植物过氧化物歧化酶的快速测定、定位方法

摘要

本发明涉及从植物中鉴定植物过氧化物歧化酶及类过氧化物歧化酶的筛选、定量、组织含酶部位定位的方法，它是利用过氧化物歧化酶(SOD)及类过氧化物歧化酶(类SOD)强还原性，它能使大量可还原退色的物质退色，如使高锰酸钾水溶液还原褪色，使三价铁离子水溶液还原褪色及其他可还原褪色的物质褪色，而其退色速度随酶的活性增高呈正比例。将植物汁液滴加到高锰酸钾、三价铁离子及其他可还原褪色的物质中，而使植物过氧化物歧化酶及类似物得到确定、定量的测定，而将植物组织贴于含高锰酸钾等离子的载体上，即可对它们定位。

说明书

技术领域

本发明涉及从植物鉴定有效物质、定量、定位组织活性的方法，具体是植物过氧化物歧化酶及类过氧化物歧化酶的筛选、定量、组织含酶部位定位的方法。

背景技术

植物中普遍存在过氧化物歧化酶(SOD)及类似物(称类SOD)，有很强消除自由基功能，消除活性氧对细胞的强烈毒害，对抗衰老、抗老年痴呆有效，能够预防肿瘤，抗癌；然而测定过氧化物歧化酶及类过氧化物歧化酶极麻烦，需昂贵的仪器和条件，整个测定步骤多、流程长，至少需半天。一些文献记载过氧化物歧化酶的测定方法有：

1、【题名】槲寄生抗氧化物质的研究测定【作者】宰学明[1]龚祝南[2]等【机构】[1]南京师范大学生命科学学院，[2]南京大学生物科学技术系，【刊名】中草药.2001，32(12)。1081-1083，文章报道SOD活性测定采用Stewert和Bewley的NBT光抑制法；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用luis氧电极法，以每分钟的放氧量表示酶活性的大小；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚显色法，以单位时间内光密度的变化量表示；谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)参照LeopoldFlohe等的DTNB法测定，以每分钟吸光度变化值表示酶活性。抗氧化非酶物质的测定：VC含量的测定，参照易现峰等的方法。GSH含量的测定，参照Ellman的方法。以DTNB显色，在422nm处测吸光度值，用GSH作标准曲线计算GSH含量。绿原酸含量测定按胡景江等方法，类黄酮含量测定参照刑建民等方法。

2、中国专利<申请号>CN92107634.7<名称>超氧化物歧化酶活动的测定方法<申请(专利权)人>【地址】江苏省南京市新模范马路7号47栋406室<摘要>本发明公开了一种测定超氧化物歧化酶活力的方法，该方法属亚硝酸盐形成法，利用XO加XOD反应系统产生超氧阴离子自由基O₂，O₂氧化羟胺形成亚硝酸盐，通过显色剂显色。本发明的特征在于测试中将XO溶解于碱溶液中，羟胺溶解于弱酸中，并采用新的缓冲液p H值和新的显色剂配比。本发明与现有技术相比，测试液吸光度大且稳定，测试结果准确，测试速度快，灵敏度高，成本低。本发明可广泛适用于实验室及临床检验用。【主权项】一种超氧化物歧化酶活力测定方法，属于亚硝酸盐形成法，它利用黄嘌呤(XO)加黄嘌呤氧化酶(XOD)反应体系产生超氧阴离子自由基O，黄嘌呤氧化酶氧化羟胺形成亚硝酸盐，再添加显色剂(对氧基苯磺酸加N-甲萘基二胺基乙烯)使测试液呈紫红色，测试过程在磷酸缓冲液体系中进行，其特征在于：1.1磷酸缓冲液PH值为8.0，其中EDTA浓度为2×10^-5ml/l；1.2XO溶于碱性溶液中，充分溶解；1.3羟胺溶于弱酸中；1.4采用1.65mg/ml对氨基苯磺酸及0.75mg/ml N-甲萘基二氨基乙烯和20％冰醋酸混合液作显色剂。

3、中国专利<申请号>200420015686<发明名称>光化学扩增法光照仪<申请人>山东省生物信息工程技术研究中心、姚晓瑜<联系地址>山东省淄博市张店区张周路12号山东理工大学<权利要求>一种光化学扩增法光照仪，包括箱体和光源，其特征是：箱体内壁周边和底面设置镜面反射层；至少两个光源并列设置在箱体空腔内；在光源之间设置样品台。<摘要>一种光化学扩增法光照仪，适用于超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)光化学扩大测定使用的光化学分析的仪器。其包括箱体和光源，特征是箱体内壁周边和底面设置镜面反射层；至少两个光源并列设置在箱体空腔内；在光源之间设置样品台。国外仪器有类似产品，不仅价昂，且结构为一束光源，检测量小，一批次只能检测三个比色杯，造成组间误差和批次间误差大，重现性差。本实用新型的优点是：同一时间内大量比色杯在相同条件下比色，可以消除组间误差和批次间误差，重现性好，同时检测量大。

4、中国专利<申请号>200310109579<发明名称>一类茶树过氧化物歧化酶特异表达序列标签及其生物芯片<申请人>中国农业科学院茶叶研究所<联系地址>浙江省杭州市西湖区云栖路1号<摘要>本发明公开了一类茶树过氧化物歧化酶特异表达序列标签及其生物芯片。表达序列标签具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的序列；所示3条序列中的一条或数条的组合；每条序列的互补序列或同源序列；每条序列中8～100个连续核苷酸为探针的序列或其互补序列。运用表达序列标签技术对构建的茶树互补脱氧核糖核酸(c DNA)文库进行脱氧核糖核酸序列测定，获得的表达序列标签通过剔除冗余序列、互联网数据库进行检索、分类，富积非冗余序列，获得了3条茶树过氧化物歧化酶表达序列标签，本发明应用于作物种质资源的鉴定评价、作物杂种优势的早期预测、作物育种和新品种的产生与鉴定、植物抗逆性的研究、植物单核苷酸多态性(SNP)的检定、转基因农产品的安全性检测、新型除草剂和新型农药的筛选等。

5、中国专利<申请号>87101427<发明名称>人血铜锌超氧化物歧化酶彩色免疫测定板<申请人>中国人民解放军海军总医院<联系地址>北京市海淀区阜城路6号<权利要求>人血铜锌超氧化物歧化酶彩色免没测定板，是利用抗原抗体反应测定人血超氧化物歧化酶总含量的测定板，其特征在于使用纯化的人铜锌超氧化物歧化酶作为抗原制备的高效价抗血清和琼脂糠混合，铺在塑料板上制成。<摘要>人血铜锌超氧化物歧化酶彩色免疫测定板，是用于测定人血红细胞Cu、Zn-SOD总含量的专用测定板。该板用含有蛋白染料、指示剂和中性盐以及高效价抗人Cu、Zn-SOD血清的1％离子琼脂糖灌制而成。消除了血样品中血红蛋白对测定的干扰，省略了常规方法的繁琐步骤。采血量少，反应结果清晰，容易观察，方法简便，适于各医疗、科研单位使用。

6、中国专利<申请号>92107634<发明名称>超氧化物歧化酶活力的测定方法<申请人>季岳军、岳成斌<联系地址>江苏省南京市新模范马路7号47栋406室<摘要>本发明公开了一种测定超氧化物歧化酶活力的方法，该方法属亚硝酸盐形成法，利用XO加XOD反应系统产生超氧阴离子自由基O₂，O₂氧化羟胺形成亚硝酸盐，通过显色剂显色。本发明的特征在于测试中将XO溶解于碱溶液中，羟胺溶解于弱酸中，并采用新的缓冲液pH值和新的显色剂配比。本发明与现有技术相比，测试液吸光度大且稳定，测试结果准确，测试速度快，灵敏度高，成本低。

7、中国专利<申请号>200410050222<发明名称>利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法<申请人>陈欣<联系地址>辽宁省沈阳市沈河区祥顺小区金觉寺街60-1号6-1-1室<摘要>一种利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法，其特征是：将谷物籽粒进行筛选、消毒、清洗；将籽粒在温水中浸泡使其吸胀，在发芽槽中保温发芽；将发芽谷物研磨成粗浆，加入缓冲液；将粗浆加入纤维素酶并打成细浆，加入氯化钙；固液分层后，滤液压滤，滤液通过离心机离心，收集离心液；离心液过超滤膜，加入糖化酶，再通过中性超滤膜浓缩，使其达到所需要的SOD浓度；本发明的优点是超氧化物歧化酶，过氧化物酶和过氧化氢酶都能提取出来，产品杂蛋白少，酶的活力高，酶活力可控效果好，保质期长；一条基本工艺路线可以产生系列产品，工艺简单，自动化程度高，安全无污染，耗能少，成本低，效益高；五种谷物种子均可用此工艺生产。

上述文献提供了一些超氧化物歧化酶的测定方法，但上述的方法还存在一些不足之处，如一般反应步骤多如：<专利申请号>CN92107634.7利用XO加XOD反应系统产生超氧阴离子自由基O₂，O₂氧化羟胺形成亚硝酸盐，通过显色剂显色，再如槲寄生抗氧化物质的研究测定SOD活性测定采用Stewert和Bewley的NBT光抑制法；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用luis氧电极法，以每分钟的放氧量表示酶活性的大小；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚显色法，以单位时间内光密度的变化量表示；谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)参照Leopold Flohe等的DTNB法测定，以每分钟吸光度变化值表示酶活性。抗氧化非酶物质的测定：VC含量的测定，参照易现峰等的方法。GSH含量的测定，参照Ellman的方法。以DTNB显色，在422nm处测吸光度值，用GSH作标准曲线汁算GSH含量。绿原酸含量测定按胡景江等方法类黄酮含量测定。参照刑建民等方法其中的程序时间长，或制作繁复如：<申请号>87101427需将人的铜锌超氧化物歧化酶作提取纯化，设备多仪器昂贵如：<申请号>200420015686使用的光化学分析的仪器。其包括箱体和光源，箱体内壁周边和底面设置镜面反射层；至少两个光源并列设置在箱体空腔内，此外以往提出的方法均未涉及定位。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行，灵敏度极高，特别利于野外操作的过氧化物歧化酶类的测定方法，是对植物过氧化物歧化酶及类过氧化物歧化酶作筛选鉴定、定量、对组织含酶部位直观确定的快速方法。

本发明是这样实现的：

将高锰酸钾或三价铁离子水溶液按含量十万分之一到千分之一的浓度按梯度配制，分别移于几个试管中，然后按量将植物汁液分别滴入，定时，或准确计时，观察高锰酸钾液的紫红色或三价铁离子及其他可还原褪色的物质色泽褪去。或将高锰酸钾或三价铁离子按含量十万分之一到千分之一的某一浓度置于管中，按量将植物汁液分别滴入，准确计时或将反应前后光密度值差与退色时间计算，并作对照就能准确计量该酶类活性含量，再将植物组织贴于含高锰酸钾液或三价铁离子载体上，可见有色的载体板上，与植物组织相应的含酶位置色泽退去，就能定位出组织过氧化物歧化酶及类酶的位置。

具体方法：

将高锰酸钾配制成十万分之一到五千分之一的水溶液、三价铁离子配制成万分之一到五千分之一水溶液，按梯度分置试管中，将要筛选的植物挤出的汁液滴入，若有过氧化物歧化酶及类似物，高锰酸钾水溶液的紫红色或三价铁离子及其他可还原褪色的物质色泽褪去，其退色的速度随酶类的活性增高而加快，在相同时间观察各管，也可肉眼观察出活性高低。将退色时间准确计下，或将反应前后光密度值差与退色时间和空白对照作计算都可量度酶活性值。将植物组织切片贴于含高锰酸钾等的湿润载体上，可于呈色的载体板上观察到与植物组织相应的位置色泽退去，而达到定位组织过氧化物歧化酶及类酶的准确位置。

所述的承载高锰酸钾或铁离子水溶液的载体可以是聚乙烯粉，羧甲基纤维素粉、及任何惰性粉末制成，或用它们的胶制成带色羧甲基纤维素胶板、带色淀粉胶板、带色明胶板等而制成该酶类定位工具，这种工具同样可制成试剂盒。

本发明的原理是：植物体内含有过氧化物歧化酶及类过氧化物歧化酶，它们表现出极强的还原性，本发明利用过氧化物歧化酶及类过氧化物歧化酶使紫红色高锰酸钾水溶液，或三价铁离子溶液及其他可还原褪色的物质消色，而鉴别，定量定位植物所含的这类酶。本发明在于，克服以往对过氧化物歧化酶及过氧化物歧化酶类似物测定的耗时费工、费试剂、需昂贵仪器的不便、采用低浓度高锰酸钾水溶液，或三价铁离子水溶液之类便宜试剂，就能直观对过氧化物歧化酶定性、定量和组织含酶部位做确定。

与现有技术相比，本发明的突出的实质性特点和显著的进步是：

1、简单易行，试剂用量少、便宜、直观、准确、灵敏，特别利于野外操作，可对过氧化物歧化酶类定量，对组织含酶部位做确定，此方法的推行让该酶类筛选达高速度，做一个样只需几秒钟就能完成，有多快好省准之优点。

2、利用过氧化物歧化酶(SOD)及类过氧化物歧化酶(类SOD)强还原性，它能使大量可还原退色的物质退色，如使高锰酸钾水溶液还原褪色，使三价铁离子水溶液还原褪色及其他可还原褪色的物质褪色，而其退色速度随酶的活性增高呈正比例。将植物汁液滴加到高锰酸钾、三价铁离子及其他可还原褪色的物质中，而使植物过氧化物歧化酶及类似物得到确定、定量，而将植物组织切片贴于含高锰酸钾等的湿润载体上，可对它们定位。

3、与现有技术方法不同，本方法步骤少，用时短，无需昂贵仪器，且能定位，可广泛适用于实验室及临床检验用。

具体实施方式

实例1：

将5ml万分之一(质量含量)的高锰酸钾水溶液置试管中，以手提压汁机将新鲜芹菜叶挤压出汁，滴数滴入该试管，高锰酸钾在约30秒钟即已褪色，可知芹菜叶含过氧化物歧化酶类，此法以氮蓝唑(NBT)法做对照，约相当于600(NBT)单位。

实例2

将海巴戟嫩杆横切、然后将截面贴于有万之一(质量含量)高锰酸钾水溶液的100目聚乙烯粉板上、2分钟后可见板与海巴戟嫩杆相应的位置从中心到边上紫红色从深到浅至无，可见过氧化物歧化酶主要含在海巴戟嫩杆绿色边缘部分。将海巴戟嫩茎尖压汁，并将前后滴加汁液的高锰酸钾水溶液与已知标准比对就能算出它的活性相当于980(NBT)单位。

实例3

将较粗的新鲜火龙果嫩杆横切、然后将截面贴于有八千分之一(质量含量)高锰酸钾水溶液的80目羟甲基纤维板上、3分钟后可见板面与火龙果嫩杆相应的位置从中心到边上紫红色从深到浅至无，可见过氧化物歧化酶主要含在火龙果嫩杆绿色边缘部分。将前后滴加汁液的高锰酸钾水溶液用分光光度计比色并与标样对照就能算出它的活性。

实例4

将新鲜芦笋嫩杆横切、然后将截面立即贴于含有五千分之一硫酸铁的0.2mm淀粉胶湿板上，约2分钟可见板面与嫩杆相应的位置从中心到边上黄色从深到浅至无。