一种可透血脑屏障的脂质体和以该脂质体为载体的药物组合物及其制备方法

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及一种可透血脑屏障的脂质体和以该脂质体为载体的药物组合物及其制备方法。该脂质体脂质体含有5～15％摩尔含量的血脑屏障锚点，还包含高相变温度磷脂、胆固醇和助融剂，脂质体粒径范围为0.05～0.5μm。该脂质体药物组合物包被有治疗中枢神经系统有效量的药物，具有较长的血循环时间，并且能携带所包被药物透过血脑屏障进入中枢神经系统达到治疗中枢神经系统疾病的作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种可以透过血脑屏障的脂质体，还涉及一种以该脂质体为载体的药物组合物及其制备方法。具体涉及一种含血脑屏障锚点的脂质体，和一种以该脂质体为载体包被有治疗中枢神经系统有效量的药物的药物组合物及其制备方法。该药物组合物具有较长的血循环时间并能主动透过血脑屏障进入中枢神经系统达到治疗中枢神经系统疾病的作用。

背景技术

血脑屏障(blood-brain barrier，简称BBB)是由毛细血管内皮细胞形成的血液与脑组织间的屏障。它为脑组织提供了一个相对稳定的内环境，保障了脑袋正常功能。但是由于BBB的存在使得95％的药物无法从血液进入脑组织，特别是一些亲水性，大分子药物，因此多数中枢神经系统药物都难以透过血脑屏障达到理想的治疗效果，一些脂溶性小分子(Mw小于500D)虽然容易透过BBB，但很快又被细胞膜上的高效外排泵摄入血液中(Begley DJ.The blood-brain barrier：principles for targeting peptides and drugs to the central nervous system[J].J Pharm Pharmacol.1996，48(2)：136-146.)。因此，对于中枢神经系统疾病，发现一种能透过BBB的有效药物传递方法与发现一种新药同等重要。

为了克服BBB，已报道了不少方法，如：(1)通过造成血液高渗而使脑毛细血管内皮细胞紧密连接瞬时开放，屏障作用消失；(2)将药物做成适宜的亲脂性前体药物；(3)使用聚氰基丙烯酸酯(PACA)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等材料的纳米粒作为载体将药物送入脑内；(4)以免疫脂质体为载体，脂质体表面的单克隆抗体与BBB上相应的受体发生特异性结合，启动受体介导的胞吞转运，从而使药物透过BBB；(5)改变给药途径，例如通过鼻腔给药等。但是方法(1)可能使一些有毒有害物质在紧密连接瞬时开放期间入脑，影响中枢神经系统功能，方法(2)由于高效外排泵的存在作用不大，方法(3)尚处于研究阶段，且制备工艺复杂，设备条件要求高，而方法(4)则因脂质体稳定性较差和成本昂贵而不适合进行普遍应用(KREUTER J，ALYAUTDIN RN，KHARKEVICH DA，et al.Passage of peptides through theblood-brain barrier with colloidal polymer particles(nanoparticles)[J].Brain Res，1995，647(1)：171-174.；SCHRODER U，SABEL BA..Nanoparticles，a drug carrier system to pass the blood-brain barrier，permit central analgesic effects of iv dalargin injections[J].BrainRes，1996，710(122)：121-124.)。研究发现，在BBB中存在有吸收胶体类物质的运输系统，因此有研究者据此设计了一些药物的胶体载体，如纳米粒和脂质体等，希望能通过该胶体载体使药物透BBB而入脑(A.Prokop.Bioartificial organs in the twenty-first century：nanobiological devices.Ann.NY Acad.Sci.2001，944：472-490.)。然而，此类胶体载体经注射入血后会被网状内皮系统(RES)当作异源物质迅速清除，主要是被肝、脾的巨噬细胞吞噬。如普通脂质体在血液中半衰期仅5～15min，带负电脂质体半衰期更短。

综上结论，药物载体为了能实现把药物透BBB入脑，就必须满足这几个要求：第一，增强载体在血液中的稳定性，防止被血清蛋白等吸附和破坏；第二，避免RES的清除作用，延长载体在血液循环时间；第三，具有和BBB特异结合作用并主动渗透入脑；第四，入脑后能迅速和中枢神经细胞融合而释放药物分子产生治疗作用。脂质体是一种首选的传递系统，普通脂质体的优势是血浆中较稳定，可全身用药。同时也发展出长循环脂质体，可明显延长全身循环时间，如美国专利US4837028公开的聚乙二醇化脂质体等。由此可见，可在普通脂质体基础上设计一种可满足上述要求的可透BBB的中枢神经系统药物载体。

GM1是迄今为止被证明能透过BBB的少数糖脂分子之一，它已被用于中枢神经系统的损伤和修复，是一种重要的神经修复因子(WellsJM，Ventura RF，Eisenhauer PB，McKenna DC，Fine RE，Ullman MD.Transportof GM1 and GM1 inner ester across an in vitro model of the blood-brainbarrier.Neurosci Lett.1996.217：121-1244.)。同时GM1也是一种可用于制备脂质体的重要脂类(Shoko Yokoyama，Tadahiro Takeda，Masahiko Abe，Preparation of ganglioside GM1 liposomes and their membrane properties.Colloids Surf.B：Biointerfaces.2002，27：181-187.)。同时还有研究表明，红细胞、血小板和淋巴细胞能在血液中稳定存在而不被当作异源物质被RES清除，其膜表面神经节苷脂的唾液酸和糖蛋白等起到了重要作用，去除唾液酸基团的红细胞、血小板和淋巴细胞会被肝脏迅速清除，因此唾液酸分子在RES清除过程中具有明显抗识别作用(Durocher JR，Payne RC，Conrad ME.Role of sialic acid in erythrocytesurvival.Blood.1975，45(1)：11-20.)，因此含唾液酸的GM1的脂质体也能够有效地减少RES的清除作用而延长血循环时间，同时在血清中很稳定。

现在已有不少文献报道了一种可促进细胞间融合的脂类物质，即N-乙酰磷脂酰乙醇胺。研究表明，在脂质体中参入N-棕榈酰磷脂酰乙醇胺(NPPE)或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NSPE)不仅能增加脂质体膜稳定性，更能促进脂质体与细胞融合，从而把脂质体内药物释放到细胞内(J.C.Domingo，M.Mora，and M.A.De Madariaga.Incorporationof N-acylethanolamine pohospholipids into egg phosphatidylcholinevesicles：characterization and permeability properties of the binarysystems.Biochim.Biophys.Acta.1993.1148：308-316)。

常见的脂质体制备方法，包括薄膜水化法、有机溶剂置换法、去垢剂去除法和乙醇注射法等。有些方法已用于工业化生产。但这些方法所得的脂质体大部分不适合过滤、不稳定、不能很好去除残留有机溶剂，同时也很难获得适合注射和具有较好生物利用度的均匀脂质体。因此迫切需要建立可放大、稳定、便于无菌处理同时粒径均匀和费用低廉的脂质体制备方法。

发明内容

本发明的目的之一是提出一种可透血脑屏障的脂质体，使其能作为中枢神经系统药物载体，具有明显透过血脑屏障进入中枢神经系统的作用，以满足医疗领域的需要；

本发明的目的之二是提出一种以上述可透血脑屏障的脂质体为载体的药物组合物，使其能透过血脑屏障入脑达到治疗中枢神经系统疾病的作用；

本发明的目的之三是提出上述药物组合物的制备方法。

本发明的发明目的之一是通过选用一种含有5～15％摩尔含量血脑屏障锚点的脂质体实现的。

进一步说，上述脂质体中含有：

高相变温度磷脂      50～70％(摩尔含量)

胆固醇              10～30％(摩尔含量)

血脑屏障锚点        5～15％(摩尔含量)

助融剂                15～25％(摩尔含量)

所述的高相变温度磷脂为神经鞘磷脂(简称SM，下同)和中性合成磷脂。其中所述的中性合成磷脂可以为二棕榈酰磷脂酰胆碱(简称DPPC，下同)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(简称DSPC，下同)或二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(简称DMPC，下同)，均为符合cGMP要求的产品，可采用Lipoid公司的产品；

所述胆固醇为符合cGMP的产品，可采用Lipoid公司产品；

所述血脑屏障锚点为单唾液酸四己糖神经节苷脂(简称GM1，下同)和GM1金属盐，为一个低聚糖与神经鞘胺醇和一个唾液酸分子通过葡萄糖苷键相连得到的化合物，可采用Folch，J.，Lees，M.B.，and Sloane Stanley，G.H.等在(1957)J.Biol.Chem.226，497-509.文献报道方法制备，GM1的结构式为：

本发明优选GM1钠盐作为血脑屏障锚点。GM1钠为糖脂类分子，可作为脂类材料参入脂质体膜中，通过与血脑屏障上特异性GM1受体结合而主动透过血脑屏障进入中枢神经系统中。

所说的助融剂为N-乙酰磷脂酰乙醇胺。

所说的N-乙酰磷脂酰乙醇胺可以为N-棕榈酰磷脂酰乙醇胺(简称NPPE，下同)或N-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(简称NSPE，下同)，本发明优选NPPE作为助融剂。

上述脂质体粒径范围为0.05～0.5μm。

本发明的发明目的之二是通过如下技术方案实现的，一种利用上述可以透过血脑屏障的脂质体为载体的药物组合物，其特征在于，该药物组合物中含有治疗中枢神经系统有效量的药物。

进一步说，上述作为载体的脂质体，包被了治疗有效量的中枢神经系统药物。

所述治疗中枢神经系统有效量的药物可以为甲钴胺、胞磷胆碱钠或神经生长因子(简称NGF)。

目前，超过95％的神经系统药物不能通过血脑屏障直接进入中枢神经系统，因此不能达到很好的治疗作用，诸如NGF类蛋白大分子就更不易进入中枢神经系统了。本发明所述的含血脑屏障锚点的脂质体具有以下优势(以血脑屏障锚点为GM1举例)：

1.延长在血液中循环时间，这是因为GM1中唾液酸分子在网状内皮系统(简称RES，下同)清除过程中具有明显抗识别作用，因此在血液中具有更长的循环时间，这就增加了脂质体透过血脑屏障的机会，达到一种长效的作用。

2.增加了血脑屏障的靶向性，这是因为脂质体表面参入的GM1可与血脑屏障特殊受体结合而主动通过血脑屏障。

3.促进细胞对药物分子的利用，这是因为助融剂可促进脂质体与细胞融合，从而使药物分子迅速释放入细胞中。

这些关键优点可以对中枢神经系统疾病产生更好的治疗效果，提高药物的生物利用度和临床适应症范围。

本发明所述利用可以透过血脑屏障的脂质体为载体的药物组合物制剂可采用逆相蒸发法结合高压过滤法进行制备，包括如下步骤：

(1)按脂质体摩尔含量百分比称取各种脂类，高相变温度磷脂50～70％，胆固醇10～30％，血脑屏障锚点5～15％，助融剂15～25％，用脂质体5～10倍体积的溶剂将上述脂类溶解为清澈溶液，所述溶剂为氯仿、甲醇或二者混合；

(2)上述溶液置旋转蒸发烧瓶中，减压蒸发蒸干溶剂，得一层附着在蒸发烧瓶壁的脂膜；

(3)取上述步骤(2)含脂膜烧瓶，充氮，以下至步骤(6)操作一直保持充氮，加入有机溶剂溶解脂类至脂类终浓度为100μm/ml，成为有机相溶液，所述有机溶剂为乙醚、二乙醚、氯仿、四氢呋喃或异丙醚；

(4)取治疗中枢神经系统有效量的药物配为药物浓度为0.05～50mg/ml水相溶液；

(5)混合有机相溶液和水相溶液，有机相溶液和水相溶液混合时体积比为2∶1～6∶1，超声处理；

(6)将步骤(5)中的混合溶液置旋转蒸发烧瓶中，室温减压蒸干至凝胶状；再加等体积水相减压蒸发至样品为悬液，结束充氮；

(7)所得样品置高压匀浆挤压器处理并通过微孔滤膜过滤得均匀粒径脂质体。

(8)脂质体样品采用离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法或超速离心法进行分离纯化，使游离主药和脂质体分离。

(9)纯化脂质体保持与内水相等渗条件，于等渗缓冲中进行制剂，制备成注射液或冻干剂。

其中，步骤(7)中微孔滤膜孔径优选为0.2～0.5μm，高压匀浆压力优选为50～500psi。

经体外血脑屏障模型试验验证和体内血清和脑组织分布试验验证，与未包被药物相比，经本发明所述脂质体包被的中枢神经系统药物具有明显透过血脑屏障的作用，而且在血液中循环时间明显延长。

附图说明

图1是NGF脂质体用1ml含1％Triton X-100的溶液溶解后取20ul样品测定所得色谱图。

图2是NGF脂质体用1m注射用水溶解并高速离心后取上清样品20ul测定所得色谱图。

图3是NGF脂质体血浆中考察趋势曲线。

图4是NGF和NGF脂质体在体外血脑屏障模型中通透性比较。

图5是¹²⁵I-NGF组在体内血清、肝脾和脑组织分布比较图。

图6是¹²⁵I-NGF脂质体组在体内血清、肝脾和脑组织分布比较图。

具体实施方式

实施例1：含GM1钠盐的脂质体为载体，包被NGF的药物组合物

按脂质体摩尔含量百分比称取各种脂类，DMPC 50％，CH 20％，GM1钠盐10％，NPPE 20％，其中，DMPC、NPPE和CH购至Lipoid公司，GM1钠盐为自己纯化所得。用脂质体5倍体积的溶剂(氯仿∶甲醇，体积比2∶1)溶解为清澈溶液。上述溶液置旋转蒸发烧瓶中，减压蒸发蒸干溶剂，为一层附着在蒸发烧瓶壁的脂膜。取含脂膜烧瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有机溶剂(乙醚)至脂类终浓度为100μm/ml，溶解清澈后为有机相溶液。取神经生长因子，溶解在10mMNaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4的缓冲液中，终浓度为0.1mg/ml即为水相溶液。按有机相∶水相，体积比4∶1比例混合二者，超声处理，5min/4℃。将上述混合溶液置旋转蒸发烧瓶中，20℃/10～50mmHg至凝胶状；再加等体积水相30℃/10～50mmHg/15min蒸发至样品为悬液，结束充氮。上述脂质体样品置高压匀浆挤压器处理，滤膜选用0.45μm，压力100psi，循环3次。上述样品根据过CM SepharoseFast Flow阳离子交换层析介质，让脂质体样品在该条件下通过层析介质，脂质体透过，游离NGF吸附在介质上，达到游离主药和脂质体分离。纯化脂质体样品用10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4悬浮稀释至合适浓度，加入4％甘露醇后分装冻干，得冻干剂。

实施例2：含GM1钠盐的脂质体为载体，包被甲钴胺的药物组合物

按脂质体摩尔含量百分比称取各种脂类，DMPC 50％，CH 30％，GM1钠盐5％，NPPE 15％，其中，DMPC、NPPE和CH购至Lipoid公司，GM1钠盐为自己纯化所得。用脂质体7.5倍体积的溶剂(氯仿∶甲醇，体积比1∶1)溶解为清澈溶液。上述溶液置旋转蒸发烧瓶中，减压蒸发蒸干溶剂，为一层附着在蒸发烧瓶壁的脂膜。取含脂膜烧瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有机溶剂(二乙醚)至脂类终浓度为100μm/ml，溶解清澈后为有机相溶液。取甲钴胺，溶解在注射用水中，终浓度为10mg/ml即为水相溶液。按有机相∶水相，体积比6∶1比例混合二者，超声处理，5min/4℃。将上述混合溶液置旋转蒸发烧瓶中，20℃/10～50mmHg至凝胶状；再加等体积水相30℃/10～50mmHg/15min蒸发至样品为悬液，结束充氮。上述脂质体样品置高压匀浆挤压器处理，滤膜选用0.5μm，压力50psi，循环3次。上述样品过凝胶过滤色谱柱，达到游离主药和脂质体分离。纯化脂质体样品用10mMNaCL，10mM PB，pH 6.8悬浮稀释至合适浓度，加入5％甘露醇后分装，得注射液。

实施例3：含GM1钠盐的脂质体为载体，包被胞磷胆碱钠的药物组合物

按脂质体摩尔含量百分比称取各种脂类，DMPC 60％，CH 10％，GM1钠盐5％，NPPE 25％，其中，DMPC、NPPE和CH购至Lipoid公司，GM1钠盐为自己纯化所得，用脂质体10倍体积的溶剂(氯仿)溶解为清澈溶液。上述溶液置旋转蒸发烧瓶中，减压蒸发蒸干溶剂，为一层附着在蒸发烧瓶壁的脂膜。取含脂膜烧瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有机溶剂(四氢呋喃)至脂类终浓度为100μm/ml，溶解清澈后为有机相溶液。取胞磷胆碱钠，溶解在注射用水中，终浓度为2.5mg/ml即为水相溶液。按有机相∶水相，体积比2∶1比例混合二者，超声处理，5min/4℃。将上述混合溶液置旋转蒸发烧瓶中，20℃/10～50mmHg至凝胶状；再加等体积水相30℃/10～50mmHg/15min蒸发至样品为悬液，结束充氮。上述脂质体样品置高压匀浆挤压器处理，滤膜选用0.2μm，压力500psi，循环3次。上述样品经超速离心，达到游离主药和脂质体分离。纯化脂质体样品用10mM NaCL，10mM PB，pH 6.8悬浮稀释至合适浓度，加入5％甘露醇后分装，得注射液。

实施例4：含GM1钠盐的脂质体为载体，包被NGF的药物组合物

按脂质体摩尔含量百分比称取各种脂类，DMPC 60％，CH 15％，GM1钠盐15％，NPPE 10％，其中，DMPC、NPPE和CH购至Lipoid公司，GM1钠盐为自己纯化所得。用脂质体5倍体积的溶剂(甲醇)溶解为清澈溶液。上述溶液置旋转蒸发烧瓶中，减压蒸发蒸干溶剂，为一层附着在蒸发烧瓶壁的脂膜。取含脂膜烧瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有机溶剂(异丙醚)至脂类终浓度为100μm/ml，溶解清澈后为有机相溶液。取神经生长因子，溶解在10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH7.4的缓冲液中，终浓度为0.8mg/ml即为水相溶液。按有机相∶水相，体积比6∶1比例混合二者，超声处理，5min/4℃。将上述混合溶液置旋转蒸发烧瓶中，20℃/10～50mmHg至凝胶状；再加等体积水相30℃/10～50mmHg/15min蒸发至样品为悬液，结束充氮。上述脂质体样品置高压匀浆挤压器处理，滤膜选用0.2μm，压力300psi，循环3次。上述样品根据过CM Sepharose Fast Flow阳离子交换层析介质，让脂质体样品在该条件下通过层析介质，脂质体透过，游离NGF吸附在介质上，达到游离主药和脂质体分离。纯化脂质体样品用10mM NaCL，10mM Tris-Cl，pH 7.4悬浮稀释至合适浓度，加入4％甘露醇后分装冻干，得冻干剂。

实施例5：含GM1钠盐的脂质体为载体，包被胞磷胆碱钠的药物组合物

按脂质体摩尔含量百分比称取各种脂类，DMPC 70％，CH 10％，GM1钠盐5％，NPPE 15％，其中，DMPC、NPPE和CH购至Lipoid公司，GM1钠盐为自己纯化所得。用脂质体10倍体积的溶剂(氯仿∶甲醇，体积比1∶1)溶解为清澈溶液。上述溶液置旋转蒸发烧瓶中，减压蒸发蒸干溶剂，为一层附着在蒸发烧瓶壁的脂膜。取含脂膜烧瓶，充氮(以下操作一直保持充氮)，加入有机溶剂(氯仿)至脂类终浓度为100μm/ml，溶解清澈后为有机相溶液。取胞磷胆碱钠，溶解在注射用水中，终浓度为4mg/ml即为水相溶液。按有机相∶水相，体积比4∶1比例混合二者，超声处理，5min/4℃。将上述混合溶液置旋转蒸发烧瓶中，20℃/10～50mmHg至凝胶状；再加等体积水相30℃/10～50mmHg/15min蒸发至样品为悬液，结束充氮。上述脂质体样品置高压匀浆挤压器处理，滤膜选用0.2μm，压力250psi，循环3次。上述样品经超速离心，达到游离主药和脂质体分离。纯化脂质体样品用10mM NaCL，10mM PB，pH 6.8悬浮稀释至合适浓度，加入5％甘露醇后分装，冻干，得冻干剂。

本申请人对本发明所述包被NGF的药物组合物(NGF脂质体)作了如下性质研究和效果验证：

1、性质研究

(1)NGF含量测定

取1支NGF脂质体冻干粉，加0.9ml注射用水溶解，再加入0.1ml10％Triton X-100，振荡混匀后离心取上清液作为含量测定样品溶液。取NGF原液，配制成不同浓度的NGF标准溶液。用Shodex PROTEINKW-82.5凝胶色谱柱对标准溶液和样品溶液进行分析，根据标准溶液色谱结果计算样品溶液中NGF浓度。结果如表1，峰面积与蛋白浓度线形回归方程为“C(μg/ml)＝0.0004A-1.2691，R²＝0.9984”，经计算，NGF主药含量为77.8μg/ml。

表1高效液相法测定NGF脂质体主药含量结果

  样品  NGF标准溶液(μg/ml)  供试品  6.25  12.5  25  50  100  A  18147  36470  70050  121461  250101  197672

(2)形态和粒度分布测定

取少量脂质体，用1％磷钨酸负染，透射电镜观察。可见参入GM1和NPPE的脂质体包被NGF后形态未改变，且分布均匀，呈典型的指纹结构。经激光粒度散射仪测定脂质体平均粒径为97.3±10.4nm。

(3)包封率测定

取2支NGF脂质体冻干粉，其中1支照“含量测定”方法测定NGF总量；另1支加1.0ml注射用水溶解，高速离心后取上清液同法测定NGF含量，计算脂质体的包封率。经计算，NGF含量为77.36μg/ml，离心上清中NGF含量为2.55μg/ml，NGF脂质体包封率为96.7％。图1和图2分别为NGF脂质体含量测定样品和高速离心后上清样品HPLC色谱图。

(4)渗漏率测定

取NGF脂质体，分别于4℃和37℃放置，然后在不同时间点取样进行渗漏率测定，根据渗漏率确定NGF脂质体稳定性和存放条件，测定结果见表2和表3。结果显示，在4℃条件下，NGF脂质体稳定性很好，放置12个月时渗漏率低于5％。但在37℃条件下不能长期保存，放置1个月渗漏率就超过5％，放置3个月达到17.5％。

表2NGF脂质体渗漏率测定结果(4℃)

  考察时间(月)  1  3  6  12  渗漏率(％)  2.5  2.7  3.0  3.5

表3NGF脂质体渗漏率测定结果(37℃)

  考察时间(月)  0.5  1  2  3  渗漏率(％)  4.7  5.2  8.8  17.5

(5)相变温度测定

取NGF脂质体，用注射用水溶解后用电导法测定脂质体相变温度，结果为38.3±0.9℃。

(6)血浆中稳定性测定

取NGF脂质体，加入1.0ml人血浆后于透析管37℃孵育，测定24小时内渗漏情况，测定方法为在不同时间点取样高速离心后取上清进行凝胶高效液相分析，测定NGF脂质体渗漏率。测定结果见表4。结果显示，NGF脂质体在血浆中稳定性很好，24小时内渗漏率低于5％。图2为NGF脂质体血浆中稳定性趋势曲线。

表4NGF脂质体血浆中渗漏率考察测定结果(37℃)

  考察时间  (h)  0  3  6  12  24  NGF  (ug/ml)  2.3  2.7  4.0  4.5  4.7

(7)有机溶剂残留

取NGF脂质体，用气相色谱法测定样品溶液中氯仿、甲醇、乙醚残留量，测定结果见表5。结果显示，NGF脂质体有机溶剂残留量很低，符合中国药典相关规定。

表5NGF脂质体有机溶剂残留量测定结果

  有机溶剂  甲醇  氯仿  乙醚  残留量(ppm)  17  23  14

2、NGF脂质体在血脑屏障体外模型中通透性测定

根据参考文献(Wells JM，Ventura RF，Eisenhauer PB，McKennaDC，Fine RE，Ullman MD.Transport of GM1 and GM1 inner esteracross an in vitro model of the blood-brain barrier.NeurosciLett.1996.217：121-1244.)方法培养牛脑内皮细胞形成血脑屏障体外模型。细胞培养至汇合后取NGF脂质体和NGF原液，分别用试验用培养基稀释为1.0μg/ml，各取1ml加入1个供试池，受试池中加入试验用培养基2ml，使细胞插入器内外液面相平，以消除液面差产生的静压力对通透性的影响。然后在24小时内于不同时间点从受试池取样50μl，取样结束后用NGF酶联免疫试剂盒测定所取样品NGF含量。测定结果见表6。结果显示，与NGF原液相比，NGF脂质体具有明显透过血脑屏障的作用。图4显示NGF溶液和NGF脂质体透过血脑屏障模型的趋势。

表6体外血脑屏障模型对NGF溶液和NGF脂质体通透性测定结果

  时间(h)  0  3  6  12  24  NGF溶液   (ng/ml)  NGF脂质体  (ug/ml)   0    0   4.5    127   10    332   15    589   17    760

3、NGF脂质体在体内血清、肝脾和脑组织中分布测定

取NGF原液，根据参考文献(Poduslo JF，Curran GL，Dyck PJ.Increase in albumin，IgG，and IgM blood-nerve barrier indices in human diabeticneuropathy[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85(13)：4879-4883.)叙述方法，采用氯胺T法标记NGF制备¹²⁵I-NGF，。按实施例2方法制备¹²⁵I-NGF脂质体。

取SD雄性大鼠40只，均分为两组，即¹²⁵I-NGF溶液组和¹²⁵I-NGF脂质体组。用15％乌拉坦麻醉后分离其单侧颈动脉和股静脉，颈动脉近心端结扎，远心端做颈动脉插管。股静脉给药，剂量为¹²⁵I-NGF 0.5μg/g。分别于给药后15，30和60min从插管处取血1mL，然后用蠕动泵灌注生理盐水20min，最后剪断对侧颈动脉，继续灌流15min，以此消除脑毛细血管中残留的药物对脑组织分布的影响。血样3000×g离心5min得到血清，用γ-计数仪测定放射活性；同时也于给药后15，30和60min处死大鼠，取肝脾和脑组织用0.5％Triton X-100匀浆后经10,000×g离心10min，取上清液测定放射活性。测定结果见表7。结果显示，¹²⁵I-NGF组放射活性主要分布于血液和肝脾中，脑组织含量甚微，血药浓度迅速下降，主要被肝脾吸收；而¹²⁵I-NGF脂质体组一直维持较高的血药浓度，肝脾吸收甚微，主要被脑组织吸收。由此可明显反映¹²⁵I-NGF脂质体具有较长血循环时间和透血脑屏障入脑的作用。

表7NGF和NGF脂质体体内血清、肝脾和脑组织分布测定结果

  样品  ¹²⁵I-NGF脂质体总放射活性(cmp)  ¹²⁵I-NGF脂质体总放射活性(cmp)  15min  30min  60min  15min  30min  60min  血清  肝脾  脑  68779  19987  4665  38862  43325  7884  10043  72231  6997  69331  2821  14458  48877  4987  26679  39931  7033  43328