人免疫缺陷病毒流行毒株的脱氧核糖核酸低密度芯片基因分型检测法

摘要

本发明提供一种快速鉴别人类免疫缺陷病毒(HIV)流行毒株基因分型的方法，特别适宜基层普及使用的人免疫缺陷病毒流行毒株的脱氧核糖核酸低密度芯片(DNA macroarray)基因分型的检测方法。通过从HIV－1抗体阳性标本中提取HIV前病毒DNA，使用HIV－1型共用引物进行多聚酶链反应(PCR)扩增，同时技术性地设计一条型特异性的探针，然后通过制作脱氧核糖核酸低密度芯片，鉴别标本HIV亚型。利用该方法可简便快速、灵敏特异、易于普及地鉴别HIV－1型。可以用于实验室诊断、临床诊断、药物治疗效果评价、流行病学调查，以便于采取有效的预防控制措施，控制艾滋病疫情在我国迅速蔓延，适宜基层普及使用的检测方法，具有较大的推广价值。

说明书

技术领域

本发明是一种简便快速鉴别人类免疫缺陷病毒(HIV)流行毒株基因分型的方法，特别适宜基层普及使用的HIV流行毒株的脱氧核糖核酸低密度芯片(DNAmacroarray)基因分型检测方法。

背景技术

在HIV在全球迅速蔓延的现状下，使人们更加迫切地认为，寻求有效的治疗和预防方法成为当务之急。目前预防性疫苗的研发虽有进行临床试验，但其前景尚不乐观。因此，快速有效地检测诊断方法愈加成为控制艾滋病流行的关键。

HIV基因的高度变异性，使HIV在全球的传播过程中产生许多相对独立的基因亚型(subtype)，并呈一定的地区性分布。根据HIV-1基因组中的核苷酸和氨基酸序列的同源性，目前把HIV划分为M、O和N三个组，其中M组有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K等11个亚型，O组有O亚型和N组有N亚型。我国现在已报道确定的流行病毒株有A、B、B′、C、E、F六种亚型和三种重组毒株：A/E和两种不同的B/C，其中两种不同的B/C重组株为中国所特有，但目前仍以B、C、E型为主。HIV-1毒株间的区别都可归结为env基因的变异，其核苷酸在同一亚型中变异率为7％～15％，不同亚型间变异可达30％，不同亚型间膜蛋白V3区氨基酸序列的变异率为50％以上。随着HIV-1不断的变异和重组及高危人群的不断流动，我国还会出现新的亚型和重组毒株。

现在对HIV的检测方法主要是使用血清学方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹试验等，但由于HIV的高度变异性，各亚型的抗原决定簇部位刺激机体产生特异性抗体有一定差异，由此不同的抗原抗体而产生血清学检测假阴性。此外，不同厂家的诊断试剂检测的灵敏度有所不同，对不同基因型抗体的检测无明显差异，对非B亚型检测效果不好。

发明内容

本发明的目的是针对性地研制出一种易于基层普及使用的简便、特异、敏感的HIV流行毒株的脱氧核糖核酸低密度芯片(DNA macroarray)基因分型检测法，以该方法替代血清学检测法和繁琐的wester bolt法，提高HIV亚型准确度，简化检测工序，缩短检测时间。

本发明涉及一种HIV流行毒株的DNA macroarray基因分型检测法，是根据我国主要流行毒株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC亚型，通过从HIV-1抗体阳标本中提取HIV前病毒DNA，针对性地选择适当正向引物并自行设计反向引物，合成HIV-1型共用引物进行多聚酶链反应(PCR)扩增，并技术性地设计特异性的探针，在尼龙膜上制作DNA macroarray，点样鉴定标本的HIV亚型。经过引物设计合成、PCR扩增、电泳检测、核酸扩增的结果判断、探针设计及5′-三磷酸-2′-脱氧胸苷(dT)加尾、DNA Macroarray制作、从而获取检测鉴别结果。该方法可以用于实验室诊断、临床诊断、药物治疗效果评价、流行病学调查。

DNA macroarray是指用点样方法将大量生物大分子如核酸片段等生物样品有序地固化尼龙膜载体的表面上，组成二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过对杂交信号的强度进行快速高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的有无或者数量多少。

具体步骤如下：

1、引物设计合成

参考HIV-1 B、C、CRF01-AE、CRF07-BC序列，选用适当正向引物和自行设计反向引物，为HIV-1共用引物。PCR扩增引物及其序列如下：

Gag-F2(HXB2 790-814)：5′-atg ggt gcg aga gcg tca gta tta a-3′，

Gag-e4(HXB2 1093-1075)：5′Bio-cta agg ctt ctt tgg tgt c-3′，并在其5′端标记生物素(Bio)。

2、PCR扩增条件

采用25μl PCR反应体系，包括：10×PCR buffer 2.5μl，25mM MgCl₂ 2.5μl，0.2mM dNTP0.5μl，Primer F2 0.5μl，Primer e4 0.5μl，Taq酶1U(0.2μl)/人，DNA 4μl/次，扩增采用PTC-200型扩增仪。94℃ 3min预变性，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 45sec，35个循环，72℃延伸5min。

3、电泳检测

取扩增产物10μl，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5μl/ml溴化乙锭)中电泳检测。

4、核酸扩增的结果判断

核酸扩增产物于紫外检测仪上观察，在304bp处可见特异性阳性条带。

5、探针设计及dT加尾

四种亚型的探针分别为：

HIV-1 subtype B Probe  5′-gga gct aga acg att cgc agt taa tcc tggc-3′

HIV-1 subtype C Probe 5′-ggg aag gaa aca cta tat gtt aaa aca-3′

HIV-1 subtype BC Probe 5′-caa cac agt agc aac tct cta ttg tgt ac-3′

HIV-1 subtype E Probe 5′-tac agt agc aac cct ctg gtg cgt ac-3′

将探针B、C、BC、E四种探针分别加尾，dT加尾操作步骤如下：probe 15μl，5×TdT buffer 20μl，d TTP 80-110nM 2μl，TdT 60-80U 3μl，将上面的液体充分混合均匀后置于37℃60-90min。加入100μl的10mM EDTA终止反应。

6、DNA macroarray制作

将加尾后的探针点于尼龙膜上，用UV固定30min。加入6×SSC-0.5％SDS在45℃中漂洗，尼龙膜用SSPE润湿。将润湿的尼龙膜加入预杂交液预杂交。样品处理为95℃水浴后马上放至冰浴，加PCR反应产物10μl，进行杂交，清洗后加亲和素标记的碱性磷酸酶，室温低速摇荡，清洗3次加BCIP/NBT底物显色。

7、获取的检测鉴别结果

结果显示：HIV-1 B、C、CRF07-BC、CRF01-AE四种亚型分别被相应的探针显示阳性反应。

目前，用于HIV-1病毒分型研究主要使用血清学分析或序列分析方法，前者准确性不高，部分亚型难以区分，后者虽然准确，但需要昂贵的核酸测序仪器设备及试剂，操作过程复杂，不易普及。我们建立的DNA macroarray分型技术，用于HIV-1病毒基因分型具有以下特点：(1)灵敏度高。该法通过核酸扩增使病毒检测的灵敏度提高，相对于病毒血清学方法分型具有更灵敏及时的特点。(2)准确度高，特异性强。用标记核酸探针与特异的靶序列结合，因而更准确特异。从说明书附图中可以看出，具有高度的型特异性，如HIV-1NV Jurkat样本只在B亚型探针斑点处发生杂交反应，见图3；HIV-1 C亚型(质粒)、CRF07-BC型标本和CRF01-AE标本也只与相对应的探针斑点C、BC和E显示阳性反应。(3)操作简单、结果易辨，易于普及。制作阵列简单易行，在同一张尼龙膜上制作成4个点的阵列，则可同时进行4个亚型的分析，如果需要可制作成12个点的阵列，则可同时作12个亚型的分析。在判断结果时不需要特殊的仪器，可凭肉眼观察，普通实验室就可以自行操作，而无需高昂的仪器设备。因此，DNAmacroarray方法用于HIV-1亚型的基因分型，准确、简单、快速，易行，适宜基层特别是贫困地区的HIV亚型分布的流行病学调研和筛查，便于采取有效的干预防治措施，控制艾滋病疫情在我国迅速蔓延，具有较大的推广价值。

附图说明

图1阴性对照

图2HIV-1NV Jurkat(为HIV-1 B亚型病毒株)

图3HIV-1 C亚型(质粒)

图4CRF07-BC型标本

图5CRF01-AE标本

从说明书附图中可以看出，具有高度的型特异性，如HIV-1NV Jurkat样本只在B亚型探针斑点处发生杂交反应，见图3；HIV-1 C亚型(质粒)、CRF07-BC型标本和CRF01-AE标本也只与相对应的探针斑点C、BC和E显示阳性反应，证实DNA macroarray可用于HIV-1病毒基因分型。

具体实施方式

以下非限制性实施例旨在更加详细地阐释本发明，而不以任何方式限制本

发明的范围。

实施例：

样品选用：HIV-1NV Jurkat(为HIV-1 B亚型病毒株)来自于浙江澳亚生物工程研究院；HIV-1 C亚型病毒株(质粒)为中国疾病预防控制中心性病艾滋病中心惠赠；CRF01-AE、CRF07-BC标本，来自河南省等地进行研究样品交流时获得的DNA样品。

步骤如下：

1、试剂：

Taq酶、dNTPs购自上海生工生物工程有限公司；引物为自行设计后由上海生工生物工程有限公司合成。

2、核酸提取：

使用v-gene公司病毒DNA制备试剂盒，按说明书操作提取DNA，核酸样品冻存于-20℃。

3、核酸的体外扩增：

根据我国主要流行株为B、C、CRF01-AE、CRF07-BC，选用适当正向引物并自行设计反向引物，为HIV-1共用引物。PCR扩增引物及其序列如下：

Gag-F2(HXB2 790-814)：5′-atg ggt gcg aga gcg tca gta tta a-3′，

Gag-e4(HXB2 1093-1075)：5′Bio-cta agg ctt ctt tgg tgt c-3′，并在其5′端标记生物素(Bio)。

采用25μl PCR反应体系，包括：10×PCR buffer 2.5μl，25mM MgCl₂2.5μl，0.2mM dNTP0.5μl，Primer F₂0.5μl，Primer e4 0.5μl，Taq 酶1U(0.2μl)/次，DNA 4μl/次，扩增采用PTC-200型扩增仪。94℃ 3min变性，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 45sec，35个循环，72℃延伸5min。取扩增产物10μl，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5μl/ml溴化乙锭)中电泳30min后，置于紫外检测仪上观察特异性条带，并记录实验结果。

探针设计及dT加尾：

4、四种亚型的探针分别为：

HIV-1 subtype B Probe  5′-gga gct aga acg att cgc agt taa tcc tggc-3′

HIV-1 subtype C Probe  5′-ggg aag gaa aca cta tat gtt aaa aca-3′

HIV-1 subtype BC Probe 5′-caa cac agt agc aac tct cta ttg tgt ac-3′

HIV-1 subtype E Probe 5′-tac agt agc aac cct ctg gtg cgt ac-3′

将探针B、C、BC、E四种探针分别加尾，dT加尾操作步骤如下：probe15μl，5×TdT buffer 20μl，d TTP 80-110nM 2μl，TdT 60-80U 3μl，将上面的液体充分混合均匀后置于37℃ 60-90min。加入100μl的10mM EDTA终止反应。

5、DNA macroarray制作与检测：

将加尾后的探针点于尼龙膜上，用UV固定30min。加入6×SSC-0.5％SDS在45℃中漂洗，尼龙膜用SSPE润湿。将润湿的尼龙膜加入预杂交液预杂交。样品处理为95℃水浴后马上放至冰浴，然后取PCR反应产物10μl，进行杂交，清洗后加亲和素标记的碱性磷酸酶，室温低速摇荡，清洗3次加BCIP/NBT底物显色。

6、结果

DNA macroarray检测结果

图1～图5结果显示：HIV-1 B、C、CRF07-BC、CRF01-AE四种亚型分别被相应的探针所显示，证实DNA macroarray可用于HIV-1病毒基因分型。