人早胚来源的表皮或毛囊干细胞的制备及应用

摘要

本发明涉及干细胞及基因工程技术领域。皮肤创面的覆盖和表皮细胞的再生是治疗皮肤损伤的关键，随着干细胞研究的深入，人们尝试进行细胞移植来治疗皮肤创伤，但是成体来源的表皮干细胞增殖缓慢，培养条件苛刻。本发明的目的在于克服成体表皮干细胞增殖缓慢的问题，提供一种可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干细胞的方法及其应用。本发明将含EGF的重组表达载体转染人胚源性间充质干细胞(hMSC)，并在转染过程中用一定浓度的钙离子刺激，分化为典型的表皮细胞。在裸鼠皮下微环境诱导下，分化为皮肤相关组织的细胞，直接参与了裸鼠毛发的再生。本发明可获得增殖相对迅速的人胚源性表皮(毛囊)干细胞，对临床皮肤创伤治疗方面有巨大的应用潜能。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞及基因工程技术领域，具体涉及一种可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干细胞的方法及其应用。

背景技术

皮肤是人体的最大器官，因处在体表，急易受到损伤。如烧伤、烫伤、挫伤、创伤等在临床上十分常见。皮肤创面的覆盖和表皮细胞的再生是治疗皮肤损伤的关键。创伤救治的根本在于创面的愈合。目前现行的对大面积深度创面仍采用自体皮肤移植、自/异体混合移植、或自/异体皮肤更植等修复方法，这些方法存在疗程长、并发症多、治疗费用高、愈合质量差、造成新的创面等缺点。皮肤创伤修复过程中，皮肤附属器的再生是个难题。随着干细胞研究的深入，人们尝试进行细胞移植来治疗皮肤创伤。但是成体来源的表皮干细胞增殖缓慢，培养条件苛刻。

1962年，Stanley Cohen在雌性小鼠下颌腺发现表皮生长因子(EGF)，是一种小分子单链多肽。1975年，Harry Gregory发现了人的EGF。除下颌腺以外，人体的多种组织也有EGF分布，如十二指肠的Brunners腺、含中性粘蛋白的胃粘膜细胞系、外分泌腺体以及多种肿瘤细胞等。EGF能通过胞外信号调节激酶(ERK)途径引起3T3细胞的内源性的黏着斑激酶(FAK)磷酸化。从而激活细胞黏附。EGF受体不仅具有受体功能，而且具有酶活性，故既有结合配体发生构象变化的特点，又能作为激酶，催化底物蛋白发生酪氨酸磷酸化。现已知EGF是通过与细胞膜上的EGF受体(EGFR)结合而发挥作用的。EGFR是一种相对分子质量为170kD的糖蛋白，由1186个氨基酸残基构成，为原癌基因cerbB1所编码。该基因位于小鼠的第11条染色体及人的第7条染色体上。其结构分为3个区域：伸向膜外与EGF识别并结合的氨基酸区域、位于细胞膜中间的跨膜区以及具有酪氨酸激酶活性的细胞质内的羧基端区(Wiley LM，Adamson ED，Tsark EC.Epidermal growth factor receptor function in earlymammalian development[J].Biol Essays.1995；17(10)：839-846.)。EGFR的结构和功能在不同种属动物中基本相似，分子进化比较保守。EGF同其受体结合时，可引起细胞浆内EGFR的酪氨酸蛋白激酶活性增加，使酪氨酸残基的磷酸化增加，从而造成细胞内游离Ca²⁺增多，基因转录增加，DNA复制增多及细胞分裂；当细胞内Ca²⁺增多时，还能激活蛋白激酶C和环腺苷酶，改变细胞的骨架结构，使细胞分化。Ga²⁺依赖的细胞黏附能激活CDC42，可能是通过c-Src和FRG途径(Tatsuro Fukuharal，Kazuya Shimizul，Tomomi Kawakatsul，et al.Activation of Cdc42 by transinteractions of the cell adhesion molecules nectins through c-Src andCdc42-GEF FRG.The Journal of Cell Biology.2004；166：393-405)。E-钙粘附分子的缺乏或结构的改变与人类特定的肿瘤的侵入和转归有密切的关系。用培养的人角化细胞进行研究发现，细胞间粘附的形成系细胞外钙离子的浓度参与调控，当培养液的钙离子浓度在低水平(30μM)时，细胞呈单层生长而且没有粘附功能，当钙离子浓度增加(1.0mM)时，快速引起粘附连接和桥粒的形成，所以是一种钙离子依赖的粘附蛋白(王运涛，郑启新，郭晓东，等.野生型Smad3基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究.中华医学杂志.2004；84：1523-1527)。

在特定的体内外微环境条件下，干细胞能够诱导分化为各种组织细胞，为多种疾病的治疗拓展了新的治疗途径。干细胞在不同部位分化为不同组织细胞，组织微环境如钙离子浓度在调控干细胞分化方向上起了重要作用。

本发明人已经成功从4到6周左右人胚分离培养了人胚源性间充质干细胞(hMSC)。(仵敏娟，刘厚奇等.人早期胚胎间充质干细胞的定位和体外初步分离培养.第二军医大学学报2004；25(8)：818-821)

发明内容

本发明的目的在于克服成体表皮干细胞增殖缓慢的问题，利用上述人胚源性间充质干细胞(hMSC)，提供一种可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干细胞的方法及其应用。

本发明将人早期胚胎来源的间充质干细胞(hMSC)在特定组织微环境下诱导为人胚源性表皮(毛囊)干细胞。

本发明根据EGF质粒转染能激活FAK，改变细胞的骨架结构，使细胞分化；外源钙离子刺激能激活钙离子依赖的黏附蛋白这一事实，按照文献方法从人成体表皮组织获取含EGF基因cDNA片段并重组到真核表达载体pCDNA3.0，(参照陈廷速等，人表皮生长因子(hEGF)基因的合成、鉴定及植物表达质粒的构建，广西大学学报(自然科学版)，27(2)122-127)，转染人胚源性间充质干细胞(hMSC)，以便用表达的外源性EGF蛋白启动信号转导，促进其向表皮分化，同时结合一定浓度的钙离子刺激。

本发明提供一种可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干细胞的方法，它包括将含EGF的重组表达载体转染人胚源性间充质干细胞，并在转染过程中用0.4-1.0mmol浓度的钙离子刺激。

通过体外实验研究发现，转染后细胞形态有变化，由纤维形变为短圆形的细胞(图1)。加一定浓度钙离子刺激后，细胞成典型的表皮细胞状生长(图2)，并表达角蛋白，角蛋白19等抗原(图3)。

考虑到动物体内的微环境对干细胞分化的诱导作用，本发明将人胚源性间充质干细胞种植到裸鼠皮下。在皮下微环境的诱导下，人胚源性干细胞向表皮细胞分化。体内实验表明，人胚源性间充质干细胞在裸鼠皮下可分化为表皮细胞，并直接参与了裸鼠毛发的再生(图4)。人角蛋白19染色和碱性磷酸酶染色的结果也表明人胚源性间充质干细胞移植裸鼠的移植处的皮肤细微结构，具有表皮(毛囊)干细胞的特性(图5)。

本发明提供的一种可以快速增殖的人胚源性表皮(毛囊)干细胞的方法，可获得增殖相对迅速的人胚源性表皮细胞，可应用于临床皮肤创伤治疗。

附图说明

图1为转染EGF后的人胚源性间充质干细胞

图2为钙离子刺激后的转染EGF的人胚源性间充质干细胞

图3为免疫组化检测角蛋白和角蛋白19的试验结果

其中A：EGF；B：角蛋白19；C：角蛋白；D：阴性对照

图4为免疫荧光共聚焦检测人胚源性间充质干细胞在裸鼠体内分化为毛发的试验结果

其中A：组织相关溶性抗原HLAI； B：角蛋白；

    C：阴性对照；             D：A和B叠加

图5为人K角蛋白19染色和碱性磷酸酶染色的裸鼠试验结果

其中C，G：人角蛋白19染色结果；

    D，H：碱性磷酸酶染色结果。

具体实施方式

现结合实施例及附图，对本发明作进一步的描述。

实施例1：

(1)制备人表皮细胞总RNA：

成人体皮经原代培养得到表皮细胞(杨玲，刘厚奇等。成人体皮表皮干细胞的定位及分离培养。第二军医大学学报，2004，25(8)：815-817.)。用上海华舜生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得总RNA。

(2)合成引物及构建pCDNA3.0-EGF真核表达载体：

将hEGF基因移至真核载体pCDNA3.0。按照文献获取含EGF基因cDNA片段并重组到真核表达载体pCDNA3.0(参照陈廷速等，人表皮生长因子(hEGF)基因的合成、鉴定及植物表达质粒的构建，广西大学学报(自然科学版)，27(2)122-127)。

(3)建立pCDNA3.0和pCDNA3.0-EGF重组人胚源性间充质干细胞细胞株：

按美国GibcoL生产的脂质体转染试剂盒说明书操作，将空载体pCDNA3.0和重组载体pCDNA3.0-EGF分别转染对数生长期的人胚源性间充质干细胞。具体方法如下：将6孔板中长到50％～60％的人胚源性间充质干细胞用无血清DMEM培养基洗涤一次，加入2ml无血清培养基培养6小时。

转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清的DMEM培养基分别将空载体和重组载体稀释成1～10μg，每份样品为100μl；B液：用不含血清的DMEM培养基将质脂体进行对倍稀释，总量为两个100μl；将A，B二液轻轻混匀，室温中置10～15分钟。

转染准备：用2ml不含血清DMEM培养基漂洗细胞两次；再加入1ml不含血清培养基。

转染：用A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀、置于37℃、5％CO2的培养箱中培养5小时，吸除无血清转染液，换入正常含10％小牛血清的DMEM培养液继续培养。用G418(美国GibcoL)筛选(G418 600μg/ml)，挑选G418阳性单克隆细胞扩增培养。分别得空载体pCDNA3.0和重组质粒pCDNA3.0-EGF的人胚源性间充质干细胞细胞株。

(4)钙离子和EGF协调作用

取55.4g CaCl₂溶于800ml重蒸水中，加重蒸水定容至1000ml制备1mol CaCl₂(氯化钙)。高压灭菌后室温保存。用含0.4mmol钙离子的、10％DMEM的培养基培养6孔板中长到60％～70％的转染EGF的人胚源性间充质干细胞。

(5)细胞实验(体外实验)

利用免疫组化、细胞计数、流式细胞仪等生物学实验方法，从形态学、蛋白表达等方面分析细胞形态变化，及表皮细胞表面标志角蛋白和角蛋白19及EGF的表达。

具体方法如下：

1)细胞生长状态的比较

用倒置相差显微镜观察转染有pCDNA3.0-EGF，pCDNA3.0空载体的人胚源性间充质干细胞及未进行转染的人胚源性间充质干细胞。可见转染pCDNA3.0-EGF的人胚源性间充质干细胞与其它两组相比细胞明显变圆。分别接种转染有pCDNA3.0-EGF，pCDNA3.0空载体及未进行转染的人胚源性间充质干细胞于6孔板中，进行细胞计数。分别将这三种细胞按1×105个/ml接种于6孔板，每12小时计数1次，共计96小时。计数3次，取平均值，绘制生长曲线。结果显示：含pCDNA3.0-EGF重组子的人胚源性间充质干细胞与未进行转染的人胚源性间充质干细胞相比细胞增殖无明显变化。

含0.4mmol钙离子培养基培养后，细胞成典型的表皮细胞特征。

2)免疫组化检测角蛋白和角蛋白19及EGF的表达

制备转染有pCDNA3.0-EGF，pCDNA3.0空载体的人胚源性间充质干细胞及未进行转染的人胚源性间充质干细胞的细胞爬片，所收集细胞在含0.4mmol钙离子培养。用免疫组化检测角蛋白和角蛋白19及EGF的表达水平。一抗为兔抗小鼠角蛋白、角蛋白19多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)和兔抗人EGF多克隆抗体(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY，INC.)，二抗为FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)。结果：经钙离子刺激后，pCDNA3.0-EGF重组人胚源性间充质干细胞细胞株表达角蛋白和角蛋白19及EGF。这说明pCDNA3.0-EGF重组人胚源性间充质干细胞经钙离子刺激后，开始表达表皮细胞的特异性抗原角蛋白和角蛋白19及EGF。

(6)体内试验

实验所用裸鼠BALB/c Nu品系，SPF级。体重约15～25g，3～4周龄，购自上海实验动物中心。共24只裸鼠，分四组：人胚源性间充质干细胞注射组，人成体皮肤成纤维细胞注射组，无血清DMEM注射组，野生组。将人胚源性间充质干细胞与人成体皮肤成纤维细胞分别以无血清DMEM培养基为母液制备成细胞总数不低于1×10⁷个/0.2ml的细胞悬液，用1ml注射器抽取细胞悬液0.2ml注入裸鼠背部皮下。SPF级条件下喂养、每日观察，四周后取材，结果发现：细胞注射处有毛发生成。各组动物，经实验处理后，在外形、活性等方面无差异。处死后各组裸鼠之间相比，H-E染色，肝、脾、肾等脏器无差异。

对各组裸鼠注射部位的皮肤组织做角蛋白19染色，显微镜下观察发现：注射人胚源性间充质干细胞的裸鼠皮肤有大量的毛囊出现，而其它各组则无此现象。碱性磷酸酶染色也清楚的显示注射人胚源性间充质干细胞的裸鼠皮下有大量毛囊生成。

具体方法如下：

1)荧光共聚焦

制备各组实验裸鼠注射处皮肤切片。用免疫荧光共聚焦检测组织相关融性抗原HLA-I和角蛋白的表达水平。一抗为小鼠抗人单克隆抗体HLA-I(Sigma CO)和兔抗鼠多克隆抗体角蛋白(北京中山生物技术有限公司)。二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG(华美生物工程有限公司产品)和TRITC标记的山羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)。结果：人胚源性间充质干细胞注射处的皮肤，检测到大量的组织相关融性抗原HLA-I和角蛋白。两者的表达有部分重叠。这说明人胚源性间充质干细胞在裸鼠体内分化未毛囊，引起了裸鼠毛发的再生。

2)苏木精-伊红(HE)染色

方法同常规石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色。

3)碱性磷酸酶染色

方法如下：将新鲜制备的各实验组裸鼠皮肤的冰冻切片取出，2％多聚甲醛固定，TSM1洗，TSM2洗，NBT/BCIP显色。