一种快速测定原料乳细菌总数的方法

摘要

本发明提供的是一种快速测定原料乳细菌总数的方法。(1)在透明器皿中加入定量原料乳溶液，37℃±1℃预热2～10分钟，并保持测定过程始终保持恒温37℃±1℃；(2)向乳中按比例加入氧化还原试剂，通入氮气混匀10秒钟～4分钟；(3)混匀后，马上应用颜色传感器采集混合样品颜色信息；(4)2～15分钟后，再次采集混合样品颜色信息；(5)用计算机处理、分析两次颜色的色差值，与标准比对，读取待测乳样的细菌总数。本发明具有检测速度快、检测限低、仪器具有良好的性价比、操作简便等优点。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及的是一种检测方法，具体地说是一种应用于原料乳细菌总数检测的快速测定方法。

(二)背景技术

牛乳营养丰富，易受微生物的污染，原料乳中细菌数量与产品质量密切相关，因而细菌总数是衡量原料乳质量的重要指标，对其进行在线检测有助于控制原料乳质量，保证产品安全。

目前用于乳品行业的细菌总数的检测方法很多，如标准平板计数法、直接显微镜计数法、还原试验法、流式细胞计数法等。各种方法各有所长和不足，国内应用最多的是标准平板计数法，该法存在操作繁琐、检测结果严重滞后的缺点，不能满足在线检测的要求。大型企业应用丹麦进口的FOSS鲜乳细菌检测仪器，检测速度快，但是仪器价格昂贵，检测成本高。因此，经济实用、操作简便的原料乳细菌总数快速方法的确立有着重大的理论与现实意义。

20世纪40年代开始，还原法就被用来检测原料乳细菌总数。细菌中存在还原酶，与处氧化与还原态时颜色不同的氧化还原型试剂共存时，会使该试剂发生还原反应，引起颜色变化。混合后可以根据单位时间混合溶液的颜色变化来判定细菌总数，也可根据达到一定颜色所需的时间进行判定。目前国内外在乳品行业应用该原理检测细菌总数仍停留在目测比色阶段，结果的判定具有主观性，且不能定量表示。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种客观、准确、迅速，检测的灵敏度与精确度高的快速测定原料乳细菌总数的方法。

本发明的目的是这样实现的：

1、在透明器皿中加入定量原料乳溶液，37℃±1℃预热2～10分钟，并保持测定过程始终保持恒温37℃±1℃；

2、向乳中按比例加入氧化还原试剂，通入氮气混匀10秒钟～4分钟；

3、混匀后，马上应用颜色传感器采集混合样品颜色信息；

4、2～15分钟后，再次采集混合样品颜色信息；

5、用计算机处理、分析两次颜色的色差值，与标准比对，读取待测乳样的细菌总数。

本发明的方法还可以包括：

1、所述的氧化还原试剂是美兰、刃天青、红四氮唑或其它任何处于氧化状态时与处于还原状态时颜色不同的无毒或微毒试剂中的一种。

2、预热同时进行光照处理。

3、氧化还原试剂的加入量为0.1～1ml。

本发明重点研究了美兰与刃天青等两种试剂的还原速度，比较发现同一原料乳样品引起的刃天青颜色变化要比美兰的颜色变化快。

仪器需要恒温工作，且温度影响细菌的代谢速度，不同温度的样品也需调整温度达到一致。本发明通过比较不同温度样品的试剂还原速度以确定检测温度。结果表明，在37℃条件下，试剂还原速度最快，因此，仪器工作温度设定为37℃左右。

样品的溶解氧浓度对试剂的还原速度影响很大，本发明通过比较不同溶解氧浓度样品的试剂还原速度以确定检测温度。结果表明，在溶解氧浓度接近0时，试剂还原速度最快，因此，在测定过程中样品的混匀采用通气方式，一方面可减少氧浓度差异带来的检测误差，另一方面可达到快速检测的目的。

试剂的浓度与加入量也影响检测速度，本发明比较了原料乳加入一定量的刃天青后，混合溶液单位时间内色差值，发现当刃天青终浓度为0.0005％左右时，色差值最大。因此需要限定试剂的加入浓度与体积以达到最快的检测速度。

本发明改进了传统的还原法测定原料乳细菌总数的方式，具有以下优点：

1、检测速度快。5～30分钟即可定量测定原料乳的细菌总数。

2、检测限低。可达5万/mL。

3、仪器具有良好的性价比。本检测应用仪器的成本不超过5000元，检测样品的试剂成本不超过0.5元，即使中小型乳品企业也有能力应用本方法进行检测。比较而言，国内大型乳品企业进口的丹麦FOSS公司据流式细胞检测原理设计的原料乳细菌总数检测仪器，检测速度快(15min左右)，但是仪器价格昂贵(10万美元)，检测成本

4、操作简便。环境要求低，无需无菌环境，人员无需专门培训，操作简便。

(四)具体实施方式

下面举例对本发明作更详细的描述：

实施例1

操作步骤：

(1)在比色皿中加入1.8ml原料乳溶液，37℃±1℃预热5分钟，预热同时光照处理。

(2)测定过程始终保持恒温37℃±1℃。

(3)在乳中加入0.005％刃天青试剂0.2ml，通入氮气混匀1分钟。

(4)混匀后，马上应用颜色传感器采集混合样品颜色信息。

(5)10分钟后，采集混合样品颜色信息。

(6)计算机处理、分析颜色变化前后的色差值，与标准比对，读取待测乳样的细菌总数。

实施例2

操作步骤：

(1)在比色皿中加入1.9ml原料乳溶液，37℃±1℃预热3分钟，预热同时光照处理。

(2)测定过程始终保持恒温37℃±1℃。

(3)在乳中加入0.01％刃天青试剂0.1ml，通入氮气混匀2分钟。

(4)混匀后，马上应用颜色传感器采集混合样品颜色信息。

(5)8分钟后，采集混合样品颜色信息。

(6)计算机处理、分析颜色变化前后的色差值，与标准比对，读取待测乳样的细菌总数。