鼠尾草中醛糖还原酶抑制剂丹酚酸M和迷迭香酸

摘要

本发明涉及一种从新疆鼠尾草全草中提取醛糖还原酶抑制剂的制备方法及药效学实验，结果为丹酚酸M的IC50为0.79μg/mL，迷迭香酸的IC50为1.13μg/mL，提示丹酚酸M或含有丹酚酸M的提取物，迷迭香酸或含有迷迭香酸的提取物有防治糖尿病并发症的应用。

说明书

                         技术领域

本发明涉及一种从植物新疆鼠尾草中提取抑制醛糖还原酶有效成分的方法及其医药用途。

                         背景技术

高血糖引发的DCC诸如神经、肾脏、视网膜病变和白内障等，极大地增加了心脏病、中风、失明、截肢和肾衰竭的危险性。现代医学研究证明DCC与多元醇通路相关，该通路的关键限速酶——醛糖还原酶(aldose reductase，AR)在高血糖时被激活，催化葡萄糖大量转化为不易透过细胞膜的山梨醇，引起细胞渗透性损伤，导致DCC发生。应用醛糖还原酶抑制剂就成了延缓和防治DCC的关键因素。

新疆鼠尾草(Salvia deserta Schang)亦称新疆丹参，为唇形科鼠尾草属植物，在民间以全草入药，有清热解毒、止咳祛痰、消肿利尿等功效。它与药典中收载的正品丹参(Salvia miltiorhiza Bunge)同属，正品丹参作为活血化瘀药，长期用于心血管系统及妇科疾病等方面的预防和治疗。最近研究表明：正品丹参对肿瘤，糖尿病也有一定的抑制作用，尤其在预防和治疗糖尿病慢性并发症(diabetic chroniccomplications，DCC)中，具有醛糖还原酶(aldose reductase，AR)抑制活性，并寻找到有效部位以及有效成分丹参醇A和B(即DanshenolA和B)。探讨与其有着相近亲缘关系的同属植物新疆鼠尾草是否存在AR抑制活性？引起我们的兴趣，因此对新疆鼠尾草不同提取部位进行了AR抑制活性的筛选，结果发现了与丹参醇A和B作用类似的丹酚酸M和迷迭香酸具有醛糖还原酶抑制作用。

                       发明内容

本发明目的在于，所述的从新疆鼠尾草中提取抑制醛糖还原酶有效成分的方法及其医药用途。将新疆鼠尾草通过水溶剂提取、正丁醇萃取得到正丁醇部位。所得到的正丁醇部位含丹酚酸类；或者新疆鼠尾草通过甲醇提取，浓缩提取液经乙酸乙酯后再经过AB-8大孔吸附树脂，Sephadex LH-20反复柱层析，乙腈:H₂O洗脱得到丹酚酸M和迷迭香酸。通过动物实验证明：正丁醇部位具有抑制醛糖还原酶的作用。说明该正丁醇有效部位能有效治疗糖尿病并发症。

下面介绍有效成分提取分离方法和药效学研究具体实施方式，但不以此限定权利要求。

                       具体实施方式

实施例1  丹酚酸M和迷迭香酸的制备

1)干燥的新疆鼠尾草叶，粉碎，用水80℃提取3次，合并三次提取液，浓缩，冷冻干燥，得干燥浸膏，水混悬，用正丁醇(n-BuOH)反复萃取，减压回收溶剂得n-BuOH浸膏，用水溶解后的浸膏，上AB-8大孔树脂，将粗流份进行Sephadex LH-20反复柱层析得水溶性化合物：丹酚酸M。

2)干燥的新疆鼠尾草叶，粉碎，用水80℃提取3次，合并三次提取液，浓缩，冷冻干燥，得干燥浸膏，水混悬，用正丁醇(n-BuOH)反复萃取，减压回收溶剂得n-BuOH浸膏，用水溶解后的浸膏，上进行Sephadex G-75反复柱层析得水溶性化合物：迷迭香酸。

实施例2  丹酚酸M和迷迭香酸的NMR光谱数据

丹酚酸M：

氢谱具体数据如下：¹H-NMR(D₂O)：δppm：

7.7(1H，s，H-7)，               6.97(1H，s，H-2)，  7.01(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)，

6.88(1H，d，J＝8.1Hz，H-6’)，  4.59(1H，s，H-10)， 6.83(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)，

6.76(1H，d，J＝8.31Hz，H-5’)， 6.79(1H，s，H-2’)，4.78(1H，s，H-11)，

3.54(3H，s，OCH₃)

¹³C-NMR谱数据具体归属如下：¹³C-NMR(D₂O)，δppm：

177.71(COOH，C-9)，  178.84(COOH，C-12)，               143.173(C-7)，

57.89(C-10)，          86.59(C-11)，     128.07(C-1)，      115.53(C-2)，

150.02(C-3)，          149.439(C-4)，    119.00(C-5)，      129.29(C-6)，

50.77(-OCH₃)，       135.21(C-1’)，   117.53(C-2’)，    145.93(C-3’)，

146.93(C-4’)，        117.30(C-5’)，   121.40(C-6’)。

迷迭香酸

¹H-NMR波谱数据归属如下：

¹H-NMR(CD₃OD)，δppm：

7.53(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)     6.28(1H，d，J＝15.9Hz，H-8)

7.02(1H，d，J＝2.1Hz，H-2)      6.93(1H，dd，J＝6.0Hz，J＝2.1Hz，H-6)

6.76(1H，d，J＝5.7Hz，H-5)      6.65(1H，brs，H-2′)

6.62(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)    6.58(1H，d，J＝8.0Hz，H-6′)

5.12(1H，d，J＝9.3Hz，H-8′)    3.06(1H，d，J＝14.4Hz，H-7′)

2.94(1H，dd，J＝14.4Hz，9.3Hz，H-7′)

¹³C-NMR(CD₃OD)，δppm：

176.2(COOH，C-9′)     145.0(CH＝CH，C-7)

115.3(CH＝CH，C-8)     168.8(羰基，C-9)

其余碳归属：

125.0(C-1)，    115.1(C-2)，    146.8(C-3)，     149.5(C-4)，

116.4(C-5)，    122.9(C-6)，    129.7(C-1′)，   116.4(C-2′)，

146.0(C-3′)，  145.9(C-4′)，  116.2(C-5′)，   121.7(C-6′)，

38.5(C-7′)，   76.6(C-8′)

实施例3  丹酚酸M和迷迭香酸的醛糖还原酶抑制作用

实验：

根据本发明所述的方法制备的丹酚酸M和迷迭香酸直接用于抑制醛糖还原酶的应用。

材料：UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津)；NADPH(sigma，纯度＞98％)；DL-甘油醛(ICN Biomedicals)；人AR(日本和光純藥工菐株式会社，human muscle)；槲皮素(中国药品生物制品检定所)，其余试剂均为国产分析纯。新疆鼠尾草标本由新疆医科大学生药教研室鉴定并存放。

方法：

酶活性测定，反应体系：700μL pH6.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(buffer)，100μL 1.5mmol/L NADPH，100μL 100mmol/L DL-甘油醛，3μL 3×10^-2U/L的人AR与97μL buffer。25℃混匀20s后反应180s，340nm处吸光值(ΔA)的下降值表示人AR的活性。新疆鼠尾草各部位对人AR的抑制是指在上述反应体系中加入3μL样品后酶活性的降低程度。空白测定：样品用DMSO溶剂，人AR用buffer代替；对照测定：样品用DMSO溶剂；阳性对照用1mg/mL的槲皮素，目前槲皮素被公认为衡量其他醛糖还原酶抑制剂作用的阳性对照药物。人AR抑制率(％)＝[1-(ΔA样品-ΔA空白)/(ΔA对照-ΔA空白)]×100％。

结果

新疆鼠尾草中分离得到的化合物丹酚酸M和迷迭香酸，在不同浓度下对人醛糖还原酶的抑制作用见表1，其中槲皮素为阳性对照品，从中可以看出丹酚酸M和迷迭香酸对人醛糖还原酶活性均有抑制作用。在1g/L浓度下，他们的抑制强度较大。随着浓度的降低，抑制率也相应减小。丹酚酸M的IC₅₀为0.79μg/mL，迷迭香酸的IC₅₀为1.13μg/mL。

         表1两种化合物在不同浓度下对人AR的抑制强度(n＝3)

  化合物                             抑制率  IC₅₀μg/mL)  3μg/mL  2.25μg/mL  1.5μg/mL  0.75μg/mL  丹酚酸M  迷迭香酸  槲皮素  1.059  0.961  0.725  1.010  0.814  0.843  0.647  0.480  0.343  0.79  1.13

讨论

国内外许多学者致力于寻找强有力的AR抑制剂，中药民族药在治疗糖尿病慢性并发症中有着千年的历史，因此从中药民族药中寻找较强的AR抑制剂具有重要优势。本文研究了新疆鼠尾草中两种化学成分丹酚酸M和迷迭香酸对AR抑制活性，本实验采用人醛糖还原酶作为药物筛选的酶源，所以实验结果可靠，可信度高。