肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法

摘要

本发明涉及一种从肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，以生产肝素钠的副产物为原料，该原料是含有硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的混合物，原料通过乙醇分级沉淀，得到硫酸皮肤素粗品；然后采用亚硝酸盐或亚硝酸酯类化合物为氧化剂，使该粗品中含有的硫酸乙酰肝素被降解成高溶解度的低分子硫酸乙酰肝素，再通过乙醇分级沉淀分离得到高纯度的硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素。本发明解决了长期以来硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素以混合物形式存在而难以分离的问题，制得的高纯度硫酸皮肤素及低分子硫酸乙酰肝素可作为抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者肾脏保护的口服或注射用药物原料。

说明书

技术领域

本发明是关于从肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，属粘多糖生物制药领域。

背景技术

硫酸皮肤素是一种粘多糖，通常和其他粘多糖混合存在于动物组织中。硫酸皮肤素由(1-4)-艾杜糖醛酸-(1-3)-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-硫酸-β-D-半乳糖二糖基本单位组成，旋光-55～-63度，抗凝效价≤10USPu/mg，硫酸基与羧酸基比值为0.8～1.2。

纯的硫酸皮肤素抗凝效价低，激活肝素辅因子II活性较高，且无出血副作用，作为抗血栓药物具有很好的前景。

硫酸乙酰肝素是肝素的亚成分，存在于未分离的肝素中，称为快运动肝素，与慢运动肝素相比，硫酸乙酰肝素分子量较小，乙酰化程度高，硫酸基含量较少，抗凝血效价较低。低分子硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者肾脏保护，是近年来研究最热的粘多糖类生化药。

在肝素钠提纯过程中，硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素通常以混合物的形式作为副产物被收集。该副产物通常含有硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和少量的硫酸软骨素。硫酸软骨素易于除去，关键是硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素性质相似，采用通常的离子交换层析和有机溶剂分级沉淀方法难以将二者分离纯化；因此，目前在相关的抗血栓药品中，一般以二者未分离的混合物形态存在。例如市售的舒洛地特(Sulodexide)和(Mesoglycan)等药物中同时含有硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素二种成分。

由于硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素在抗栓、降血脂及糖尿病患者肾脏保护方面的显箸功效，人们对硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素分离提纯的研究从未间断。

硫酸皮肤素纯化研究最早可以追溯到1941年，Karl Meyer用猪皮经木瓜酶降解，在醋酸-醋酸钙缓冲液中以18％-25％乙醇分级沉淀，得到旋光度为-55～-63度的酸性粘多糖(当时命名为“硫酸软骨素B”，后证实它不是硫酸软骨素，而是硫酸皮肤素)。

70年代初，Lennart Roden等人(Method Enzy 73，140，1972)从猪皮提取的肝素粗品中采用季铵盐结合、解析，得到硫酸皮肤素粗品后，再通过以下两种方法纯化得到纯的硫酸皮肤素。一种方法是类似于早期的醋酸—醋酸钙乙醇分级沉淀的方法；另一种方法是使用本立德铜离子结合的方法，具体操作如下：1克硫酸皮肤素粗品溶解于100ml水中，加入10ml饱和氢氧化钠溶液，加入80ml本立德铜试剂，10分钟后离心收集沉淀，以含本立德试剂的碱性水溶液洗脱沉淀两次，以少量4M醋酸溶解沉淀，以氢氧化钠中和，对水透析脱盐、乙醇沉淀，得到高纯度硫酸皮肤素。

以上方法制备的硫酸皮肤素纯度高，但难以用于大规模工业生产。

1994年Nicola Volpi等人(Analy.Biochemi.218，382-391.1994)用丙酮梯度分级沉淀法处理粘多糖混合物纯化各种粘多糖。但该方法难以得到高纯度的粘多糖单一成份。

目前还没有一种适合工业化生产的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素提纯及分离的好方法，因此也没有纯硫酸皮肤素或纯低分子硫酸乙酰肝素产品问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种从肝素钠纯化过程中获取的副产物——硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素混合物中，分离出质量稳定的高纯度硫酸皮肤素并制得低分子硫酸乙酰肝素的方法，该法适合于大规模工业生产，生产成本合理。

本发明方法的原料是生产肝素钠的副产物，具体地说，是生产肝素钠过程中通过乙醇分级沉淀及离子交换层析分离纯化收集的副产物，其主要成分为硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的混合物。本发明方法的要点是将主要含有硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素混合物的上述原料通过乙醇分级沉淀，得到硫酸皮肤素粗品；然后采用亚硝酸盐或亚硝酸酯类化合物为氧化剂，使该粗品中含有的硫酸乙酰肝素降解成低分子硫酸乙酰肝素，再通过乙醇分级沉淀，分离得到高纯度的硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素。

具体操作步骤如下：

以生产肝素钠获取的副产物为原料，溶于1～3％的NaCl溶液中，使原料的浓度为5～12％(w/v)，加入乙醇，使乙醇体积含量达31～40％(v/v)，静置数小时，收集沉淀，经干燥处理后即为硫酸乙酰肝素粗品；上清液中补加乙醇，至乙醇体积含量达37～53％(v/v)，收集沉淀，经干燥处理后即为硫酸皮肤素粗品。

将硫酸皮肤素粗品溶于水，按硫酸皮肤素粗品重量的0.5～5％加入氧化剂亚硝酸盐，或按相应克分子数加入氧化剂亚硝酸酯类化合物，进行氧降解反应，并使反应液维持pH值2.5～3.0；反应完成后调节溶液pH至中性，加入乙醇至体积含量达37～47％(v/v)，收集沉淀，经干燥处理后即为硫酸皮肤素；上清液中补加乙醇至体积含量达45～57％(v/v)，收集沉淀，经乙醇脱水，干燥后得低分子硫酸乙酰肝素。

本方法制得的硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素均可用于口服或注射用药物。

本发明根据硫酸皮肤素分子侧链上的氨基是与乙酰氨基(2-乙酰氨基—脱氧-4-O-硫酸-D-半乳糖)连接，而硫酸乙酰肝素分子的氨基是与硫酸基连接(葡萄糖醛酸-2-氨基-2-脱氧-O-硫酸-D-葡萄糖)的结构差异，利用亚硝酸类化合物仅能降解和硫酸基连接的氨基粘多糖(即乙酰肝素)，不能够降解硫酸皮肤素分子中的和乙酰基连接的乙酰氨基半乳糖(即硫酸皮肤素)的性质，选择了合适的反应条件，使混合物中硫酸乙酰肝素降解为有较高溶解度的低分子硫酸乙酰肝素，随后再用乙醇分级沉淀即可顺利地将低分子硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素分离。

本方法制得的硫酸皮肤素产品经测定，旋光度低于-55度，抗凝效价≤10USPu/mg，经核磁共振鉴别，乙酰氨基半乳糖呈阳性，氨基硫酸葡萄糖呈阴性，经电泳测定，产品的迁移率和硫酸皮肤素标准品的迁移率相同，证实产品为高纯度硫酸皮肤素。

综上所述，本发明可从生产肝素的副产品中提取分离出高纯度的硫酸皮肤素，并同时制得低分子硫酸乙酰肝素，方法简单，适合工业化生产。

具体实施方式

实施例一

(1)、原料为肝素钠生产的副产品100g，测得旋光为-2.5度，效价为28USP u/mg。将原料溶于1200ml水中，加入氯化钠36g，调节pH中性，加入乙醇至体积含量达36.5％，静置3小时，收集沉淀并脱水干燥，得硫酸乙酰肝素粗品55.4g。

测得硫酸乙酰肝素粗品的旋光为+22.25度，抗凝血效价为38USPu/mg。

(2)、步骤(1)分离所得的上清液中补加乙醇，使乙醇体积含量达50％，静置过夜，收集沉淀，加乙醇脱水，干燥，得硫酸皮肤素粗品40.9g。

测得硫酸皮肤素粗品的旋光为-32.75度，效价为8USPu/mg。

(3)、取步骤(2)所得的硫酸皮肤素粗品5g，溶于45ml水中，调节pH2.8，加入0.2g NaNO2，搅拌，通过滴加HCl或NaOH，使反应溶液pH维持在2.5～3.0，用淀粉碘化钾试纸测试溶液，观察试纸颜色，直至试纸不变兰，即为反应完成；调节pH6.5，加入乙醇至体积含量达41.2％，过夜，收集沉淀，用乙醇脱水，干燥，得硫酸皮肤素2.7g。

测得硫酸皮肤素旋光为-57.5度，效价为7USPu/mg。

(4)、步骤(3)所得的上清液补中加乙醇，使体积含量达52％，过夜，收集沉淀，用乙醇脱水，干躁，得低分子硫酸乙酰肝素0.50g。

测得低分子硫酸乙酰肝素粗品的旋光为+35度，效价为45USPu/mg。

实施例二

(1)原料为肝素钠生产的副产品100g，测得旋光为+1.55度，效价为30USPu/mg。将原料溶于3％的NaCl溶液1200ml中，调节pH中性，加入乙醇至体积含量达36.0％，静置4小时，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸乙酰肝素粗品44.4g。

测得硫酸乙酰肝素粗品的旋光为+27.25度，抗凝血效价：40USPu/mg。

(2)步骤(1)所得上清液中补加乙醇至体积含量达51％，过夜，收集沉淀，用乙醇脱水，干燥，得硫酸皮肤素粗品49.9g。

测得硫酸皮肤素粗品的旋光为-26.25度，效价为10USPu/mg。

(3)取硫酸皮肤素粗品5g，溶于45ml水中，调节PH2.7，加入0.03克分子重量的亚硝酸异戊酯，搅拌，并使反应溶液pH维持2.5～3.0，用淀粉碘化钾试纸测试溶液，观察试纸颜色，直至试纸不变兰，即为反应完成；调节pH6.5，加入乙醇至体积含量达44.1％，过夜，收集沉淀，用乙醇脱水，干燥，得硫酸皮肤素产品2.3g。

测得硫酸皮肤素旋光：-60.25度，效价：5USPu/mg。

(4)上清液中补加乙醇至体积含量达53％，过夜，收集沉淀，用乙醇脱水干燥，得低分子硫酸乙酰肝素粗品0.45g。

测得低分子硫酸乙酰肝素粗品的旋光为+37度，效价为47USPu/mg。