一种H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其制备方法及其用途

摘要

本发明涉及一种能够特异性的结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体和分泌该单克隆抗体之杂交瘤细胞系，以及制备该单克隆抗体的方法。本发明还涉及利用该单克隆抗体制备的用于检测样品中H5亚型禽流感病毒的系列检测试剂盒，以及所述单克隆抗体在检测样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒以及治疗方面的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够特异性的结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体和分泌该单克隆抗体之杂交瘤细胞系，以及制备该单克隆抗体的方法。本发明还涉及利用该单克隆抗体制备的用于检测样品中H5亚型禽流感病毒的系列检测试剂盒，以及所述单克隆抗体在检测样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒以及治疗方面的用途。

发明背景

自H5型禽流感于1996年首先在我国广东省农场的鹅群爆发(Xu Xet al，1999，Virology)以来，由此病毒演生出来的另一株H5病毒在香港的禽鸟农场(1997年4月)及市场(1997年11月)爆发，引起了历史上禽流感病毒第一次直接由禽传人事件，前后共18例确诊病例中有6人死亡。2003年以来，H5病毒株在整个东亚及东南亚国家的相继暴发，WHO及流感界预测H5禽流感病毒将最有可能成为下一次人类大流感爆发的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我国十几个省暴发，并在中国香港、泰国、荷兰等发现H5型禽流感传染鸡、鸭、苍鹭、虎、猫等多种动物的事件。更令人担忧的是，在泰国已经出现疑似人传染人事件，马来西亚也有多例报道。

最新研究结果表明(Li KS et al.，2004，Nature)，华南水禽(家鸭)为H5型禽流感病毒的主要携带者及传播者，H5型禽流感的爆发有明显的季节性，并伴随着生物多态型(多种基因型)的演变。

然而，分子流行病学研究表明，目前鸭群种大约有30％的阳性感染并无任何症状，鸡群中也有达10％的流行且无症状带毒。这些受感染的动物又能够不断使人受到新的感染，对人类的健康构成巨大的威胁。

有关专家一致认为要控制好H5高致病性禽流感病毒在整个东亚东南亚的流行，早期诊断是先决条件，然后才能做到早隔离、早处理，对人做到早治疗。

采用传统的病毒分离及血清诊断方法诊断禽流感病毒需时4-5天，且目前大部分人及动物疾控系统实验室缺乏三级生物安全实验室，故东亚各国及地区对H5暴发的诊断明显滞后。常见的情况是大量鸡只死亡和扑杀行动完成后仍未有实验室的确诊报告，给控制病毒的暴发带来很大不便。另外，因少数禽类(特别是水禽，如家鸭)存在着无症状带毒情况，检疫系统又无有效的检测手段，这种情况的持续发展，引起了该病毒在多个国家地区反复暴发，迁延不断的局面。

同时，由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96为代表株)属高致病性病毒，对目前常用的动物模型均有致死性，而采用基因工程方法表达的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多个著名实验室先后尝试制备针对该病毒系的单克隆抗体均未获成功。目前对该病毒抗原性分析不得不采用特异性及反应性均明显达不到诊断试剂要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制备的单克隆抗体。

鉴于上述情形，目前迫切期望能有一种方便、快捷、实时的诊断方法和手段。从而及时把第一代跨种族传染的病人隔离治疗，防止病毒向人传人发展，在病毒未适应人类之前就打断其传播链，从而从根本上消除该病毒对我们的大流感威胁。

国内有关抗禽流感病毒H5亚型检测研究已有文献报道。扬州大学畜牧兽医学院秦爱建等(秦爱建，邵红霞，钱琨等，中国预防兽医学报，2003，03期)研制了抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体，应用这些单克隆抗体进行间接免疫荧光试验被证明能在24小时内迅速检测出相应的禽流感病毒。北京出入境检验检疫局利用荧光RT-PCR快速检测高致病力禽流感病毒H5亚型，检测时间缩短为4小时，于2002年1月8日经过全国专家鉴定。郭元吉在“人禽流感研究现状”一文中综述了H5亚型毒株抗体检测需用微量中和实验或特异性高的ELISA(郭元吉，中华实验和临床病毒学杂志，2004，03期)，但有关利用ELISA检测H5亚型的研究性文献却未见相关报道。

国外有关利用ELISA检测H5N1抗体的研究已有报道。Rowe等报道了应用重组血凝素蛋白作为抗原包被，利用间接ELISA检测H5N1抗体，其ELISA的灵敏度为80％，特异度为62％(Rowe T，Abernathy RA，Hu-Primmer J，et al，J Clin Microbiol.1999 Apr；37(4)：937-43)，但该文献并非针对H5N1亚型血凝素HA基因特异的单克隆抗体。Zhou等(ZhouEM，Chan M，McIsaac M et al.Avian Dis.1998，42(4)：757-61)、Shafer等(Shafer AL，Katz JB，Eernisse KA.Avian Dis.1998，42(1)：28-34)采用竞争ELISA法检测禽流感病毒抗核心蛋白抗体，但检测对象均为A型禽流感所有H1-H15亚型的NP蛋白抗体，不能确定亚型。Lu报道了基于单克隆抗体的Dot-ELISA检测禽流感病毒(AIV)，该方法直接检测AIV抗原，其特异性在于不会与其他禽类病毒发生交叉反应(Lu H.Avian Dis.200347(2)：361-9)。虽然Sala等建立了基于H7亚型表面糖蛋白特异的单克隆抗体的ELISA，但其亚型为H7；单克隆抗体为表面糖蛋白特异的单克隆抗体，并非H5亚型血凝素HA基因特异的单克隆抗体(Sala G，Cordioli P，Moreno-Martin et al.Avian Dis.2003，47(3Suppl)：1057-9)。

遗憾的是，现有禽流感病毒免疫学诊断手段使用的单克隆抗体大部分针对的是核蛋白(NP蛋白)，因而其检测的是A型(也称甲型)流感病毒，但实际上A型流感病毒包括H1～H15共15个亚型，其中相当大的亚型均无致病性或有低致病性，只有H5亚型禽流感病毒为危害最大的高致病性禽流感病毒。因而现有技术远不能满足临床检测的需要。

本发明的根本目的在于克服现有禽流感病毒免疫检测技术的缺陷，所采用的单克隆抗体针对的为H5亚型的HA蛋白，因而能够特异的检测具有高致病性的H5亚型禽流感病毒。

发明内容

本发明涉及的一个方面涉及一种特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，或其保守性变异体或活性片段，或者与所述单克隆抗体具有交叉反应性的针对H5亚型禽流感病毒的其他单克隆抗体。

其中，所述保守性变异体或活性片段的氨基酸序列与本发明所述单克隆抗体之氨基酸序列相比，可以存在一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与H5亚型禽流感病毒特异性结合。

本发明的一个方面，涉及一种特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其是由于2004年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)的保藏号为CCTCC-C200424的小鼠杂交瘤细胞株2F2所分泌的抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体2F2。

更具体的，本发明所要求保护的特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其特征为其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的又一方面，还涉及所述特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体2F2的保守性变异体或其片段；由所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序列，或其保守性变异体和/或其片段，组装成的单链抗体；由所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序列或其保守性变异体和/或其片段构成的嵌合单克隆抗体，或改形单克隆抗体，或其他人源化形式的单克隆抗体或抗体片段；

本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换、等修饰，获得保守性变异体或其片段，而仍能保持与H5亚型禽流感病毒特异性结合。

在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，本领域普通技术人员也完全知晓可以通过常规的基因工程和蛋白质工程方法，将本发明所述的重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序列，或将如前述得到的其保守性变异体和/或其片段，组装成的单链抗体，其仍保留特异结合H5亚型禽流感病毒的能力。

在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，本领域普通技术人员也知晓如何装配所述重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序列或其保守性变异体的嵌合单克隆抗体，或改形单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或抗体片段，其仍保留特异结合H5亚型禽流感病毒的能力。

本发明的另一方面，还涉及编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，或其简并性序列的核酸分子。

本发明又一方面还涉及，上述的核苷酸序列经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和轻链可变区保守性变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改形单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或抗体片段，仍保留特异结合H5亚型禽流感病毒的能力。

本发明又一方面，涉及一种包含权利要求5和6所述核酸分子的重组表达载体，以及一种经所述重组表达载体转化的宿主细胞，其能够表达本发明所述的单克隆抗体，其保守性变异体，或单链抗体或嵌合抗体或改形抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或抗体片段，或融合蛋白或双特异抗体或其他形式的多肽或多肽类似物。

本发明的再一方面涉及包含所述单链抗体或嵌合单克隆抗体或改形单克隆抗体或其他人源化形式单克隆抗体或抗体片段的融合蛋白，或双特异抗体或与药物偶联而成的分子或其他形式的结构，只要其仍保留特异结合H5亚型禽流感病毒的能力。

本发明的又一方面涉及所述单链抗体或嵌合单克隆抗体或改形单克隆抗体或其他人源化形式单克隆抗体或抗体片段用于预防和或诊断H5亚型禽流感病毒的用途。

本发明的再一方面，还涉及一种用于诊断H5亚型禽流感病毒感染的试剂盒，特别是检测样品中H5亚型禽流感病毒抗原或抗体的试剂盒。

具体的，本发明涉及一种用于检测样品中抗H5亚型禽流感病毒的抗体的试剂盒，其中包含选自至少一种本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，至少一种所述的单链抗体、嵌合单克隆抗体或改形单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，或其任一组合的成分。适当的，本发明所述试剂盒中还含有适于所述抗原抗体反应的检测试剂。

具体的，本发明涉及一种用于检测样品中的H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其中包含选自至少一种本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或至少一种所述的单链抗体、嵌合单克隆抗体或改形单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，或其任一组合的成分。适当的，本发明所述试剂盒中还含有适于所述抗原抗体反应的检测试剂。

本发明还涉及一种用于体外检测样品中H5亚型禽流感病毒抗原和/或抗体是否存在的方法，其包括以下步骤：

a)提供可对H5亚型禽流感病毒特异结合的第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体或第二抗体至少有一种为本发明所述单克隆抗体或其片段；

b)提供一种能与第二抗体有效结合的信号产生体，所产生的信号强度或者仅与第二抗体的量有关；或者优选地第二抗体直接标记有信号产生体；

c)将第一抗体连接到载体上，形成第一抗体-载体结合物；

d)使待测样品与第一抗体-载体结合物接触，从而使样品中可能存在的H5亚型禽流感病毒结合到抗体-载体结合物上；

e)使与信号产生体有效结合的第二抗体与病毒-第一抗体-载体结合物接触，形成信号产生体-第二抗体-病毒-第一抗体-载体结合物；

f)测定由信号产生体产生的信号。

其中如需要，所述第一抗体或第二抗体可分别为本发明所述的单克隆抗体或其结合活性片段的组合。

本发明中，用于检测所述禽流感H5亚型毒株的样品包括但不限于动物或患者排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒液等。

附图说明

图1，金标法H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒的测定结果，其中a)出现两条红色线，认定为阳性；b)只出现质控线，认定为阴性；c)不出现红色线，则认定为无效。

图2，金标法H5亚型流感病毒anti-HA抗体检测试剂盒的测定结果，其中a)只出现质控线，认定为阳性；b)出现两条红色线，认定为阴性；c)不出现红色线，则认定为无效。

下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述。所述实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。载体和宿主的选择以及试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

实施例

实施例1：抗H5亚型禽流感病毒HA基因单克隆抗体的制备

1)抗原的制备：

以H5N1-Yu22株病毒接种9天龄受精鸡胚，30℃孵育2天后，收集鸡胚液，得到扩增后的H5N1-Yu22株病毒。收集活病毒，在4℃下以0.03％福马林福尔马林灭活，灭活病毒经HA检测，确定灭活病毒液的滴度(注：HA滴度测定和HI检测的具体方法参见WHO操作指南，我们选择HA＝1024，该病毒株由香港大学微生物系提供)。

2)小白鼠：雌性，6周龄Balb/c鼠购自厦门大学抗癌中心，并在该中心饲养实验。

3)杂交瘤的制备：

我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体，详细方法参见Ed Harlow et al.，“Antibodies A Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory 1988.简要过程如下：

a)小鼠免疫：

将上述预处理的病毒液与福氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射300ul。首次免疫后15d和29d，分别用同样剂量的病毒液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。第二加强后采血检测HI的抑制效价，当效价达到1∶640后，取小鼠脾脏做融合。融合前72hr再次加强免疫，经尾静脉注射病毒液1次，50ul/只。制备10块融合板。

b)融合：

取血清HI滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，经PEG1500作用1min将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液100ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过血凝抑制(HI)实验筛选，经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。

4)杂交瘤的筛选：

融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做血凝抑制(HI)检测，阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定抑制H5N1-Yu22株病毒与鸡血发生凝集为止。

5)筛选结果：

获得三株单克隆抗体2F2、3C8、7C6。

6)杂交瘤的培养：

稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔转移至24孔，再转移至50ml细胞瓶经扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，7-10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。

7)单克隆抗体的纯化：

腹水先用50％的硫铵沉淀处理，然后对PBS，pH7.2透析，之后用DEAE柱在HPLC下纯化，得到纯化后的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度。

实施例2：H5亚型流感病毒HA重组抗原的制备

1)Bacmid-H5HA重组病毒获得

选取禽流感AIV-H5N1-Yu22病毒株的HA全长cDNA基因为模板(香港大学微生物系提供)，设计一对引物(上海博亚合成)，5’端设BamHI，3’端设置EcoRI，进行PCR扩增，用胶回收Kit(华舜公司)回收PCR产物，得到一条1.7kb左右的DNA片段，然后克隆入pMD18-T载体(大连宝生物公司)中，经酶切鉴定和测序得到正确的克隆质粒pMD18-T-H5HA。然后将目的片段从pMD18-T-H5HA上以BamHI和EcoRI双酶切后得到H5HA基因，然后连接入pFastBacl载体中，连接物以常规质粒转化大肠杆菌的方法转化CaCl₂致敏的E.coli.DH5α，经鉴定得到正确的pFB-H5HA质粒，然后取质粒pFB-H5HA再转化E.ColiDH10Bac感受态细胞，使得pFB-H5HA与感受态细胞中的穿梭质粒bacmid和辅助质粒发生重组，经抗性筛选得到重组病毒Bacmid-H5HA。抗性筛选是通过涂布含X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的LB平板筛选白色菌落来实现的。将白色菌落挑入含3种同样抗生素的液体LB培养基，37℃震荡培养过夜，碱法小量提取Bacmid-H5HA重组病毒质粒核酸。

2)Bacmid-H5HA重组病毒的转染与扩增。

在无血清Grace培养基下，以转染试剂Cellfectin介导，将Bacmid-H5HA重组病毒质粒转染预先铺好于六孔板上的sf21昆虫细胞(80％覆盖率，28℃无菌培养)，使重组病毒进入昆虫细胞并表达，4天后收集培养上清，再以1∶20的体积比进行二次感染，以获得病毒滴度更高的培养上清。

3)免疫荧光法验证Bacmid-H5HA重组表达抗原的活性

收集感染病毒72hr的细胞，使贴壁于载玻片上，经甲醇固定、水化等步骤处理后，再加入抗禽流感H5亚型的标准鸡血清室温孵育1hr，PBS洗涤一次后加入FITC标记的抗鸡二抗室温孵育1hr，经PBS洗涤三次后，盖上盖玻片，用Nikon正置荧光显微镜采用蓝光激发观察，并用数码相机Nikon coolpix990采集荧光图像。结果显示H5HA基因在昆虫细胞中成功表达(注：

整个昆虫表达系统所用的质粒、培养基、细胞株均购自Invitrogen公司，具体的操作步骤详见该公司的操作手册)。

实施例3：H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒(酶联免疫法，ELISA)的组装。

1)原理：

本试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的H5亚型流感病毒的HA抗原。

先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体，当裂解后的H5型流感病毒HA抗原加到微孔后，预包被的单克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体也能与之结合，而后通过酶催化底物显色程度判断结果。当标本中不含流感病毒抗原或不是H5型流感病毒时，底物不会显色。可检测的标本包括排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒等。

2)酶标板的制备：

在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，单克隆抗体包被使用10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，在37℃下包被过夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween20)洗涤一次，扣干后再加入封闭液(10mMPBS+2％明胶)，37℃封闭2hr，再扣干并真空抽干包装成成品试剂盒酶标板(8×12孔)。

3)试剂盒其它成分的配置：

a)病毒裂解液组成：

裂解液A(LB-A)：6％CHAPS+2％Tween-20+1％Tween-80。

裂解液B(LB-B)：100mM PMSF，使用异丙醇溶解，工作终浓度为2mM。

裂解液C(LB-C)：10mM PBS，pH7.4

b)酶标试剂：以HRP标记抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，得到稀释度合适的酶标试剂。

c)阳性对照：使用合适滴度的H5N1-Yu22株灭活病毒作为阳性对照。

d)阴性对照：以裂解液A为阴性对照。

e)显色剂A液：

f)显色剂B液：

g)终止液：

h)浓缩洗涤液：201x PBST

i)封板膜：2张

j)自封袋：1个

k)说明书：1份

4)检测过程：

a)配液：将50ml浓缩液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。

b)编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同)。

c)样品处理及加样：

当样品为液体时(包括原始标本、鸡胚培养标本、细胞培养标本)：

按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B预配适量的LB-A与LB-B的混合液并振荡混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待测标本，再加入100ul配好的上述裂解液进行反应。

当样品为干拭子原始标本时：

取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，振荡溶解标本，室温静置30min后，重新振悬后，6000rpm离心5min，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。

当样品为干粪便原始标本时：

取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，将干粪便配置成10％(w/v)的粪悬液标本，振荡溶解标本，室温静置30min后，重新振悬，6000rpm离心5min，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。

每次检测均需要设置阴阳性对照孔，每孔加100ul对照液。

d)孵育：用封口膜封板后置微量振荡器上中等速度室温(25～28℃)震荡60min。

e)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

f)加酶：分别在相应孔中加入酶标试剂100ul。

g)孵育：用封口膜封板后，置37度温育30分钟。

h)重复步骤6。

i)显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30分钟。

j)测定：每孔加终止液1滴(50ul)，轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

5)结果判定：

a)阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔≤0.1(阴性对照孔OD值若大于0.1应舍弃，如果所有阴性对照孔OD值都大于0.1，应重复实验。若阴性对照孔小于0.03，则按0.03计算)。

b)阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔OD值≥0.50。

c)临界值(CUTOFF)计算：阴性对照孔OD均值+0.15。

d)阳性判定：样品OD值≥临界值(CUTOFF)者为禽流感病毒H5型HA抗原反应阳性。

e)阴性判定：样品OD值＜临界值(CUTOFF)者为禽流感病毒H5型HA抗原反应阴性。

实施例4：H5亚型流感病毒anti-HA抗体检测试剂盒(酶联免疫法，ELISA)的组装。

1)原理：

本试剂盒采用竞争法检测血清标本中的H5型流感病毒HA抗原特异性抗体。

先在试剂盒中微孔板条上一次包被抗H5亚型流感病毒HA的单克隆抗体，二次包被H5亚型流感病毒HA基因的重组表达抗原。在加入血清标本和酶标单克隆抗体后，标本中的特异性抗体与酶标单克隆抗体竞争结合酶标板上的抗原，如果加入的血清标本能明显抑制酶标单克隆抗体与抗原的结合，则表明标本中含流感病毒H5型HA抗原的特异性抗体。当标本中不含流感病毒抗体或不是H5型流感病毒抗体，不会抑制酶标单克隆抗体与抗原的反应。

2)酶标板的制备：

在试剂盒的聚乙烯微孔板条上一次预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，单克隆抗体包被使用10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，在37℃下包被过夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween20)洗涤一次，扣干后再加入封闭液(10mMPBS+2％明胶)，37℃封闭2hr。扣干后进行二次包被，使用10mM PBS，pH7.4溶液稀释重组表达抗原后按每孔100ul加入到一次包被处理后的微孔板上，37℃包被2hr，洗涤一次后再37℃封闭2hr，最后扣干并真空抽干包装成成品试剂盒酶标板(8×12孔)。

3)试剂盒其它成分的配置：

a)酶标试剂：以HRP标记抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体，得到稀释度合适的酶标试剂。

b)阳性对照：使用合适浓度的抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体作为阳性对照。

c)阴性对照：使用100％小牛血清(NBS)作为阴性对照。

d)显色剂A液：

e)显色剂B液：

f)终止液：

g)浓缩洗涤液：20x PBST

h)封板膜：2张

i)自封袋：1个

j)说明书：1份

4)检测过程：

a)配液：将50ml浓缩液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。

b)编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同)。

c)加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴性、阳性对照50ul。

d)加酶：在相应孔中加入酶标试剂50ul。

e)孵育：混匀后用封口膜封板，置37度温育60分钟。

f)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

g)显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。

h)测定：每孔加终止液1滴(50ul)，轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

5)结果判定：

a)阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔≥1.0。

b)阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔OD值≤0.1。

c)临界值(Cutoff值)计算：Cutoff值＝阴性对照孔OD均值/2。

d)阳性判定：样品OD值＜Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特异性抗体阳性。

e)阴性判定：样品OD值≥Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特异性抗体阴性。

实施例5：H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒(金标法)的组装。

1)原理：

a)本试纸条是采用胶体金免疫层析技术研制的新一代诊断试剂，可检测的标本包括排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒等。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30分钟。

b)本试纸条分别在硝酸纤维素膜上检测区包被anti-HA的单克隆抗体，对照区包被羊抗鼠IgG。检测时样品中H5型流感病毒与标记胶体金的anti-HA单克隆抗体(Ab--Au)形成复合物(Ag-Ab-Au)，由于层析作用复合物沿膜带移动，可与包被在检测区的anti-HA的单克隆抗体形成双抗体夹心免疫复合物。如为阳性样品，则可分别在检测区及对照区各凝集形成一条红色线；如为阴性样品，则只在对照区形成一条红色线。

2)试剂盒测试条的制备：

同常规方法。

3)试剂盒组成：

a)测试条：

b)裂解液：

c)说明书：

4)操作过程：

a)样品处理及加样：

i.样品为液体时(包括原始标本、鸡胚培养标本、细胞培养标本)：

按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B预配适量的LB-A与LB-B的混合液并振荡混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待测标本，再加入70ul配好的上述裂解液进行反应。

ii.样品为干拭子原始标本时：

取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，振荡溶解标本，室温静置30min后，重新振悬后，6000rpm离心5min，吸取上清检测，每孔加70ul进行反应。

iii.样品为干粪便原始标本时：

取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，将干粪便配置成10％(w/v)的粪悬液标本，振荡溶解标本，室温静置30min后，重新振悬，6000rpm离心5min，吸取上清检测，每孔加70ul进行反应。

b)在加样处缓慢加样70ul，平置于室温。

5)结果判定：30分钟内观察结果。

出现两条红色线，认定为阳性；只出现质控线，认定为阴性；不出现红色线，则认定为无效，结果参见图1

实施例6：H5亚型流感病毒anti-HA抗体检测试剂盒(金标法)的组装。

1)原理：

a)本试纸条是采用胶体金免疫层析技术研制的新一代诊断试剂，可检测血清标本中的H5型流感病毒抗体。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30分钟。适用于H5型HA抗体的初筛。

b)本试纸条分别在硝酸纤维素膜上检测区包被anti-HA的单克隆抗体，对照区包被羊抗鼠IgG。玻璃纤维上冻干有anti-HA单克隆抗体标记胶体金和H5型流感病毒重组HA表达抗原，采用竞争法来检测待测样品中的H5型流感病毒anti-HA抗体。如样品中含anti-H5的抗体则与anti-HA单克隆抗体标记胶体金竞争从而阻断复合物的形成不能显色；若为阴性，则形成复合物显色。

2)试剂盒测试条的制备：

同常规方法。

3)试剂盒组成：

a)测试条

b)说明书

4)检测过程：

将密封袋打开，取出所需试纸条，在加样处缓慢加入血清样品70微升，平置于室温，30分钟内观察结果，超出30分钟，结果无效。

5)结果判定：

只出现质控线，认定为阳性；出现两条红色线，认定为阴性；不出现红色线，则认定为无效，参见图2。

实施例72F2抗体轻链基因和重链基因可变区的分离

半贴壁培养10⁷个2F2交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使悬浮，转移到新的4ml离心管中，1500rpm离心3min，收集沉淀的细胞，重悬于100ul无菌PBS(pH7.45)中，转移到一新的1.5ml离心管中。加入800ul Trizol(Roche，Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10min。加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，静置10min，4℃12000rpm离心15min，转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入600ul 75％乙醇洗涤，4℃12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70ulDEPC H₂O中，加入1ul反转录引物Oligo(dT)_(12-18)(Progega)，1uldNTP(上海生工)，置72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min，加入20ul 5x反转录缓冲液，2ul AMV(10u/ul，Pormega)，1ul Rnasin(40u/ul，Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。

抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应(PCR)法，使用根据Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物组以及另外设计合成的两条下游引物MVJkR、MKCR1(5’-TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGTTGA A-3’)(上海博亚公司合成)，模板即为以上合成的2F2 cDNA。

轻链可变区基因的分离使用K轻链的MuIgkV_L5’-A至G的7组上游引物，下游引物为MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3’)。分别使用7组上游引物和MVJkR组成引物对，在47℃至56℃之间进行梯度PCR扩增。结果在MulgkV_L5’-G2(5’-CGA CAT GGT(C/T)CT(C/T)AT(A/C/G)TC CTT GCT GTT CTG G-3’)/MVJkR引物对及以下条件的扩增获得一条单一的约400bp的DNA片段，PCR条件为：94℃5min，94℃40s 53℃1min 72℃50s 35cycles，72℃15min。回收并克隆至pMD 18-T载体，送至上海博亚公司测序，序列经blast比对后确定为2F2轻链可变区序列(见SEQ ID NO：4)，其推测的氨基酸序列见SEQID NO：2。

重链基因可变区的分离使用IgG的MuIgGV_H5’-A至F的6组上游引物，下游引物为MV_HR(5’-CCC AAG CTT CCA GGG(A/G)CCA(A/G)(G/T)GGA TA(A/G)AC(A/G/C/T)G(A/G)T GG-3’)。分别使用6组上游引物和MV_HR下游引物组成引物对，在47℃至56℃之间进行梯度PCR扩增。结果在MulgV_H5’-C1(5’-CGA CAT GGC TGT C(C/T)T(A/G)G(C/G/T)GCT G(C/T)T C(C/T)T CTG-3’)/MV_HR引物对及以下扩增条件获得一条单一的约400bp的DNA片段：94℃5min，94℃40s 53℃1min 72℃40s 35cycles，72℃15min。回收并克隆至pMD 18-T载体，送至上海博亚公司测序，序列经blast比对后确定为2F2重链基因可变区序列(见SEQ ID NO：3)，其推测的氨基酸序列见SEQ ID NO：1。

                                 序列表

<110>厦门大学

<120>一种H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其制备方法及其用途

<130>IDC050009

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>artificial

<400>1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Arg Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr

            20                  25                  30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Gly Met Ile Trp Ala Glu Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu

65                  70                  75                  80

Glu Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Glu Val Ile Thr Thr Glu Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Ser Val Thr Glu Ser

        115

<210>2

<211>108

<212>PRT

<213>artifical

<400>2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

            20                  25                  30

Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Gly Met Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Thr Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>3

<211>357

<212>DNA

<213>artificial

<400>3

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagcg cctgtccatc    60

acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg tacactggat tcgccagtct    120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatgggctg agggaagaac cgactataat    180

tcagttctca aatccagact gagcatcaat aaggacaatt ccaggagcca agttttctta    240

gaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtact actgtgccag agaggtgatt    300

actacggaag cctggtactt cgatgtctgg ggccaaggaa cctcggtcac cgaatct       357

<210>4

<211>324

<212>DNA

<213>artificial

<400>4

gacattgtga tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct    60

ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttat actggtatca acaaaaatca    120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc    180

agattcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca ctatcaacag tgtggaacct    240

gaagatgttg gaatgtatta ctgtcaaaat ggtcacacct ttccgctcac gttcggtgct    300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg                                           324