水产动物消化道优势菌群结构的分子鉴定方法及专用引物

摘要

本发明公开了一种水产动物消化道优势菌群结构的分子鉴定方法及其专用引物。该专用引物中的上游引物具有序列表中的SEQ ID №：1，下游引物是序列表中的SEQ ID №：2。该鉴定方法包括以下步骤：1)获得消化道各段及各段内容物作为待测样品；2)提取待测样品的总DNA；3)以待测样品的总DNA为模板，在上述专用引物的引导下进行PCR扩增；4)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，银染后得到DGGE指纹图谱；同时另设一测序组；5)对DGGE指纹图谱进行聚类及半定量分析；6)从测序组中回收优势条带，并以此为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，对目的片段进行测序；7)对测序结果进行序列比对分析，确定消化道优势菌群结构。

说明书

技术领域

本发明涉及水产动物消化道优势菌群结构的分子鉴定方法及其专用引物。

背景技术

水产动物消化道内存在着大量细菌群落，健康动物消化道优势菌群通过①分泌胞外酶(Ghosh，K.，et al.The Israeli Journal of Aquaculture 2003.55(1)：13-21)；②合成维生素(Sugita，H.，et al.Aquaculture 1991.92：267-276)；③合成短链脂肪酸(李静，华中农业大学硕士学位论文，2003)；④分泌酸菌素

(Acidoline)(Sugita，H.，et al.Fish.Sci.2002.68(5)：1004-1011)等途径对机体正常的生命活动起到重要作用。Smith早在20世纪30年代便开始研究鱼类细菌，从50年代开始研究鱼类肠道细菌(Liston，J.，J.Gen.Microbiol.1957.16：205-216；Margolis，L.，J.Fish.Res.Bd.Can.1953.10(2)：95-104)，相关报道非常丰富。然而，这些研究大多数以肠道内容物或包含食糜的肠管为研究对象，而较少单独关注肠壁菌群，关于水产动物胃部菌群的研究报道也很少见；另外，这些研究均依据常规的人工培养法，存在着一定局限性(冯仰廉，北京：科学出版社，2004，114-130)：①自然界很多微生物不能人工培养；②绝大多数严格厌氧微生物尚未得到鉴定和描述；③人为培养的微生物与其自然界菌体在形态和特征上差异显著；④操作过程繁冗(Ji，N.，et al.J.Microbiol.Methods 2004.57：409-413)，例如：水环境中可培养细菌仅占总数的1％(Amann，R.I.，et al.Microbiol.Reviews 1995.59：143-169)；鱼体表可培养微生物更不足总量的0.01％(Bernadsky，G.，Rosenberg，E.，MicrobialEcol.1992.24：63-74)；50％-89％的虹鳟肠道细菌无法培养，可培养细菌中亦有20％无法进行定性分析(Huber，I.，et al.J.Applied Microbiol.2004.96：117-132)。可以推断，用常规的人工培养法无法获取水产动物消化道菌群的全面信息，势必极大地限制了针对水产动物消化道菌群的深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供一对用于鉴定水产动物消化道优势菌群结构的专用引物。

本发明所提供的专用引物，其上游引物具有序列表中的SEQ ID №：1，下游引物是序列表中的SEQ ID №：2。

序列表中的SEQ ID №：1由17个碱基组成，SEQ ID №：2由15个碱基组成。

为获得更好的检测效果，所述上游引物的5’端还可添加有若干个GC夹子，添加有40个GC夹子的上游引物可为序列表中的SEQ ID №：3。序列表中的SEQ ID №：3由57个碱基组成。

本发明的第二个目的是提供一种水产动物消化道优势菌群结构的分子鉴定方法。

本发明所提供的水产动物消化道优势菌群结构的分子鉴定方法，包括以下步骤：

1)在无菌条件下，获得消化道各段(包括胃、肠等)及各段内容物作为待测样品；

2)提取待测样品的总DNA，并对其进行纯化；

3)以待测样品的总DNA为模板，在上述专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段(长度约为400bp)进行回收及纯化；

4)对纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，银染后得到DGGE指纹图谱；同时另设一测序组，其点样量为600-1000ng，用E.B.染色后得到测序用指纹图谱；

5)对DGGE指纹图谱进行聚类及半定量分析，确定消化道不同部位菌群结构的关系及各个条带所代表的细菌群在全部优势菌群中的比例，即相对丰度；

6)根据步骤5)的分析结果，从测序组中回收相对丰度高于1％的优势条带，并以此为模板，在由序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2组成的不含GC夹子的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段(长度约为400bp)进行回收、纯化及测序；

7)对测序结果进行序列比对分析，确定消化道优势菌群结构。

在上述分子鉴定方法中，所述步骤3)中的PCR扩增条件为：先94℃变性5min；然后进入降落程序：94℃ 30s，65-56℃(递降0.5℃)30s，72℃ 1min；再进行以下循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共25个循环；最后72℃延伸8min。

为避免条带缺失，所述步骤4)中可先通过预试得到DGGE适宜的丙烯酰胺浓度梯度范围；所述银染方法优选为快速银染法，方法为：先用固定液(10％无水乙醇，0.5％冰乙酸)固定12-18min，用去离子水洗4-6min；然后用0.2％硝酸银染色12-18min，去离子水洗4-6min；再用显色液(3.0％NaOH，0.5％甲醛)显色12-18min；最后用固定液终止反应。

步骤5)中可用Bio-1D++软件进行半定量分析，计算公式为：相对丰度P₁(％)＝100×OD₁/OD，其中OD₁为选定条带i的光密度，OD为全部条带的光密度之和。

步骤7)中可采用Blast程序在线(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对测序结果进行序列比对分析，确定消化道优势菌群结构。

上述鉴定方法适用于海水鱼、淡水鱼、甲壳动物或两栖类等任一种类的水产动物，具体来讲包括川纹笛鲷、奥尼罗非鱼、南美白对虾和中华鳖等。

本发明提供了一种水产动物消化道优势菌群结构的分子鉴定方法及其专用引物。该检测方法具有以下优点：

1、免培养高效提取微生物总DNA；

2、针对16s rDNA v6-v8区的PCR扩增片段长度约为400bp，相比较近年来应用较多的长度约为200bp的v3区片段信息量大(李志勇等，微生物学通报，2005.32(3)：82-86)；

3、通过梯度凝胶电泳技术，可在适宜条件下对不同菌群16s rDNA v6-v8区片段实施分离；

4、用快速银染法获得DGGE指纹图谱，通过E.B.染色获取测序用指纹图谱，在一定程度上克服了可恢复性银染技术的不确定性；

5、结合Bio-1D++软件对优势菌群进行半定量分析，以及通过测序比对完成的菌群定性分析，结果准确、可靠，逐步克服了常规的人工培养法对水产动物消化道菌群结构进行分析的不足。

基于上述优点，本发明将在水产动物消化道优势菌群结构的分析中发挥巨大作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为纯化的川纹笛鲷消化道总DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为川纹笛鲷消化道菌群16s rDNA v6-v8区片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为川纹笛鲷消化道菌群16s rDNA v6-v8区片段PCR扩增纯化产物等量混合样的DGGE指纹图谱

图4为不同点样量的川纹笛鲷消化道菌群16s rDNA v6-v8区片段PCR扩增纯化产物的DGGE指纹图谱

图5为川纹笛鲷消化道菌群16s rDNA v6-v8区片段PCR扩增纯化产物的DGGE指纹图谱及模式图

图6为川纹笛鲷消化道菌群16s rDNA v6-v8区片段PCR扩增纯化产物DGGE指纹图谱的聚类分析结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由三博生物技术有限公司完成，所述百分浓度均为质量百分浓度。

实施例1、海水鱼-川纹笛鲷(Lutjanus sebae)的消化道优势菌群结构分析

一、准备样品

健康川纹笛鲷(重量：241.9g)，随机挑选自海南省陵水新村港海水养殖网箱，经测定取样时水温30℃、海水盐度33‰，实验鱼全程投喂单-膨化饲料(含水分8.2％、粗蛋白45.0％及粗脂肪8.5％)，每天投喂3-4次，在取样当日13:00-14:00投喂后在15∶10进行取样。取样时用抄网迅速将鱼从网箱中捞出，用剪刀敲击头部致死，随后将鱼置于灭菌塑料密封袋内，保存在冰块中，3h内转移到实验室，12h内处理鱼样。

在无菌操作台上进行鱼样处理，先用75％酒精对体表和解剖剪进行消毒，用解剖剪沿肛门向上朝前呈弧形剪开，用无菌棉线分别结扎胃部与肠段，用75％酒精棉球擦拭消化管外壁，并用无菌冲洗液(灭菌人工配制海水，盐度33‰)冲洗数遍。用剪刀分离出消化道各段(包括胃、肠)，用1mL离心管收集消化道内容物，-20℃保存；剖开消化道各段，在无菌冲洗液中轻轻漂洗2min，置入1mL离心管中-20℃保存。

二、总DNA的提取及纯化

选择消化道充塞度好的1尾川纹笛鲷样品用下述方法提取消化道各段及各段内容物的总DNA：

1、裂解细胞

在无菌操作台上从样品管中称取约0.25g样品置于2mL裂解管，加入1mL裂解缓冲液(500mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM EDTA及4％ SDS，121℃灭菌20min)，再加入0.3g直径0.1mm和0.1g直径0.5mm的氧化锆珠，用珠磨仪(Mini-Beadbeater^TM，USA)振荡3min，然后70℃水浴15min，4℃ 16000g离心5min，将上清液倒入2mL离心管中，再加入300μl新鲜裂解液到裂解管中，重复上述步骤，合并两次上清。

2、沉淀DNA

向步骤1获得的合并上清中加入260μl 10M(NH₄)Ac溶解产物，混匀，冰浴5min，然后4℃ 16000g离心10min，将上清移入两个1.5mL离心管中，每个管中加等体积异丙醇混匀，冰浴30min后，4℃、16000g离心15min，用枪吸出上清，用70％乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥3min，最后用100μl TE(pH8.5)溶解DNA，并合并两管中DNA。

3、DNA的粗纯化

向步骤2获得的粗DNA样品中加入12μl RNA酶(浓度10mg/mL)，37℃水浴15min，再加入20μl蛋白酶K，70℃水浴10min，然后用等体积氯仿∶苯酚、氯仿分别进行抽提(10000rpm 10min，吸取上清)，再用等体积异丙醇沉淀DNA，16000g 15min，弃上清最后用70％乙醇500μl洗DNA，弃上清，超净台吹干后，用200μl TE溶解。

4、试剂盒纯化

取约50μl步骤3的DNA样品，用Cycle-Pure DNA纯化试剂盒(OMEGA，USA)并参照试剂盒说明书对其进行纯化。纯化后，取5μl样品进行0.8％DNA琼脂糖电泳检测，检测结果如图1所示(泳道Marker：3μl hind III DNA Marker，泳道S1：川纹笛鲷胃内容物样品DNA；泳道S0：川纹笛鲷胃壁样品DNA；泳道G1：川纹笛鲷肠内容物样品DNA；泳道G0：川纹笛鲷肠壁样品DNA)，表明经纯化获得了纯度较高的DNA样品。

三、16s rDNA v6-v8区片段的PCR扩增及目的片段的回收、纯化

1、针对16s rDNA v6-v8区片段的PCR扩增

针对16s rDNA v6-v8区片段设计引物V₆F(序列表中SEQ ID №：1)和V₆R(序列表中SEQ ID №：2)，再在上游引物V₆F的5端’添加40个GC夹子，将该序列命名为V₆F1(序列表中SEQ ID №：3)，分别以步骤二获得的消化道各段及其内容物的总DNA为模板，在V₆F1和V₆R的引导下，进行PCR扩增，50μl PCR反应体系为：5.0μl 10×PCR缓冲液(200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，15mM MgCl₂)，4.0μldNTPs，1.5mM MgCl₂，8.0μl 0.1％BSA，0.5μl 2.5U/μl TaqE，50ng模板DNA，引物V₆F和V₆R各0.5μl，用dd H₂O补充反应体系至50μl。实验设置不添加模板的阴性对照组，模板由dd H₂O等体积补充。采用降落式PCR反应程序：先94℃变性5min；然后进入降落程序：94℃ 30s，65-56℃(0.5℃)30s，72℃ 1min；再进行以下循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共25个循环；最后72℃延伸8min。反应结束后，取3μl PCR反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道S1：川纹笛鲷胃内容物样品PCR扩增产物；泳道S0：川纹笛鲷胃壁样品PCR扩增产物；泳道G1：川纹笛鲷肠内容物样品PCR扩增产物；泳道G0：川纹笛鲷肠壁样品PCR扩增产物；泳道Marker：3μl D2000 DNA Marker；泳道CK：阴性对照(双蒸水))，PCR扩增得到约400bp的目的条带，与预期结果相符。

2、目的片段的回收纯化

取全部样品进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，在紫外灯下切胶回收400bp的目的条带，用Cycle-Pure DNA纯化试剂盒并按照试剂盒说明书对目的片段进行纯化，纯化后取3μl纯化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了纯度较高的目的片段。

四、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及凝胶成像扫描与分析

采用DCODE^TM系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为：将等量的步骤三获得的不同样品的16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物(约400bp)混合，取200ng用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(丙烯酰胺浓度0-100％，电泳缓冲液0.5×TAE，75V，16h)，然后切下目的泳道区域，用快速银染法对变性聚丙烯酰胺凝胶染色，方法为：先用固定液(10％无水乙醇，0.5％冰乙酸)固定15min，用去离子水洗5min；然后用0.2％硝酸银染色15min，去离子水洗5min；再用显色液(3.0％NaOH，0.5％甲醛)显色15min；最后用固定液终止反应。用Vilber凝胶成像扫描系统对银染条带进行照像，结果如图3所示，对图3进行分析，确定适宜的DGGE丙烯酰胺浓度范围为25％-65％。再取混合DNA样品，按100ng点样量、200ng点样量(3个平行)及300ng点样量在上述丙烯酰胺适宜的浓度范围内用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，其余操作同上。在Vilber凝胶成像扫描系统中对银染条带进行照像，结果如图4所示(箭头所示为100ng泳道中缺失条带位置)，对图4进行分析，100ng点样量损失2条条带(图4中箭头所示)，200ng点样量与300ng点样量所得到的指纹图谱一致，并且200ng点样量3个平行样的指纹图谱完全一样，表明DGGE技术具有可重复性。

上述预试结果表明，将各样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物在8％聚丙烯变性胶中分离(丙烯酰胺浓度25％-65％，电泳缓冲液0.5×TAE)，75V，16h，样品点样量200ng DNA(重复I)、另设一组点样量1000ng DNA(重复II)。

将重复I所在泳道区域切下，用快速银染法对其进行染色。在Vilber凝胶成像扫描系统中对银染条带进行照像，照相结果及其模式图如图5所示(泳道S1：川纹笛鲷胃内容物样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；泳道S0：川纹笛鲷胃壁样品16s rDNAv6-v8区扩增纯化产物；泳道G1：川纹笛鲷肠内容物样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；泳道G0：川纹笛鲷肠壁样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；1-14：条带位置)，用Bio-1D++软件对该DGGE指纹图谱进行聚类分析及半定量分析，确定消化道不同部位菌群结构的关系及各个条带所代表细菌群在全部优势菌群的比例，即相对丰度，

                    相对丰度P_i(％)＝100×OD_i/OD

其中OD_i为选定条带i的光密度，OD为全部条带光密度之和。聚类分析结果如图6所示(1：川纹笛鲷胃内容物样品；2：川纹笛鲷胃壁样品；3：川纹笛鲷肠内容物样品；4：川纹笛鲷肠壁样品)，半定量分析结果如表1所示：

表1 16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物DGGE指纹图谱中川纹笛鲷消化道优势菌群相

                              对丰度(％)^*

  条带位置  S1  S0  G1  G0  1  2  3  4  5  8.2  3.8  -  -  4.2  8.4  9.5  4.9  -  4.2  7.1  -  -  -  -  8.7  6.2  -  4.3  6.9  6  7  8  9  10  11  12  13  14  条带数  10.0  -  10.6  8.0  10.3  19.7  16.5  8.8  -  10  9.4  7.7  8.0  5.3  9.2  17.2  9.9  3.9  2.5  13  -  10.4  13.6  13.7  15.3  23.8  16.2  -  -  7  9.6  9.4  12.0  7.9  -  18.3  16.7  -  -  10

注：S1：川纹笛鲷胃内容物样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；S0：川纹笛鲷胃壁样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；G1：川纹笛鲷肠内容物样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；G0：川纹笛鲷肠壁样品16s rDNA v6-v8区扩增纯化产物；条带位置：按图5。

将重复II所在泳道区域切下，按E.B.染色：将胶块浸入250mL 1×TAE中，加入25μl 10mg/mL E.B.，染色15min；再用250mL 1×TAE脱染15min。

五、优势条带的回收、测序与序列比对分析

在紫外灯下将重复II所在泳道的明显条带用无菌手术刀小心割下，并在银染图谱中标记相应位置，经无菌水冲洗3遍后放入1.5mL EP管中，用菌枪头捣碎，加入30μldd H₂O浸泡5小时。将EP管12000rpm离心5min，取上清作为PCR模板，在不带GC夹子的针对16s rDNA v6-v8区片段设计的特异引物V₆F(5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’，序列表中序列1)及V₆R(5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’)的引导下，进行PCR扩增，50μl PCR反应体系为：5.0μl 10×PCR缓冲液(200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，15mM MgCl₂)，4.0μl dNTPs，MgCl₂ 1.5mM，8.0μl 0.1％BSA，0.5μl 2.5U/μl TaqE，50ng模板DNA，引物V6F和V6R各0.5μl，用dd H₂O补充反应体系至50μl。采用降落式PCR反应程序：先94℃变性5min；然后进入降落程序：94℃ 30s，65-56℃(0.5℃)30s，72℃ 1min；再进行以下循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共25个循环；最后72℃延伸8min。反应结束后取3μl反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用Cycle-Pure DNA试剂盒对目的片段进行回收及纯化，并进行测序。其中，图5中的S0-1具有序列表中序列4的核苷酸序列，由394个碱基组成；S0-2具有序列表中序列5的核苷酸序列，由396个碱基组成；S0-11具有序列表中序列6的核苷酸序列，由396个碱基组成。采用Blast程序在线(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行序列比对分析，分析结果表明图5中的优势条带S0-1、S0-2及S0-11所代表的菌分别为Stenotrophomonas maltophilia(96％)、Vibrio olivaceus(97％)、新菌I。

综上所述，川纹笛鲷胃壁优势菌群部分结构为：Stenotrophomonas maltophilia，相对丰度8.4％；Vibrio olivaceus，相对丰度9.5％；新菌1，相对丰度17.2％。其余的优势菌群可以用相同方法类推获得。消化道其它部分菌群结构亦可通过相同方法获得。

实施例2、淡水鱼-奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)的消化道优势菌群结构分析

用与实施例1基本相同的方法对淡水鱼-奥尼罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)的消化道优势菌群结构分析，方法中的差异在于步骤一中准备样品时，冲洗消化道壁时所用的无菌冲洗液换为无菌水；步骤三中扩增16s rDNA v6-v8区片段的引物序列为V₆F1和V₆R。

结果奥尼罗非鱼肠壁优势菌群部分结构为：Aeromonas hydrophila，相对丰度21.3％；Escherichia coli，相对丰度12.5％；Photobacterium fluorescens，相对丰度4.0％。其余的优势菌群可以用相同方法类推获得。消化道其它部分菌群结构亦可通过相同方法获得。

实施例3、甲壳动物-南美白对虾(Penaeus vannamei)的消化道优势菌群结构分析

用与实施例1基本相同的方法对甲壳动物-南美白对虾(Penaeus vannamei)的消化道优势菌群结构分析，方法中的差异在于步骤一中准备样品时，冲洗消化道壁时所用的无菌冲洗液换为经灭菌过滤的养殖用水；步骤三中扩增16s rDNA v6-v8区片段的引物序列为V₆F1和V₆R。

结果南美白对虾胃壁优势菌群部分结构为：Lactobacillus sp.，相对丰度10.2％；Closteridium perfringens，相对丰度3.2％。其余的优势菌群可以用相同方法类推获得。消化道其它部分菌群结构亦可通过相同方法获得。

实施例4、两栖类-中华鳖(Peiodiscus sinensis)的消化道优势菌群结构分析

用与实施例1基本相同的方法对两栖类-中华鳖(Pelodiscus sinensis)的消化道优势菌群结构分析，方法中的差异在于步骤一中准备样品时，冲洗消化道壁时所用的无菌冲洗液换为无菌水；步骤三中扩增16s rDNA v6-v8区片段的引物序列为V₆F1和V₆R。

结果中华鳖肠壁优势菌群部分结构为：Enterobaoteriaceae sp.，相对丰度12.0％。其余的优势菌群可以用相同方法类推获得。消化道其它部分菌群结构亦可通过相同方法获得。

                              序列表

<160>6

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aacgcgaaga accttac                                                   17

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

acgggcggtg tgtac                                                     15

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg aacgcgaaga accttac        57

<210>4

<211>394

<212>DNA

<213>川纹笛鲷(Lutjanus sebae)

<400>4

tggattggtg ccttcgggaa ctcgaacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc     60

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtccttagtt gccagcacgt    120

aatggtggga actctaagga aaccgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc    180

aagtcatcat ggcccttaca gccagggcta cacacgtact acaatggtag ggacaaaggg    240

ctgcaagccg gcaacggtaa cccaatccca aaaaccctat ctcattccgg attgaattct    300

gcaactcgac tccatgaagt cggaatccct agtaatcgca aatcaacatt gctgcggtga    360

atactttccc gggccttgta cacccccccc ataa                                394

<210>5

<211>396

<212>DNA

<213>川纹笛鲷(Lutjanus sebae)

<400>5

aagttcgagt gtgccttcgg gaactctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt     60

gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttg tttgccagca    120

cttcgggtgg gaactccagg gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggacgacg    180

tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacccacgtg ctacaatggc atatacagag    240

ggcagcaaga ccgcgaggtg gagcgaatcc caaaaagtat gtcctaatcc ggatcggagt    300

ctgcaactcc actccctgaa gtcggaatcc ctagtaatcc tggatcaaaa tgccacggtg    360

aataccttcc cgggccttgt acacaccccc cgtaaa                              396

<210>6

<211>396

<212>DNA

<213>川纹笛鲷(Lutjanus sebae)

<400>6

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