一种高产促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种高产促胰岛素激素毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌及其构建方法。本发明运用分子生物学技术先构建毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9GLP－1，然后将其线性化后转化进入毕赤酵母GS115中，从而获得能够高效分泌表达促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌，该工程菌的促胰岛素激素产量可达到100mg/L。同时，利用该高产工程菌生产的促胰岛素激素产品，其氨基酸序列不同于天然产品，且已被消除了胰蛋白酶切位点，因此不仅在体内不会被特异性的蛋白酶降解而能够长时间的保持活性，而且由于不会被胰蛋白酶降解，还可以制成口服制剂使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产促胰岛素激素毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)及其构建方法，属于分子生物领域。

背景技术

促胰岛素激素(GLP-1)的化学名称是胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1)，是一种通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用而使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增强的物质。研究证实GLP-1能刺激胰岛素分泌，且血糖越高GLP-1的作用越强；但如血糖浓度恢复至正常值时，GLP-1就不会再继续作用，因而不会产生低血糖现象；此外，GLP-1还同时减少胰岛细胞损伤，改善胰岛细胞结构，修复胰岛细胞功能，提高胰岛细胞活力并延长其寿命、抑制胰升糖素的释放、调控胰腺β细胞特异基因表达并通过这种基因调控改善葡萄糖运转和代谢，提高β细胞对葡萄糖的反应性以及降低食欲和抑制胃的排空等。因此目前GLP-1被认为是可用于从根本上治疗糖尿病的物质，对于糖尿病的治疗具有重要意义。

中国专利(CN1363654A)公开了一种以大肠杆菌为宿主细胞构建生产GLP-1的工程菌并用于液体发酵培养，产生和积累含有GLP-1(7-36)的包涵体，通过细胞破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白，再经过融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)的纯化得到产品。

国内有文献报道张志珍等人利用大肠杆菌来生产hGLP-1[中国生物化学与分子生物学报，2002，2，18(1)：5-8]。张志珍等人采用亚磷酸二酯法合成hGLP-1cDNA的6个寡核苷酸片段，拼接成完整的hGLP-1cDNA，构建重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株，高密度发酵培养，纯化得到GST融合蛋白。纯化后GST-rhGLP-1重组蛋白的含量为2.1g/L。

国外文献报道说，Egel-Mitani等人利用酿酒酵母(S.cerevisiae)生产短肽(包括)GLP-1、GLP-2、GRPP等，其中在野生型的酿酒酵母中GLP-1的发酵产量能达到34.3mg/L，(US6110703/Novo Nordisk/S，2000.08.29)。

发明内容

本发明的目的是提供一种毕赤酵母(Pichia pastoris)GLP-1高产工程菌株及其构建方法，以期利用该高产工程菌大规模地发酵生产促胰岛素激素(GLP-1)。

本发明是利用毕赤酵母真核表达系统来生产GLP-1，其表达产物蛋白不会产生高度抗原性，表达量极高并可分泌到胞外，在获得高产率的同时克服了用大肠杆菌表达系统生产GLP-1时所得产物不易纯化且容易产生免疫源性的缺点，以本发明菌株生产的产品特别适合医药治疗用途。

本发明GLP-1高产菌株经鉴定GLP-1产量可达到100mg/L，远远高于前述国外文献报道的利用酿酒酵母生产GLP-1。

目前国内外尚无构建毕赤酵母(Pichia pastoris)GLP-1工程菌的报道。

本发明目的通过以下技术方案实现：

1)构建毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9GLP-1：

根据毕赤酵母表达载体pPIC9质粒多克隆位点的序列特点，设计上游引物和下游引物；将克隆的GLP-1直接连入T-vector得到pMDGLP-1，用Smal I和Not I酶切得到GLP-1基因片段；质粒pPIC9用XhoI酶切后补平粘端；再用Not I酶切，回收大片段；将GLP-1基因片段与pPIC9大片段通过T4DNA连接酶连接，筛选阳性转化子从而完成毕赤酵母表达载体pPIC9GLP-1的构建。

2)构建毕赤酵母GLP-1生产菌株：

重组质粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之线性化，再以醋酸锂转化法转化毕赤酵母菌株GS115感受态细胞；在MD培养基上培养两天，挑取阳性转化子，获得毕赤酵母GLP-1生产菌株。

3)筛选毕赤酵母GLP-1高产菌株：

通过PCR、Southern杂交和Western blot等方法对转化子进行分子检测，确证GLP-1基因已整合到毕赤酵母基因组并正确表达；将各转化子细胞接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养40～48小时，250r/min，无菌条件下离心弃上清，换成BMMY液体培养基；在诱导过程中，每24小时加入适量甲醇使其终浓度维持在0.75％附近；培养60小时后离心收集各转化子的上清培养基；用Tricine SDS-PAGE蛋白质电泳和密度扫描法检测转化子的GLP-1的分泌表达产量，筛选出毕赤酵母GLP-1高产菌株。

在克隆GLP-1基因片段时，上下游引物选择以下方案：

上游引物cccgggcaaa agacattctg agggaac

下游引物gcggccgctta acggccatct acg

本发明的优点和特点在于：

a、本发明菌株GLP-1表达量极高并可分泌到胞外，易纯化。本发明是毕赤酵母真核表达系统，与原核表达系统不同，它可以进行一系列翻译后的修饰，且它可使用强效的醇氧化酶(AOX1)启动子，在甲醇诱导下实现外源基因的高效表达。

b、本发明菌株生产出的GLP-1在氨基酸序列上被消除了胰蛋白酶的酶切位点，不易被胰蛋白酶降解，制成口服制剂时不会出现失活的问题。一般的蛋白质类口服进入胃肠以后，大多数都会被胃蛋白酶和胰蛋白酶等酶类降解，本发明菌株生产的GLP-1通过点突变的方式在其基因序列上发生突变，最后在氨基酸序列上已消除胰蛋白酶的酶切位点。产品的这一特点对于糖尿病的患者来说是一种福音，尤其是对于I型糖尿病，因其治疗一直是依靠注射给药来不断补充胰岛素的，而长期注射药给病人带来了很多不便和痛苦。

c、本发明菌株生产出的GLP-1在体内存活时间较天然GLP-1长。天然的促胰岛素激素(GLP-1)在体内会很快被体内的特异性二肽酶IV(DPP IV)降解而失活，而本发明菌株生产的GLP-1已被巧妙地消除了促胰岛素激素内二肽酶IV(DPP IV)酶切位点，能确保产物在体内保持较长时间的功能活性，提高了对糖尿病的治疗效果。

d、本发明构建的GLP-1毕赤酵母工程菌的表达产物蛋白不会产生免疫源性，产品特别适合用于治疗用途。

附图说明

图1、本发明构建的菌株生产的GLP-1氨基酸序列与天然GLP-1氨基酸序列对比

图2、筛选高产促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌株的技术路线

具体实施方式

下面以实施例说明本发明，但并不限制本发明。

实施例1

1)构建毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9GLP-1：

根据pPIC9质粒多克隆位点的序列特点，选择上游引物cccgggcaaa agacattctg agggaac，下游引物gcggccgctta acggccatct acg；将克隆的GLP-1直接连入T-vector得到pMDGLP-1，用Smal I和Not I酶切得到GLP-1基因片段；质粒pPIC9用XhoI酶切，然后补平粘端，再用NotI酶切，回收大片段；将GLP-1基因片段与pPIC9大片段通过T4DNA连接酶连接，筛选阳性转化子。

20μLPCR反应体系

                10×Buffer            2.0

                上游primer            0.5

                下游primer            0.5

            dNTP                0.4

            Taq DNA聚合酶       0.7

            模板                0.3

            无菌双蒸水          15.6

            共                  20μL

反应程序    预变性94℃      10min

            变性94℃        55sec

            退火53℃        55sec    33个循环

            延伸72℃        30sec

            延伸72℃        5min

            4℃保温

2)构建毕赤酵母GLP-1生产菌株：

重组质粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之线性化，之后采用醋酸锂转化法转化毕赤酵母菌株GS115感受态细胞。在MD培养基上培养两天，挑取阳性转化子获得毕赤酵母GLP-1生产菌株。

3)筛选毕赤酵母GLP-1高产菌株：

通过PCR、Southern杂交和Western blot等方法对转化子进行分子检测，确证GLP-1基因已整合到基因组并正确表达；将各转化子毕赤酵母细胞接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养40～48小时，250r/min，无菌条件下离心弃上清，换成BMMY液体培养基。在诱导过程中，每24小时加入适量甲醇使其终浓度维持在0.75％附近。培养60小时后离心收集各转化子的上清培养基。用Tricine SDS-PAGE蛋白质电泳和密度扫描法来检测转化子的GLP-1的分泌表达产量，筛选出毕赤酵母GLP-1高产菌株。

实施例2

1)毕赤酵母的发酵培养

将各转化子毕赤酵母细胞接种于5ml BMGY液体培养基中，30℃振荡培养40～48小时，无菌条件下离心弃上清，换成10ml BMMY液体培养基。在诱导过程中，每24小时加入适量甲醇使其终浓度维持在大约0.75％。培养60小时后离心收集上清，不加甲醇诱导为空白对照。

BMGY and BMMY培养基的配方：

    1％yeast extract

    2％peptone

    100mM potassium phosphate，pH 6.0

    1.34％YNB

    4×10^-5％biotin

    1％glycerol or 0.5％methanol

2)目的蛋白的收集沉淀以及电泳检测

发酵液12000X离心10分钟，得到的上清液用硫酸铵或者1/10体积的100％TCA来沉淀蛋白质，然后采用Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳来确定目的蛋白的表达情况。

3)高产毕赤酵母工程菌株的鉴定

通过密度扫描法对电泳条带进行扫描分析，以确定各个阳性转化子的分泌表达量，筛选出毕赤酵母高产促胰岛素激素的工程菌株，所得该工程菌发酵生产GLP-1的产量可以达到100mg/L。