硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的制备及其抗血栓相关活性协同作用研究

摘要

血栓性疾病发病率逐年升高，严重危害人类健康，其导致的死亡和致残在全世界都是第一位的。各种原因引起的全身或局部血流缓慢、淤滞是血栓形成的重要因素，如高纤维蛋白原血症、高脂血症和循环障碍等。血栓栓塞性疾病一旦发生危害严重，应以预防为主，要预防和治疗血栓，需要长期保证血液的正常状态。因此，研发作用缓和、无出血副反应、可长期安全使用的抗栓药物就成为抗栓药物研发的一个方向。
　　 类肝素是指天然的、合成的和半合成的与肝素有类似作用的物质。猪肠黏膜类肝素作用缓和、副作用小、疗效肯定、费用较低，从分子量和化学性质方面更适于口服，而服用方便的类肝素制剂是抗栓药物重要的研发方向。目前，猪肠黏膜类肝素已经被开发成预防和治疗血栓的药物（如danaparoid，lomoparan，sulodexide，mesoglycan等）在国外市场上市多年。然而，我国生产精品肝素而得到的副产物猪肠黏膜类肝素则被低价出售，没有该类药物上市，这种类肝素产量大、成本低，亟待开发和利用。在国内开发新的、更安全有效的猪肠黏膜类肝素抗栓药物制剂，具有极大的实用价值，前景良好。
　　 猪肠黏膜类肝素(heparinoid，HPND)的主要组分是硫酸乙酰肝素(heparansulfate，HS)、硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）、少量的肝素(heparin，HP)和极少量的硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)。国内外大量研究表明，猪肠黏膜类肝素的主要组分都具有抗血栓作用。HS和HP通过结合抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，ATⅢ)加速凝血酶和各凝血因子的失活速度；DS主要通过结合肝素辅因子Ⅱ(heparin cofactorⅡ，HCⅡ)抑制凝血酶活性，降低血小板聚集，而发挥抗血栓作用。在抗凝血过程中，有1/3的凝血酶是通过HCⅡ的结合而使活性受到抑制，另外2/3的凝血酶通过ATⅢ被抑制。并且，这两种凝血酶抑制方式在体内凝血过程中是分别独立进行的。当DS和HS同时存在时，两者起到协同增效作用。然而，这类药物（如sulodexide）的生物效价却是用脂蛋白酯酶释放活性(lipoprotein lipase release unit，LSU)来确定的。对该类药物的制备方法、组分组成详细信息、各组分对其生物效价影响的研究却报道甚少。
　　 因此，本实验以HP精制的副产物猪肠黏膜类肝素粗品为原料分离纯化制备猪肠黏膜类肝素(HPND);以sulodexide(SLDX)作为阳性对照药，对所制得的HPND用Benedict's沉淀法和强阴离子交换层析法分离纯化，得到各组分，并对其进行全面的结构确证和理化性质分析，包括双糖分析、核磁图谱分析、分子量测定、比旋光度分析、醋酸纤维素薄膜电泳分析、硫酸根/羧酸跟比值测定等；为了研究HPND的抗栓相关活性及其内在机理，本实验在体外检测了其各组分的抗FXa活性和抗FⅡa活性，得到各组分的抗FXa/抗FⅡa活性比值：用体内试验验证了HPND的促脂蛋白酯酶(LPL)释放活性和促组织纤溶酶原激活剂(t-PA)释放活性；为了进一步研究HPND的何种组分对促LPL释放活性和促t-PA释放活性发挥主要作用，本实验用体内实验分别进行了HS和DS促LPL释放活性以及促t-PA释放活性的协同作用研究。
　　 本研究取得的结果和结论有以下几个方面：
　　 1．HPND的制备及其各组分的分离纯化
　　 以粗品猪肠黏膜类肝素作为原料，经过胰蛋白酶（trypsin）和木瓜蛋白酶(papain)联用酶解，或链酶蛋白酶E(pronaseE)酶解，水解掉糖胺聚糖链上的杂蛋白，然后用CaCl2沉淀法脱蛋白，最后将得到的无蛋白多糖用过氧化氢氧化脱色除杂质，经脱盐后冷冻干燥得到纯的HPND。用紫外全波长扫描检测，HPND的核酸和蛋白吸收符合美国药典对核酸和蛋白质杂质的要求。
　　 为了进一步的研究，HPND连同对照药SLDX用Benedict试剂沉淀法分为两大组分，DS组分和HS组分。DS和HS经过SP强阳离子交换层析脱铜，得到无铜纯品。火焰原子吸收分光光度法测定原料、DS和HS铜含量分别为2.83ppm、35.1ppm和18.4ppm。
　　 HS组分再经过QFF强阴离子交换层析二次分离，得到HSO，HS1和HS2三种亚组分。HPND和对照药SLDX的HS组分QFF强阴离子交换层析二次分离图谱显示，两者相应HSO，HS1和HS2三种亚组分的出峰位置一致。
　　 2．HPND和SLDX各组分结构确证和理化性质
　　 (1)HPND-DS，-Mw为22，070 Da，主要双糖组成为α-△UA-[1→3]-GaINAc，比旋光度为-56°，硫酸根/羧酸根比值1.14±0.03，核磁图谱1H在1.940ppm有GaINAc的甲基的特征化学位移，可确定为硫酸皮肤素。
　　 (2)SLDX-DS，-Mw为18，860 Da，主要双糖组成为α-△UA-[1→3]-GaINAc，比旋光度为-51°，硫酸根/羧酸根比值1.45±0.09，核磁图谱1H在1.939ppm有GaINAc的甲基的特征化学位移，可确定为硫酸皮肤素。
　　 (3)HPND-HSO，比旋光度为接近0°，含有双糖α-△UA-[1→4]-GlcNAc，蒽酮比色法测定其糖含量为(15.31±0.96)％，
　　 (4)SLDX-HSO，比旋光度为接近0°，含有双糖α-△UA-[1→4]-GlcNAc，葸酮比色法测定其糖含量为(3.60±0.38)％，
　　 (5)HPND-HS1，-Mw为14，070 Da，主要双糖组成为α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcN-6S，比旋光度为57°，硫酸根/羧酸根比值1.06±0.06，为硫酸乙酰肝素；
　　 (6)SLDX-HS1，-Mw为11,150Da，主要双糖组成为α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcN-6S，比旋光度为50°，硫酸根/羧酸根比值1.50±0.08，为硫酸乙酰肝素；
　　 (7)HPND-HS2，-Mw为14，300Da，主要双糖组成为α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcNS-6S，比旋光度为40°，硫酸根/羧酸根比值1.72±0.11，为肝素；
　　 (8)SLDX-HS2，-Mw为10,370Da，主要双糖组成为α-△UA-[1→4]-GlcNAc和α-△UA-2S-[1→4]-GlcNS-6S，比旋光度为36°，硫酸根/羧酸根比值1.85±0.13，为肝素。
　　 3．HPND和SLDX各组分体外抗FXa活性和抗FⅡa活性
　　 HPND和SLDX各组分体外抗FXa活性和抗FⅡa活性采用美国药典方法测定，实验结果显示，HPND-DS、SLDX-DS、HPND-HSO和SLDX-HSO的抗FXa效价和抗FⅡa效价都比较低，都在2～8IU/mg之间，抗FXa/抗FⅡa比值均为1.2。HPND和SLDX的抗FXa活性和抗FⅡa活性都主要是由HS组分来呈现的：
　　 (1)HPND-HS抗FXa活性122.6 IU/mg，抗FⅡa活性97.7 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.3;
　　 (2)SLDX-HS抗FXa活性64.6 IU/mg，抗FⅡa活性46.9 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.4;
　　 (3)HPND-HS1抗FXa活性19.6 IU/mg，抗FⅡa活性11.3 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.7;
　　 (4)SLDX-HS1抗FXa活性8.6 IU/mg，抗FⅡa活性2.4 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值3.6;
　　 (5)HPND-HS2抗FXa活性173.6 IU/mg，抗FⅡa活性148.5 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.2;
　　 (6)SLDX-HS2抗FXa活性118.4 IU/mg，抗FⅡa活性79.5 IU/mg，抗FXa/抗FⅡa比值1.5;
　　 4．HPND促血管内皮细胞LPL和t-PA释放活性
　　 健康wistar大鼠尾静脉注射HPND，采用ELISA试剂盒测定大鼠血浆中LPL和t-PA含量变化情况，实验组HPND给药的低、中、高剂量分别为2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg;阳性对照SLDX组给药剂量为5.0mg/kg;生理盐水组做阴性对照。
　　 实验结果显示，HPND明显促血管内皮细胞LPL释放，与SLDX效果相当，且具有剂量依赖性。具体数据为：生理盐水组LPL含量为(0.0893±1.7069)ng/mL:HPND低、中、高剂量组LPL含量分别为(3.926±0.984)ng/mL、(9.502±1.532)ng/mL、(10.481±4.681)ng/mL;SLDX组LPL含量为(10.368±4.453)ng/mL。
　　 HPND给药之后大鼠血浆中t-PA含量随着给药剂量的增大微弱的升高，即HPND促t-PA释放活性并不明显。实验结果如下：生理盐水组t-PA含量为(0.4641±0.0421)pg/mL;HPND低、中、高剂量组t-PA含量分别为(0.5336±0.1564)pg/mL、(0.7051±0.1538)pg/mL、(0.7771±0.1091)pg/mL;SLDX组t-PA含量为(0.5259±0.0595)pg/mL。
　　 5．HS和DS协同促LPL和t-PA释放活性
　　 为了确定HPND中促LPL和t-PA释放活性的主要组分，按HS和DS在HPND中的百分含量设立低、中、高剂量组分别验证HS和DS促LPL和t-PA释放活性。实验结果表明，DS比HS具有更强的促LPL释放能力，而DS和HS的促t-PA释放能力都较弱，但是DS比HS作用稍强。
　　 DS低、中、高剂量组LPL含量分别为(1.5355±0.8644)ng/mL、(2.0118±0.9767)ng/mL、(3.7870±2.2535)ng/mL;HS低、中、高剂量组LPL含量分别为(1.6134±0.4838)ng/mL、(2.5573±0.6038)ng/mL、(2.8604±0.8253)ng/mL;生理盐水组(0.0893±1.7069)ng/mL。
　　 DS低、中、高剂量t-PA含量分别为(0.6507±0.2116)pg/mL、(0.7429±0.2547)pg/mL、(0.7401±0.1543)pg/mL;HS低、中、高剂量t-PA含量分别为(0.5044±0.1049)pg/mL、(0.6297±0.2148)pg/mL、(0.5883±0.1786)pg/mL;生理盐水组(0.4641±0.0421)pg/mL。
　　 6．本课题取得的主要成果
　　 (1)建立了一套实验室制备猪肠黏膜类肝素(HPND)以及HS和DS的方法，并得到高纯度的HPND、HS和DS。
　　 (2)首次对HPND和SLDX各组分体外抗FXa活性和抗FⅡa活性进行了测定。
　　 (3)首次对猪肠黏膜类肝素HPND促血管内皮细胞LPL和t-PA释放活性进行了测定。
　　 (4)首次对HS和DS在促血管内皮细胞LPL和t-PA释放活性方面的协同作用进行了系统研究。