药物与环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱分析方法

摘要

药物与环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱分析方法，步骤是，采用拉曼光谱仪或傅立叶拉曼光谱仪，对待测的药物样品进行图谱测定；归属并选择样品图谱中药物的吸收谱带或吸收峰，选择特定的振动谱带作为特征参考谱带；收集或计算谱带波数，谱带宽度、谱带强度、谱带形状系数等参数；应用标准对照或工作曲线，定性、定量识别和分析药物在不同的体系或制剂中的包合状态和包合程度，预测药物的溶出性能、渗透性能以及药动学参数。本发明简便快捷，测试样品非接触性、非破坏性、检测灵敏度高、时间短、样品所需量小及样品无需制备等特点，具有较高的学术价值和实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种环糊精包合物的药物学分析方法，尤其是一种药物与环糊精的相互作用及其药学性能参数的拉曼光谱分析方法。

背景技术

环糊精具有外亲水，内疏水的笼状结构，亲脂性客体整个分子或亲脂结构能通过置换CD腔体内的水分子与其形成所谓的包合物(inclusion complexes)，即客体药物与主体CD形成的超分子体。在分子水平上也称为“分子微囊”。药物/环糊精超分子体应用目的主要是：增加药物的水溶性；提高药物的稳定性；促进药物吸收，提高药物的生物利用度；减轻药物对机体的刺激及副作用；作为控释和靶向制剂的载体材料；提高脂质体、纳米球的载药量方面，进一步提高传输药物的功能等。难溶性药物(尼莫地平、布洛芬因其在水溶液中溶解度极低，因此在制剂制备、体内吸收等方面均存在着难点。国内外已有文献报道采用羟丙基-β-环糊精、磺丁醚-β-环糊精等包合后，难溶性药物的水溶性和生物利用度有显著提高，表明采用可改善制剂的性能。药物/环糊精超分子体是环糊精制剂中的关键组分，其包合方式和包合程度直接影响到药物的溶出性能和吸收。特别是，包合程度或包合率(complexation efficiency)和药学性能参数(溶出参数、渗透参数、药动学参数)的分析测定是设计药剂处方、改进制备工艺、控制产品质量的重要环节。目前常规分析方法如powder X-raydiffractometry(PXRD)，differential scanning calorimetry(DSC)，infraredspectra(IR)，NHR等方法，只能判断包合物中药物和环糊精的作用与否，特别是体系中药物含量较低或药物存在于多组分的复杂体系中时，使用以上分析方法提供的结果准确性差，且一般无法精确地识别体系包合程度的变化，无法定量分析包合物包合程度，对体系中结合方式的表征也十分局限。特别是在药物制剂中，受药物的低含量、辅料、测试条件等诸多因素干扰影响，使用以上分析方法难以判断药物和环糊精的作用情况，更无法定量分析药物/环糊精之间包合程度。

随着环糊精在药物学领域的广泛应用，迫切需要一种能够比较准确地分析、表征药物与环糊精之间的包合关系、包合程度以及预测这些包合物的药学性能参数的分析方法，但现有技术中尚没有比较理想的方法。

发明内容

为了适应环糊精在药物领域应用的需要，填补现有技术的空白，本发明的目的是提供一种药物与环糊精的相互作用及其药学性能的分析与表征方法：利用拉曼光谱的方法识别和探测药物/环糊精体系或药物制剂中药物的包合状态或包合程度。解决在包合物、环糊精药物制剂设计、制备过程及储存中药物包合状态分析等关键技术问题，预测药物的药学性能参数，为药品质量的稳定和可控提出技术手段。

发明的技术方案是，药物与环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱分析方法，包括以下步骤：

图谱测定：采用拉曼光谱仪或傅立叶拉曼光谱仪，对待测的样品进行测定，得到其拉曼频谱或傅立叶拉曼频谱；

特征谱带的选择：归属并选择包合物图谱中药物的吸收谱带或吸收峰，选择以下一个或多个振动谱带作为特征参考谱带：

                            拉曼特征参考谱带

  编   号   振动方式    归属    波数cm^-1   1  2   3   4  5  6  7  8  9  10  11  12   13   C＝O伸缩振动  O-N-O伸缩振动   C-X伸缩振动   C＝C伸缩振动  -C-O-C-伸缩振动  -C三N伸缩振动  C-N伸缩振动  S-H振动  C-S振动  环振动  环伸缩振动  C-C伸缩振动  CH3或CH2或CH变形、   摇摆，弯曲振动  包括羧基、酮基、酯基  硝基、亚硝基  卤素基团C-Cl，C-Br，   C-F  烯烃、芳香环  醚，酯  腈基  胺基，硝基  巯基，含硫分子  巯基，含硫分子  苯环或芳香杂环  苯衍生物  烷烃类   烷烃类   1400-1900  1200-1500   500-700   1000-2000  700-1100  2000-3000  1200-700  2560-2600  600-800  1100-900  1500-1700  1400-600   1400-600 

特征参考谱带的选择，可通过以下步骤或之一来实施：通过研究药物和环糊精的分子模型、药物/环糊精包合物的核磁共振谱研究，确定药物分子/环糊精分子之间的包合作用对该基团及其谱带的影响较大；研究药物、环糊精、制剂辅料、体系或制剂的拉曼光谱，确定在拉曼光谱中，环糊精或制剂其他辅料的存在不会干扰该谱带光谱参数(宽度、强度、位移值、形状等)识别。

结果收集：通过手动或采用数学分析处理、函数拟合的方法，收集谱带波数，谱带宽度、谱带强度、谱带形状等参数。如样品图谱与辅料图谱相减、基线校正、去卷积、非线性拟合、多重峰拟合、计算导数光谱等。

结果处理

定性分析：将测试样品的拉曼图谱与对照药物、对照包合物的拉曼图谱进行对比，分析相应参照峰或参照峰群的峰形状、峰宽、峰强度、位置，是否基本一致，判断是否包合；估计药物的溶出性能参数、溶解性能参数、渗透性能参数以及药动学参数的变化。

本发明上述方案的适用范围：适用于环糊精及其衍生物，如β-环糊精(β-CD)，羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、磺丁醚-β-环糊精(SBE-β-CD)；适用于包括以药物和环糊精为主的两组分或多组分体系(例如含高分子药用辅料PVP，HPMC，PEG，壳聚糖、聚乳酸等各种药用辅料)和环糊精药物制剂。药物制剂体系包括液体、固体、半固体等各种剂型，如片剂，乳剂，针剂，微米或纳米级的给药体系。例如，含尼莫地平/羟丙基环糊精包合体系的片剂的包合程度测定。

体系或制剂中药物的含量范围为0.1％～80％。

本发明的进一步优化，可以增加以下步骤：

定量分析：

标准对照法：设置与测定样品条件接近的标准对照体系，分别测定拉曼图谱，从特征参考谱带中选取最佳特征吸收峰或特征吸收峰群，以特征峰宽度、强度、位移值、形状相似系数为指标，确定指标的最佳值，选取样品和对照品图谱中特征峰的光谱数据之比，按下式进行计算样品的包合程度、溶出参数、溶解参数、渗透参数、药动学参数。

包合程度或包合率＝(Γs/Γr)×100％，

Γs为样品参照峰的谱带宽度，Γr为标准对照品参照峰的谱带宽度；

包合程度或包合率＝(Rs/Rr)×100％，

Rs为样品参照峰的相似系数，Rr为标准对照品参照峰的相似系数，通过拟合相应的函数获得。

包合程度或包合率＝(Δfs/Δfr)×100％

Δfs为样品参照峰的位移值，Δfr为标准对照品参照峰的位移值；

包合程度或包合率＝[(1-Is)/(1-Ir)]×100％

Is为样品参照峰的峰强系数，Ir为标准对照品参照峰的峰强系数；

药物溶出参数PDs(t)＝包合程度或包合率×PDr(t)

PDs(t)为样品t时间的溶出参数，PDr(t)为标准对照品t时间的溶出参数；

药物渗透参数Papp/s＝包合程度或包合率×Papp/r，

Papp/s为样品的渗透参数，Papp/r为标准对照品渗透参数；

生物利用度参数(AUC)s＝包合程度或包合率×(AUC)r

AUCs为样品的生物利用度，AUCr为标准对照品生物利用度。

血药峰浓度(Cmax)s＝包合程度或包合率×(Cmax)r

(Cmax)s为样品的血药峰浓度，(Cmax)r为标准对照品的血药峰浓度。

达峰时间(Tmax)s＝包合程度或包合率×(Tmax)r

(Tmax)s为样品的达峰时间，(Tmax)r为标准对照品的达峰时间。

在实际分析中可采用过量的环糊精(例如环糊精∶药物的摩尔比为5∶1～10∶1)以及采用包合效率较高的制备方法(例如喷雾干燥法等)制备标准对照包合物；测定该标准对照包合物的原始图谱，选择特征参考峰，收集宽度、强度、位移值、形状相似系数等光谱参数；选择对于包合程度变化最为敏感的光谱参数指标(可通过比较不同摩尔比的包合物的不同光谱参数获得)，以标准对照物特征参考峰的光谱参数指标值为最佳值，计算样品的包合率。测定标准对照物的溶出参数、渗透参数、药动学参数，计算样品的溶出参数、渗透参数、药动学参数。根据最佳值，最终确定样品的相对包合程度、溶出参数、渗透参数、药动学参数等药学参数。

上述定量分析可以采用工作曲线法或标准曲线法：选取不同包合程度的系列对照品(例如不同主客摩尔比等，例如环糊精∶药物的摩尔比为0.5∶1～8∶1)，分别测定拉曼光谱，选择特征参考峰，并选择对于包合程度变化最为敏感的光谱指标参数(可通过比较不同摩尔比的包合物的不同光谱参数获得)，制作参考特征峰光谱参数(宽度、强度、位移值、形状相似系数)分别相对于溶出参数、溶解参数、渗透参数、药动学参数的工作曲线或标准曲线，通过测定或计算样品参考特征峰的光谱参数，依据工作曲线或标准曲线得到样品的溶出参数、溶解参数、渗透参数、药动学参数。

在实际分析中可采用同一方法(包合溶液法，研磨法、冷冻干燥法、喷雾干燥法等)制备不同摩尔比的系列包合物，测定原始图谱，选择特征参考峰，获得宽度、强度、位移值、形状相似系数等光谱参数，分别测定其溶出参数、渗透参数、药动学参数。进行回归分析，得到性能参数与宽度、强度、位移值、形状相似系数的工作曲线，根据工作曲线以及最佳值，最终确定样品的相对包合程度、溶出参数、渗透参数、药动学参数等药学参数。

本发明的工作原理

环糊精具有外亲水，内疏水的笼状结构，亲脂性客体整个分子或亲脂结构能通过置换CD腔体内的水分子与其形成所谓的包合物(inclusion complexes)，药物分子或其基团进入环糊精的杯状空腔内并通过各种非共价键相互作用。药物与环糊精分子间的作用力，包括范德华力，静电力，氢键作用等。因此，药物分子或分子基团的自由振动也受到阻碍，当分子振动伴随偶极矩改变时，振动所产生的电磁波改变实质上取决于振动时偶极矩变化的大小。因分子间的非共价作用，导致药物分子原有峰发生以下一项或多项变化：某些峰的形状会发生明显变化，某些峰的强度会显著下降，一些弱峰将会消失；某些峰宽明显增宽，某些峰位置发生移动。因此，谱带的形状、强度、峰宽、位置可以从不同角度反映了振动方式的各种变化，从中可了解药物/环糊精之间作用程度改变。

通过研究，选择药物分子中的一些拉曼强吸收谱带在受到分子间非共价作用后，各种振动模式的变化程度取决于药物/环糊精之间相互作用程度。可定性定量地表示包合已否及包合程度。这种变化与药物/环糊精之间作用程度、药物包合率、药物增溶性能以及渗透性能密切相关。

通过研究，选择药物分子中的一些拉曼强吸收谱带可以避开环糊精和药用辅料的干扰，可直观地用做参照峰进行分析。

本发明建立了一套简单易行的识别模式。在这套模式中，选择药物的特征拉曼谱带，通过特征谱带的峰形、宽度、相对强度、位移等定性和定量分析药物/环糊精体系中组分之间的作用程度，通过比较谱带的变化来识别药物/环糊精体系的包合状态程度和改变趋势。建立了拉曼特征谱带的光谱参数(宽度、位移值、相对强度、峰形)与包合程度(包合率)、药学性能参数(溶出参数、溶解参数、渗透参数、药动学参数)的数量关系。从而判断药物在制剂中的包合状态，预测药物的溶解趋势和体内的吸收、转运行为。

本发明的优点：具有测试样品非接触性、非破坏性、检测灵敏度高、时间短、样品所需量小及样品无需制备等特点。可在不破坏样品的条件下，识别不同体系中低含量药物包合程度的差异。是定量探测包合体系及药物制剂中药物的包合趋势和包合率状态，预测药物的药学性能的有效方法。

附图说明

图1为实施例1中尼莫地平及其片剂的拉曼光谱图

图2为实施例2中布洛芬、HP-β-CD、包合物的拉曼光谱图。

具体实施方式

实施例1，尼莫地平与羟丙基-β-环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱表征研究

尼莫地平(Nimodipine，NM)为第二代1，4二氢吡啶类钙拮抗剂。是目前临床广泛应用心脑血管常用药。本研究采用尼莫地平与羟丙基环糊精(HP-β-CD)包合后，形成超分子体系，并加入相应辅料后制备片剂，采用拉曼光谱对制剂中的包合程度、溶出参数、溶解参数、渗透参数、药动学参数进行了分析和预测并与实验结果进行了比较。

样品的制备：采用喷雾干燥法制备尼莫地平/HP-β-CD超分子体包合物，尼莫地平/HP-β-CD摩尔比为1∶3。该样品加入乳糖、微晶纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁，采用混合、湿法制粒、干燥、压片制备规格为10mg，片重为200mg尼莫地平片剂。

不同摩尔比包合物对照品的制备：采用喷雾干燥法制备尼莫地平/HP-β-CD包合物，采用混合、湿法制粒、干燥、压片制备对照片剂。尼莫地平/HP-β-CD摩尔比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5。

拉曼光谱测试条件：激光激发波长514.5nm，激光功率10mw，分辨率2cm^-1，扫描范围200～3200cm^-1。分别对对照品和样品进行测定。

特征峰的选择及归属：NM包合物拉曼光谱中有多个特征峰，如1696cm^-1，1642cm^-1，1581cm^-1，1491cm^-1，1345cm^-1，1198cm^-1，1132cm^-1，1095cm^-1，1004cm^-1等；羟丙基-β-环糊精的拉曼光谱中有多个特征峰，如1458cm^-1，1390cm^-1，1330cm^-1，1255cm^-1，1124cm^-1，927cm^-1，854cm^-1；其它辅料的拉曼光谱中特征峰，如1486cm^-1，1388cm^-1，1102cm^-1，444cm^-1，387cm^-1；在片剂的拉曼光谱中NM的1696cm^-1，1642cm^-1，1581cm^-1，1491cm^-1，1345cm^-1，1004cm^-1等仍可清楚分辩，尤其是1696cm^-1，1642cm^-1，1581cm^-1不受辅料干扰；通过测定NM、包合物的HNMR、CNMR谱以及应用计算机辅助化学软件(Computer-Aided Chemistry)模拟均证明分子中羰基最容易进入环糊精空腔，其谱带可作为特征参照峰指示包合程度。通过比较发现1642cm^-1的谱带为强峰，参数的变化灵敏，选择作为定量分析的参照峰，参见附图1。

                               NM特征谱带及归属

   Peak   Peak   position  cm^-1   Vibrational   assignment    Vibrational mode   1  2  3  4  5  6  7   8  9  1696m  1642s  1581m  1491m  1345s  1198m  1095m  1134w  1004m  820m  C＝O  C＝O  C6H5  C-N-H  NO2 sym str  C-N  C6H5  C-N  C6H5  -C-O-C-  Stretching  Stretching  Substituted benzene ring stretching  In plane bending  symmetric stretching  stretching  Substituted benzene ring stretching(breathing)  stretching  Substituted benzene ring stretching(breathing)  symmetric stretching

结果收集：应用origin软件以Lorentzian函数拟合不同图谱中参照峰1642cm^-1的峰形；测定参照峰1642cm^-1的峰宽。

结果分析：

定性分析1：尼莫地平的拉曼谱带1696cm^-1明显存在，1∶2包合对照品中的拉曼谱带1696cm^-1消失，包合物和片剂样品的拉曼光谱中该谱带消失，说明包合物和片剂样品中尼莫地平与HP-β-CD已包合。

定性分析2：尼莫地平的拉曼谱带1642cm^-1峰宽为80cm^-1，1∶3包合对照品中的拉曼谱带1642cm^-1峰宽为124cm^-1，包合物和片剂样品的谱带1642cm^-1峰宽分别为122cm^-1，127cm^-1，说明包合物和片剂样品中尼莫地平与HP-β-CD已包合。

定量分析1：比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中羰基伸缩振动谱带1642cm^-1为图谱中强吸收峰，它的形状、峰宽、强度变化最为显著，将该峰作为参照峰，峰型以Lorentzian函数拟合，包合物样品的峰形相似系数为0.736；片剂样品的峰形相似系数为0.732。不同摩尔比包合物对照品的图谱中峰形相似系数随HP-β-CD含量增大而显著降低，说明体系中包合程度增大，摩尔比为1∶4和1∶5的包合物峰形相似系数十分接近，分别为0.704和0.702，说明已达到包合饱和。以峰形相似系数(R)为指标，以1∶5包合物的形状相似系数(0.702)作为最佳值，按下式计算得出包合物样品的相对包合程度或包合率为88.6％，片剂样品的相对包合程度或包合率为89.9％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(1-Rs/1-Rr)×100％Rs为样品参照峰的相似系数，Rr为标准对照品参照峰的相似系数。

定量分析2：比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中羰基伸缩振动谱带1642cm^-1为图谱中强吸收峰，它的形状、峰宽、强度变化最为显著，将该峰作为参照峰，测量峰宽，包合物样品的峰宽为94cm^-1；片剂样品的峰宽为96cm^-1。以峰宽为指标，以1∶5包合物的峰宽(109cm^-1)作为最佳值，按下式计算得出包合物样品的相对包合程度或包合率为85.7％。片剂样品的相对包合程度或包合率为88.1％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(Γs/Γr)×100％

Γs为样品参照峰的谱带宽度，Γr为标准对照品参照峰的谱带宽度。

定量分析3：选择特征参照峰1642cm^-1测定系列包合对照物的拉曼谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽。分别与包合对照物的溶出参数PD₅进行回归分析后，建立溶出参数-峰宽工作曲线，通过工作曲线定量计算药物的溶出参数，预测药物的溶出参数。

选择特征参照峰1642cm^-1测定系列包合对照物的拉曼谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽。分别与相应片剂溶出参数PD₁₅进行回归分析后，建立溶出参数-峰宽工作曲线(r＝0.966)，通过工作曲线定量计算药物的溶出参数，预测药物的溶出参数。

                溶出参数-峰宽工作曲线

  包合比  峰宽 包合物PD₅(％)  片剂PD₁₅(％)  0∶1  1∶1  2∶1  3∶1  4∶1  5∶1  6∶1  80.0  94.0  105.0  124.0  132.0  156.0  173.0 0.2 24.0 36.0 41.0 55.0 67.0 82.0  5  27  38  44  59  69  87

根据包合物样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽为117cm^-1，按照工作曲线计算PD₅＝38.9％，实际测定数据为35.7％。

根据片剂样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽为120cm^-1，按照工作曲线计算PD₁₅＝41.4％，实际测定数据为44.7％。

定量分析4：选择特征参照峰1642cm^-1测定不同包合物的拉曼谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽。建立相应的Caco2细胞渗透模型，将不同包含物对照品在渗透模型上测定相应的渗透参数(Papp)，将峰宽与渗透参数(Papp)进行回归分析后，建立渗透参数-峰宽工作曲线(r＝0.899)，通过工作曲线定量计算药物的渗透参数。预测包合物、片剂样品中药物的渗透参数。

           渗透系数-峰宽工作曲线

  包合比  峰宽  Papp cm/s  0∶1  1∶1  2∶1  3∶1  4∶1  5∶1  6∶1  80.0  92.0  107.0  128.0  130.0  159.0  171.0  6.21×10^-6  6.49×10^-6  6.85×10^-6  7.57×10^-6  8.83×10^-6  9.16×10^-6  9.36×10^-6

根据包合物样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽为117cm^-1，按照工作曲线计算Papp＝7.32×10^-6，实际测定数据为P＝7.26×10^-6。

根据片剂样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的峰宽为120cm^-1，按照工作曲线计算Papp＝7.62×10^-6，实际测定数据为Papp＝7.66×10^-6。

细胞培养 Caco-2细胞接种于常规培养瓶中，培养基为DMEM，含1％非必须氨基酸，10％胎牛血清，细胞培养于CO2培养箱中(37℃，5％CO2，相对湿度90％)。当细胞长至覆盖瓶底的80％～90％时，胰酶消化，并接种于Transwell的聚碳酸脂膜上(0.5mL/孔)，在Transwell的下腔加入培养液1.5mL.接种24h后更换培养液.接下来一周隔天换液，一周以后每天换液，培养20余天待用。单层细胞电阻测定将Caco-2以前述方法培养于Transwell中，每天测定单层细胞电阻(TEER)值，TEER达到300Ω/cm²；可用干通透实验。用PBS小心冲洗以除去黏附在细胞表面的代谢物。在AP池加入药物，在BL池加入无血清的DMEM培养液，37℃培养箱中孵育.分别于15、45、60、120、150min从BL池取样0.5mL，并立即补加等量的无血清DMEM培养液于BL池，用HPLC测定样品液中药物浓度，并由以下公式计算累计通透量ΔQ和表观表观渗透系数Papp。

           ΔQ＝CnV+∑CiΔV(i＝1，2…，n-1)

其中，ΔQ为累计通透量，Cn为每一次测量的药物浓度，V为BL侧液体体积，ΔV为每一次的取样体积。

            Papp＝(dQ/dt)/(A·C0)

其中dQ/dt为单位时间药物转运量(μmol·s^-1)，A为转运膜的面积(cm²)，C0为药物的初始浓度(μmol·L^-1)。

定量分析5：选择特征参照峰1642cm^-1，峰型(1600-1680cm^-1)以Lorentzian函数拟合，获得不同片剂对照物的拉曼谱中特征参照峰1642cm^-1的峰形相似系数。并测定不同片剂对照物的相对生物利用度，通过峰形相似系数与片剂生物利用度参数AUC进行回归分析后，建立生物利用度-峰形相似系数工作曲线(r＝0.947)，通过工作曲线定量计算药物的AUC。预测药物的生物利用度。

生物血药浓度的测定和药动学参数的估算

家犬，体重10±2kg，雌雄不限，由中国药科大学实验动物中心提供。随机分成若干组，每组7只。

给药方式：采用单剂量双交叉实验设计。每轮给药之间间隔1周。给药时用医用镊将药物放置于家犬的咽部，家犬自然吞咽后再灌服蒸馏水50ml。采血时由饲养人员抱住家犬，从家犬四肢浅静脉取血。

采血时间：服药前及服药后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6小时采血2ml左右于肝素化试管中，离心取血浆置于-20℃立即冷冻，HPLC法测定血药浓度。

结果计算：采用每组结果平均值绘制样品的血药浓度-时间曲线，并进行药动学参数计算。由实验数据可直接得到血药峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)。

浓度-时间曲线下的面积(AUC0-∞)：AUC0-∞＝AUC_t+C_t/λ_Z；

式中AUC_t用梯形法则计算，t为最后一个测定时间点；λ_Z为末端相速率常数，即对血药log对数浓度-时间数据的末端进行直线回归，所得斜率的绝对值乘以2.303即为λ_Z。C_t为最后一个时间点的血药浓度。

                生物利用度-峰形相似系数工作曲线

   包合比   峰形相似系数     峰形变异系数   AUC_SS   ng h/ml  1∶1  2∶1  3∶1  4∶1  5∶1  6∶1  0.949  0.876  0.739  0.719  0.702  0.691  0.051  0.124  0.261  0.281  0.298  0.309  767.5  969.7  1078.9  1187.2  1292.3  1294.7

根据片剂样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的相似系数为0.837，按照工作曲线计算AUC＝1155ng h/ml，实际测定数据为1108ng h/ml。

根据片剂样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的相似系数为0.837，按照工作曲线计算C_max＝236.8ng/ml，实际测定数据为228.7ng/ml。

根据片剂样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的相似系数为0.837，按照工作曲线计算T_max＝45.7min，实际测定数据为43.9min。

实施例2，布洛芬与羟丙基-β-环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱表征研究

布洛芬(ibuprofen，bf)是目前临床疗效确切、不良反应小、安全性高的烷基丙酸类解热镇痛抗炎药已在临床广泛应用。但由于水溶性差，影响了生物利用度，国内外已有多篇文献报道采用水溶性环糊精衍生物制备超分子体以改

善水溶性和生物利用度。本研究采用布洛芬与羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、磺丁醚环糊精SBE-β-CD包合后，形成超分子体系，并加入相应辅料后制备胶囊剂，采用拉曼光谱对制剂中的包合程度、溶出参数、溶解参数、渗透参数、生物利用度参数进行了分析和预测并与实验结果进行了比较。

样品的制备：采用研磨法制备布洛芬/HP-β-CD超分子体包合物。布洛芬/HP-β-CD摩尔比为1∶1。该样品加入乳糖、微晶纤维素、微粉硅胶，制备规格为10mg，重为200mg布洛芬胶囊剂。

不同摩尔比包合物对照品的制备：分别采用研磨法制备布洛芬/HP-β-CD超分子体包合物和相应的胶囊剂。布洛芬/HP-β-CD摩尔比为1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.5、1∶2。

拉曼光谱测试条件：激光激发波长785nm，激光功率10mw，分辨率2cm^-1，扫描范围200～3200cm^-1。分别对对照品和样品进行测定。

特征峰的选择及归属：比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中羰基伸缩振动谱带1606cm^-1为图谱中强吸收峰，发生了位移和形状变化，它的形状变化最为显著，且不受环糊精及辅料干扰，通过测定布洛芬、包合物的HNMR、CNMR谱以及应用计算机辅助化学软件(Computer-Aided Chemistry)模拟均证明分子中羰基最容易进入环糊精空腔，其谱带可作为特征参照峰指示包合程度。参见附图2。

结果收集：布洛芬拉曼光谱中谱带1606cm^-1峰型(1580-1620cm^-1)以Lorentzian、Gaussian函数拟合，以样品的拟合相似系数为指标。

结果分析：

定性分析：布洛芬的拉曼谱带1606cm^-1的峰型(1580-1620cm^-1)以Lorentzian函数拟合，相似系数为0.964；1∶1包合对照品中的该拉曼谱带拟合后相似系数为0.782，1∶1包合物样品的相似系数为0.767，胶囊剂样品的相似系数为0.759，说明样品中布洛芬与HP-β-CD已包合。

定量分析1：包合物样品的峰形(1590-1630cm^-1)相似系数为0.744，胶囊剂样品的峰形(1590-1630cm^-1)相似系数为0.759，分别以峰形相似系数(R)为指标，以1∶2对照包合物的峰形相似系数(0.710)作为最佳值，按下式计算得出包合物样品的相对包合程度或包合率为88.3％，片剂样品的相对包合程度或包合率为83.1％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(1-Rs/1-Rr)×100％Rs为样品参照峰的相似系数，Rr为标准对照品参照峰的相似系数。

定量分析2：选择特征参照峰1606cm^-1测定系列包合对照物的拉曼谱中特征参照峰1606cm^-1的峰形相似系数。分别与包合对照物溶出参数PD10进行回归分析后，建立溶出参数-峰形相似系数工作曲线(r＝0.988)，通过工作曲线定量计算药物的溶出参数，预测药物的溶出参数。

溶出实验精密称取适量样品(相当于10mg布洛芬)，按照《中华人民共和国药典》2000年二部附录XC浆法操作，以900mL重蒸水为溶出介质，37℃，转速50rpm，分别于规定时间取样8mL，同时补充等量介质，0.45μm微孔滤膜滤过，以重蒸水为空白对照，照分光光度法(中华人民共和国药典2000版二部附录IV A)，在225nm处测定吸光度，计算累积溶出率％。

选择特征参照峰1606cm^-1测定系列包合对照物的拉曼谱中特征参照峰1606cm^-1的峰形相似系数。与相应胶囊剂溶出参数PD30进行回归分析后，建立溶出参数-峰形相似系数工作曲线(r＝0.951)，通过工作曲线定量计算药物的溶出参数，预测药物的溶出参数。

        溶出参数-相似系数工作曲线

   包合比    相似系数   包合物PD₁₀   (％)  0∶1  0.5∶1  0.8∶1  1∶1  1.5∶1  2∶1  0.957  0.876  0.826  0.737  0.727  0.710  0.2  31.0  46.0  59.0  72.0  88.0

根据包合物样品图谱中特征参照峰1606cm^-1的相似系数为0.753，按照工作曲线计算PD5＝38.9％，实际测定数据为35.7％。

下表表示胶囊剂溶出参数PD₃₀-变异系数工作曲线的特征：

          溶出参数-变异系数工作曲线

  包合比  相似系数  胶囊剂PD₃₀(％)  0∶1  0.5∶1  0.8∶1  1∶1  1.5∶1  2∶1  0.033  0.144  0.193  0.233  0.263  0.298  5.  44.  57.  63.  84.  91.

根据样品图谱中特征参照峰1606cm^-1的相似系数为0.753，按照工作曲线计算PD₃₀＝83.4％，实际测定数据为85.7％。

定量分析3：选择特征参照峰1606cm^-1测定不同包合物、胶囊剂对照物的拉曼谱中特征参照峰1606cm^-1的峰形相似系数。建立相应的渗透模型，将不同包合物在渗透模型上测定相应的渗透参数(Papp)，分别与相应的渗透参数(Papp)进行回归分析后，建立渗透参数-相似系数工作曲线(r＝0.919)，通过工作曲线定量计算药物的渗透参数。预测包合物、胶囊剂样品中药物的渗透参数。

细胞转运实验 Caco-2细胞接种于常规培养瓶中，培养基为DMEM，含1％非必须氨基酸，10％胎牛血清，细胞培养于CO2培养箱中(37℃，5％CO2，相对湿度90％)。当细胞长至覆盖瓶底的80％～90％时，胰酶消化，并接种于Transwell的聚碳酸脂膜上(0.5mL/孔)，在Transwell的下腔加入培养液1.5mL。接种24h后更换培养液。接下来一周隔天换液，一周以后每天换液，培养20余天待用。单层细胞电阻测定将Caco-2以前述方法培养于Transwell中，每天测定单层细胞电阻(TEER)值，TEER达到300Ω/cm²；可用干通透实验。用PBS小心冲洗以除去黏附在细胞表面的代谢物。在AP池加入药物，在BL池加入无血清的DMEM培养液，37℃培养箱中孵育。分别于15、45、60、120、150min从BL池取样0.5mL，并立即补加等量的无血清DMEM培养液于BL池，用HPLC测定样品液中药物浓度，并由以下公式计算累计通透量ΔQ和表观渗透系数Papp。

             ΔQ＝CnV+∑CiΔV(i＝1，2...，n-1)

其中，ΔQ为累计通透量，Cn为每一次测量的药物浓度，V为BL侧液体体积，ΔV为每一次的取样体积。

                   Papp＝(dQ/dt)/(A·C0)

其中dQ/dt为单位时间药物转运量(μmol·L^-1)，A为转运膜的面积(cm²)，为药物的初始浓度(μmol·L^-1)。

           渗透系数-相似系数工作曲线

  包合比  相似系数  Papp cm/s  0∶1  0.5∶1  0.8∶1  1∶1  1.5∶1  2∶1  0.967  0.856  0.806  0.767  0.737  0.722  8.21×10^-6  9.49×10^-6  12.85×10^-6  13.57×10^-6  9.83×10^-6  9.16×10^-6

根据样品图谱中特征参照峰1606cm^-1的相似系数为0.753，按照工作曲线计算Papp＝21.4，实际测定数据为22.6。

定量分析4：选择特征参照峰1606cm^-1，峰型以Lorentzian函数拟合，获得胶囊对照物的拉曼谱中特征参照峰1606cm^-1的峰形相似系数。并测定不同胶囊对照物的相对生物利用度，通过峰形相似系数与胶囊剂生物利用度参数AUC进行回归分析后，建立生物利用度-峰形相似系数工作曲线(r＝0.875)，通过工作曲线定量计算药物的AUC。预测药物的生物利用度。

    生物利用度-峰形相似系数工作曲线

   包合比    相似系数   AUC_SS   ng h/ml  0∶1  0.5∶1  0.8∶1  1∶1  1.5∶1  2∶1  0.967  0.856  0.806  0.767  0.737  0.722  967.5  1069.7  1278.9  1287.4  1272.2  1288.3

请参照附表：片剂生物利用度AUC-峰形相似系数R工作曲线的特征。

根据片剂样品图谱中特征参照峰1642cm^-1的相似系数为0.753，按照工作曲线计算AUC＝1255.6ng h/ml，实际测定数据为1262.1ng h/ml。

实施例3，头孢妥仑匹酯与磺丁醚-β-环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱表征研究

头孢妥仑匹酯(Cefditoren Pivoxil)是第四代头孢抗菌素，对革兰氏阳性菌及阴性菌具有广泛抗菌谱，尤其对葡萄球菌属，包括肺炎链球菌在内的链球菌属等革兰氏阳性菌，大肠杆菌、卡他布兰汉氏球菌、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属、流感嗜血杆菌等革兰氏阴性菌以及消化链球菌属、痤疮丙酸杆菌、拟杆菌属等厌氧菌显示很强抗菌力。本研究采用头孢妥仑匹酯与磺丁醚-β-环糊精

(SBE-β-CD)包合后，形成超分子体系，并加入相应辅料后制备颗粒剂，采用拉曼光谱对制剂中的包合程度、溶出参数进行了分析和预测并与实验结果进行了比较。

样品的制备：采用研磨法制备头孢妥仑匹酯/SBE-β-CD超分子体包合物。头孢妥仑匹酯/SBE-β-CD摩尔比为1∶1。该样品加入乳糖、糊精等，制备100mg规格的颗粒剂。

不同摩尔比包合物对照品的制备：分别采用研磨法制备头孢妥仑匹酯/HP-β-CD超分子体包合物对照品。头孢妥仑匹酯/SBE-β-CD摩尔比为1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.5、1∶2。

拉曼光谱测试条件：激光激发波长514.5nm，激光功率10mw，分辨率2cm^-1，扫描范围200～3200cm^-1。分别对对照品和样品进行测定。

特征峰的选择及归属：头孢妥仑匹酯拉曼光谱中1600cm^-1特征峰归属于共轭双键的振动，1300cm^-1特征峰归属于酯基的振动。通过对头孢妥仑匹酯拉曼光谱中1600cm^-1，1300cm^-1特征峰的数学去卷积分析、Lorentzian函数拟合，将1600cm^-1处的谱带分成1620cm^-1，1590cm^-1，1570cm^-1，1564cm^-1四个亚峰，1300cm^-1处的谱带分成1340cm^-1，1311cm^-1，1290cm^-1三个亚峰。

结果收集：比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中振动谱带1590cm^-1为图谱中强吸收峰，它的强度变化最为显著，且不受环糊精及辅料干扰，将该峰作为参照峰。通过全面分析，证明包合作用对头孢妥仑匹酯图谱中1500cm^-1处峰的强度无影响。计算不同样品光谱中1590cm^-1处峰的强度与相应1500cm^-1处峰的强度之比，作为峰强变化系数(Ip)，以峰强变化系数为指标进行分析。

结果数据处理：

定性分析1：经数学处理后的头孢妥仑匹酯拉曼光谱中1590cm^-1，1290cm^-1在包合物样品和颗粒剂样品的拉曼光谱中强度明显下降，说明样品中头孢妥仑匹酯与SBE-β-CD已包合。

定量分析1：包合物样品的峰强变化系数为0.364，颗粒剂样品的峰强变化系数为0.359，以1∶2对照包合物的峰强变化系数(0.275)作为最佳值，按下式计算得出包合物样品的相对包合程度或包合率为87.7％，颗粒剂样品的相对包合程度或包合率为88.4％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(1-Is/1-Ir)×100％Rs为样品参照峰的峰强变化系数，Rr为标准对照品参照峰的峰强变化系数。定量分析2：测定系列包合对照物的拉曼谱中特征参照峰1590cm^-1的峰强变化系数(Ip)。分别与包合对照物溶出参数PD5和颗粒剂溶出参数PD30进行回归分析后，建立溶出参数PD5-峰强变化系数(Ip)工作曲线(r＝0.985)，数PD30-峰强变化系数(Ip)工作曲线(r＝0.955)，通过工作曲线定量计算药物的溶出参数，预测药物的溶出参数。

          溶出参数-峰强变化系数(Ip)工作曲线

   包合比   峰强变化   系数  包合物PD₅   (％)  颗粒剂PD₃₀   (％)  0∶1  0.5∶1  0.8∶1  1∶1  1.5∶1  2∶1  0.557  0.476  0.426  0.395  0.327  0.275  38.2  41.6  46.9  76.6  82.4  86.7  55.3  64.5  67.7  73.2  795  85.7

根据包合物样品图谱中特征参照峰1590cm^-1的峰强变化系数(Ip)为0.364，按照工作曲线计算PD5＝72.6％，实际测定数据为73.8％。

根据颗粒剂样品图谱中特征参照峰1590cm^-1的峰强变化系数(Ip)为0.355，按照工作曲线计算PD₃₀＝73.4％，实际测定数据为75.7％。

实施例4，丁卡因与羟丙基-β-环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱表征研究

丁卡因(Tetracaine)是临床广泛应用的麻醉药。本研究采用丁卡因与羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合后，形成超分子体系，并加入相应辅料后制备粉针，采用拉曼光谱对制剂中的包合程度、溶出参数进行了分析和预测并与实

验结果进行了比较。

样品的制备：采用冷冻干燥法制备丁卡因/HP-β-CD超分子体包合物。丁卡因/HP-β-CD摩尔比为1∶1。丁卡因，HP-β-CD，甘露醇，采用配料、过滤、冻干制备规格为50mg的粉针。

不同摩尔比包合物对照品的制备：分别采用冷冻干燥法制备丁卡因/HP-β-CD超分子体包合物和相应的丁卡因。丁卡因/HP-β-CD摩尔比为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3。

拉曼光谱测试条件：激光激发波长514.5nm，激光功率10mw，分辨率2cm^-1，扫描范围200～3200cm^-1。分别对对照品和样品进行测定。

特征峰的选择及归属：丁卡因拉曼光谱中特征峰归属于芳香环的振动，1690cm^-1特征峰归属于酯基的振动。比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中振动谱带1601cm^-1为图谱中强吸收峰，它的位移变化最为显著，且不受环糊精及辅料干扰，将该峰作为参照峰。

结果收集：计算不同样品光谱中1601cm^-1处峰的位移值(Δf)。作为比较的指标。

结果数据处理：

定性分析1：丁卡因拉曼光谱中1601cm^-1，1690cm^-1特征峰在包合物样品和粉针样品的拉曼光谱中1601cm^-1向高波数移动到1616cm^-1，1690cm^-1特征峰明显增宽，说明样品中丁卡因与HP-β-CD已包合。

定量分析1：计算不同样品光谱中1601cm^-1处峰的位移值。包合物样品位移值为12.4cm^-1，粉针样品的位移值为12.9cm^-1，以位移值(Δf)为指标，以1∶3对照包合物的位移值(15.7cm^-1)作为最佳值，按下式计算得出包合物样品的相对包合程度或包合率为82.7％，粉针样品相对包合程度或包合率为86.0％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(Δfs/Δfr)×100％Δfs为样品参照峰的位移值，Δfr为标准对照品参照峰的位移值。

定量分析2：选择特征参照峰1601cm^-1，测定系列包合对照物的拉曼谱中特征参照峰1601cm^-1的位移值(Δf)。分别与包合对照物溶出参数PD1进行回归分析后，建立包合物溶出参数PD1-峰位移值(Δf)工作曲线(r＝0.992)，分别与相应粉针溶出参数PD1进行回归分析后，建立粉针溶出参数PD1-峰位移值(Δf)工作曲线(r＝0.979)，通过工作曲线定量计算、预测药物的溶出参数。

    溶出参数-峰位移值(Δf)工作曲线

   包合比   峰位移值   (Δf)  包合物PD1(％)   0∶1  0.5∶1  0.8∶1  1∶1  1.5∶1  2∶1  5.8  6.8  10.9  13.7  15.5  15.7 3.2 34.8 59.7 81.9 85.5 88.1

根据包合物样品图谱中特征参照峰的峰位移值(Δf)为12.4cm^-1，按照工作曲线计算PD1＝68.4％，实际测定数据为66.7％。

根据粉针样品图谱中特征参照峰的峰位移值(Δf)为12.9cm^-1，按照工作曲线计算PD₁＝70.4％，实际测定数据为71.7％。

实施例5，盐酸金刚烷胺与羟丙基-β-环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱表征研究

盐酸金刚烷胺(Amantadine hydrochloride)用于预防和治疗流感病毒所引起的呼吸道感染及抗震颤麻痹和帕金森综合症。本研究采用盐酸金刚烷胺与羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合后，形成超分子体系，并加入相应辅料后制备针剂，采用拉曼光谱对制剂中的包合程度、包合率进行了分析和预测并与实验结果进行了比较。

样品的制备：采用饱和溶液法制备盐酸金刚烷胺/HP-β-CD超分子体包合物。盐酸金刚烷胺/HP-β-CD摩尔比为1∶2。通过配料、过滤、灌封、灭菌制备规格为100mg的针剂。

不同摩尔比包合物对照品的制备：分别采用饱和溶液法制备盐酸金刚烷胺/HP-β-CD包合物溶液。盐酸金刚烷胺/HP-β-CD摩尔比为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4。

拉曼光谱测试条件：激光激发波长514.5nm，激光功率10mw，分辨率2cm^-1，扫描范围200～3200cm^-1。分别对对照品和样品进行测定。

特征峰的选择及归属：盐酸金刚烷胺水溶液拉曼光谱中强吸收谱带720，777，1218cm^-1特征峰归属于C-C伸缩振动，CH2摇摆振动、CH弯曲振动。

结果收集：比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中777cm^-1谱带为图谱中强吸收峰，它的位移变化最为显著，且不受环糊精及辅料干扰，将该峰作为参照峰。计算不同样品光谱中777cm^-1处峰的位移值。

结果数据处理：

定性分析1：盐酸金刚烷胺拉曼光谱中777cm^-1特征峰在针剂样品的拉曼光谱中这些谱带向高波数移动到793cm^-1；720cm^-1特征峰在针剂样品的拉曼光谱中这些谱带向高波数移动到731cm^-1；1218cm^-1特征峰在针剂样品的拉曼光谱中这些谱带向低波数移动到1206cm^-1。说明样品中盐酸金刚烷胺与HP-β-CD发生了包合作用。

定量分析1：针剂样品的位移值为16cm^-1，以1∶4对照包合物(包合程度最高)的位移值(22cm^-1)作为最佳值，按下式计算得出针剂样品的相对包合程度或包合率为72.7％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(Δfs/Δfr)×100％Δfs为样品参照峰的位移值，Δfr为标准对照品参照峰的位移值。

实施例6，氯己定与羟丙基-β-环糊精的相互作用及其药学性能的拉曼光谱表征研究

氯己定(Chlorhexidine)为表面恬性剂型杀菌剂，对革兰阳性菌及革兰阴性菌均有效。含漱剂用于口腔炎；栓剂用于细菌性阴道炎，痔疮。本研究采用氯己定与羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合后，形成超分子体系，并加入相应辅料后制备栓剂或含漱液，采用拉曼光谱对制剂中的包合程度、溶出参数、溶解参数、渗透参数进行了分析和预测并与实验结果进行了比较。

样品的制备：采用喷雾干燥法制备氯己定/HP-β-CD超分子体包合物。氯己定/HP-β-CD摩尔比为1∶1。该样品加入可可豆脂、石蜡等辅料，制备规格为20毫克栓剂。采用配料、过滤、灌装等工艺制备0.2％氯己定含漱剂。

不同摩尔比包合物对照品的制备：分别采用喷雾干燥法制备氯己定/HP-β-CD超分子体包合物。氯己定/HP-β-CD摩尔比为1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.5、1∶2。

拉曼光谱测试条件：激光激发波长514.5nm，激光功率10mw，分辨率2cm^-1，扫描范围200～3200cm^-1。分别对对照品和样品进行测定。

特征峰的选择及归属：氯己定拉曼光谱中1564cm^-1特征峰归属于共轭双键的振动。为图谱中强吸收峰，且不受环糊精及辅料干扰，将该峰作为参照峰。

结果收集：比较每个对应特征峰的振动谱带的变化情况，发现不同包合程度的包合物的图谱中谱带1564cm^-1的位移变化最为显著，计算不同样品光谱中1564cm^-1处峰的位移值。

结果数据处理：

定性分析1：氯己定拉曼光谱中1564cm^-1特征峰在包合物样品和栓剂、含漱剂样品的拉曼光谱中向高波数移动到1614、1611、1609cm^-1。说明样品中氯己定与HP-β-CD已包合。

定量分析1：计算不同样品光谱中1564cm^-1处峰的位移值。包合物样品的位移值为50cm^-1，栓剂样品的位移值为47cm^-1，含漱剂样品的位移值为45cm^-1，以1∶2对照包合物(包合程度最高)的位移值(57cm^-1)作为最佳值，按下式计算得出包合程度或包合率分别为：包合物样品87.7％，栓剂样品为82.5、含漱剂样品为78.9％。

包合程度或包合率(complexation efficiency)＝(Δfs/Δfr)×100％。