系，建立一种简单，高效的能清晰分离低分子量谷蛋白亚基的凝胶电泳技术。

                        发明内容

本发明的目的在于，对常用的蛋白凝胶电泳方法的基础上进行改进，提供一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，该方法简单，高效，能够清晰的单向一步分离低分子量麦谷蛋白亚基。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

1.一种小麦麦谷蛋白亚基低分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

1)小麦麦谷蛋白亚基的提取与处理

首先将种子研压破碎成粉末；然后使用体积分数50％异丙醇，去除醇溶蛋白和沉淀蛋白后加入样品缓冲液50ul，该样品缓冲液含有24％甘油，8％十二烷基硫酸钠，0.012％溴酚兰的0.125MTris-Hcl，缓冲液的pH值为6.8，35℃～40℃水浴1h备用；

2)单向一步分离高、低分子量谷蛋白亚基电泳

A.采用电泳仪进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将交联度2.6％的10％pH8.8丙烯酰氨分离胶灌至胶板的4/5处，立即用蒸馏水或无水乙醇封顶，凝胶半小时以上；

B.弃去封顶水或无水乙醇，用4％交联度1.3％的PH为6.8的丙烯酰氨浓缩胶灌满胶板，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上；

C.用Tris-甘氨酸电极缓冲液，其中含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，pH值为8.3，在20mA恒压电泳11h-12h。

3)脱色

用G250考马斯亮兰染色3h，清水脱色24h，即可清晰分离出低分子量麦谷蛋白亚基。

本发明的方法，去除了小麦高、低分子量麦谷蛋白中醇溶蛋白对分离效果的干扰，并且样品缓冲液中不使用有臭味的β巯基乙醇；丙烯酰胺凝胶分离胶使用交连度为2.6％的10％丙烯酰胺凝胶，降低分子筛孔度，一步同时分离高、低分子量亚基，达到了更好的分离效果；电极缓冲液采用0.4M甘氨酸，增大了缓冲液电泳的离子效应，配合凝胶清晰的分离出低分子量麦谷蛋白亚基；使用清水脱色即可，节约药品成本。

                        附图说明

图1是采用本发明清晰分离的低分子量麦谷蛋白亚基图片。

                      具体实施方式

本发明参考了朱金宝和Morel等提出的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，并对其中部分作了调整和改进，其主要步骤是：

1.小麦麦谷蛋白亚基的提取

1)切取1/3种子放入1.5ml离心管，将其研压破碎成粉末。

2)在粉末中加入120ul体积分数50％异丙醇，60℃水浴30min，10000rpm离心10分钟，弃去上清，重复一次，去除醇溶蛋白对分离条带特别是D、B、C区的干扰。

3)加入160ul含0.3％二硫苏糖醇的50％异丙醇，60℃水浴30min。加入等体积含1.4％4-己烯基吡啶的50％异丙醇溶液，60℃水浴30min，10000rpm离心10分钟，小心移取200ul上清液于另一试管。

4)在试管中加入上清液4倍体积的丙酮，在35℃-40℃水浴30min，10000rpm离心10分钟，弃去上清。

5)加入含有24％甘油，8％十二烷基硫酸钠，0.012％溴酚兰的0.125MTris-Hcl样品缓冲液(PH6.8)50ul，35℃-40℃水浴1h备用。

2.单向一步分离高、低分子量谷蛋白亚基电泳

1)采用北京六一仪器厂生产的ECP三恒电泳仪进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将交联度2.6％的10％pH8.8丙烯酰氨分离胶灌至胶板的4/5处，立即用蒸馏水或无水乙醇封顶，凝胶半小时以上。

2)弃去封顶水或无水乙醇，用4％交联度1.3％的pH6.8丙烯酰氨浓缩胶灌满胶板，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上。

3)用Tris-甘氨酸电极缓冲液(含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，PH8.3)在20mA恒压电泳11-12h(指示线刚刚迁移出凝胶)。

3.脱色

用G250考马斯亮兰染色3h，清水脱色24h即可分离出低分子量麦谷蛋白亚基(如图1所示)。

本发明的方法与改进前的技术的不同之处参见下表：

  项目  现有技术  本发明  还原剂  β巯基乙醇(有臭味)  二硫苏糖醇  分离胶浓度  8％-12％  10％  分离胶交连度  1.3％  2.6％  电极缓冲液Gly-浓度  0.2M  0.4M  脱色液  甲醇、醋酸、蒸馏水  水  蛋白亚基分离效果  BC区条带聚集成片  BC区条带清晰