中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因及其所编码的抗菌肽与应用

摘要

本发明公开了一种中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因及其编码的抗菌肽，还公开了所述中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。利用本发明获得的重组的中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因及其所编码的抗菌多肽与应用，尤其涉及一种中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因及其所编码的抗菌多肽与应用；属基因工程技术领域。

背景技术

中国对虾是我国重要的海产养殖品种，但90年代以来，对虾病大规模暴发，使海产养殖业遭受严重损失。国内许多学者在对虾病防治方面作了大量的工作，并且取得了很多进展，对虾的养殖产量也逐年回升；但到目前为止，对虾病仍是困扰对虾养殖业的一个难题。解决这一问题主要应从控制病原和提高对虾免疫力等方面入手，对虾的防御机制主要依赖血细胞的活动，包括吞噬外来物质或形成包涵体，血细胞合成抗菌物质(抗菌肽或多肽)并释放到血淋巴；另外酚氧化酶系统导致局部黑化和凝集，也起着一定的作用。

Deatoumieux等对凡纳对虾的抗菌肽进行了研究，从中分离得到了对虾抗菌肽(称为对虾素，Penaeidins)并克隆到其基因，同时还对其进行了性质、基因表达和定位以及重组表达等方面的研究(Destoumieux D，Bulet P，Loew D et al.Penaeidin，a new familyof antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei.J Biol Chem，1997，272：28398-28406)。我们也从中国对虾中克隆得到了对虾素基因，并对其进行了性质、基因表达和定位以及重组表达等方面进行了研究，获得到了有广谱抗菌活性的重组对虾素。

许多研究表明，对虾中含有多种可以对抗外界病原微生物的蛋白或肽类。包括对虾素(penaeidins)、壳质素(crustins)、抗脂多糖因子(ALF)和来自对虾血蓝蛋白C-端的阴离子抗菌肽。但是，在诸多的相关报道中，未见有中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因的报道，本发明从中国对虾中克隆得到一种含单一乳清酸性蛋白结构域(peptide containing single whey acidic protein(WAP)domain)的抗菌肽基因，虽然国外在凡纳对虾中也发现了类似基因，但至今没有所述中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因重组表达和功能研究的报道。

发明内容

针对目前研究现状的不足，本发明的目的是提供一种中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因及其核苷酸序列，并提供其克隆方法与载体。

本发明所述的中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征：

*长度：390碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：对虾(Fenneropenaeius chinensis)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

atggtgaaca tcaaggaagt tctgatcgtg tccgtgttgg tggccgcggt ggctgtttct   60

cccgccgatg ctgttccaac gagacacgct aggccccgtc ctcagcccag gccgaggcca  120

gggacgtgtc cggacacgag cgacatcgtc tccatctgcg tcgtgacgga acgcaactgc  180

ttctcggacg gcgagtgcgg agccggccag aagtgctgtc cgattggctg cgggagagag  240

tgcctggctg tgggatctcc ctacggaaaa tgaagatcgt aggaggggga cgaaatttcc  300

tcgatgggct cacagtctcc ctggaaatat tattgaagcg tgttgattca ttgataataa  360

aattgtgttg tttcaaaaaa aaaaaaaaaa                                   390

本发明的另一个目的是提供一种由中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因编码的抗菌肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：90氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Met Val Asn Ile Lys Glu Val Leu Ile Val Ser Val Leu Val Ala

                5                   10                  15

Ala Val Ala Val Ser Pro Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg His Ala

                20                  25                  30

Arg Pro Arg Pro Gln Pro Arg Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Asp

                35                  40                  45

Thr Ser Asp Ile Val Ser Ile Cys Val Val Thr Glu Arg Asn Cys

                50                  55                  60

Phe Ser Asp Gly Glu Cys Gly Ala Gly Gln Lys Cys Cys Pro Ile

                65                  70                  75

Gly Cys Gly Arg Glu Cys Leu Ala Val Gly Ser Pro Tyr Gly Lys

                80                  85                  90

其中，还包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。

本发明的中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA的克隆方法是：

采用一步法或RNAkit从对虾中提取总RNA，或者用mRNA kit分离提取mRNA；然后利用总RNA或mRNA反转录合成cDNA；

其中：根据对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因的保守序列设计的引物为：

正向引物：F1 5’GTG TTG GTG GCC GCG GTG GC 3’

反向引物：R1 5’CAC AGC CAG GCA CTC TCT CC 3’

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

纯化通过链式聚合酶反应(PCR)扩增获得DNA片段；

取上述纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)或pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板培养；

提取并纯化质粒，扩增质粒并测序；

再经过3’和5’末端快速扩增，将3’和5’端序列拼接，即得SEQ ID NO.1所示中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因全长核苷酸序列。

本发明的中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。

其中，上述应用的方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌、酵母和昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白(图1)。

例如：将获得的中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因克隆到pET-30a(Novagen公司)表达载体，转化大肠杆菌BL21 DE3细胞，进行诱导表达，纯化；并利用获得重组蛋白进行抑菌实验。

实验结果表明，重组的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽具有抗革蓝氏阴性菌和阳性菌的活性(图2)。

利用本发明的方法通过现有基因工程方法修饰中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因，还可用于其他研究和生产。

利用本发明获得的重组的中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。

附图说明

图1中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽的重组表达与纯化

其中：A不同菌株的诱导表达：1诱导前菌株I，2诱导前菌株II，3诱导后菌株I，4诱导后菌株II。

B重组抗菌肽的纯化：1诱导后细胞破碎后的上清液电泳结果，2细胞破碎后的沉淀，3纯化的对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽。

图2重组的中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽的抑菌实验

   其中：A为不同浓度的抗菌肽对大肠杆菌的抑菌效果；

         B为不同浓度的抗菌肽对藤黄微球菌的抑菌效果。

具体实施方式

实施例1：中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA的克隆

1)总RNA的提取：采用现有技术一步法提取总RNA。

2)cDNA第一链合成：6微克总RNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)₁₇)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶，42℃反应90分钟，70℃10分钟终止反应。

3)PCR反应：链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件：

首先将下列试剂混在一起：

      ·10xTaq DNA聚合酶缓冲液  5微升(μl)

      ·模板cDNA                1μl

      ·正向引物(1.25μg/μl)   1μl

      ·反向引物(1.25μg/μl)   1μl

      ·脱氧核苷酸混合物(dNTP)  4μl

      ·Taq DNA聚合酶           0.25μl

      ·灭菌水                  37.75μl

      ·总体积                  50μl

根据对虾对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽的保守序列设计的引物为：

      正向引物：F1 5’GTG TTG GTG GCC GCG GTG GC 3’

      反向引物：R1 5’CAC AGC CAG GCA CTC TCT CC 3’

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

4)反应产物纯化：利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步骤按产品说明书进行。

5)对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA克隆：取纯化产物3微升，连接于pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG 0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。

6)质粒纯化：收取过夜培养菌液2毫升，离心(10000转/分，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦格Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。

7)序列测定与同源检索：取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。

8)对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA 3’端快速扩增

根据得到的抗菌肽基因片段，再设计一条特异性正向引物F1 5’GTG TTG GTG GCCGCG GTG GC 3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。

取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用56℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。

9)对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA 5’端克隆

利用上述获得的总RNA，按CLONTECH公司(美国)SMART^TMPCR cDNA文库构建试剂盒说明书进行进行第一链cDNA合成。

以上述cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1 5’CAC AGC CAGGCA CTC TCT CC 3’为引物进行PCR扩增，获得对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA的5’序列。

将3’和5’端序列拼接，即获得SEQ ID NO.1所示中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽cDNA基因全长核苷酸序列。

实施例2：重组表达载体构建、表达与抑菌功能测定

(1)根据中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因的序列和表达载体pPET30a(Novagen公司)的克隆位点，设计引物：

Wap F：CGC GAT GAA TTC ATG GTG AAC ATC AAG GAA G(EcoR I)

Wap R：TAG ATC CTC GAG TTT TCC GTA GGG AGA TCC CAC(XhoI)

本发明选择了pET30 a克隆位点的EcoR I和Xho I酶切位点，因此，设计引物时在上游引物引入了EcoR I酶切位点，下游引物上引入了Xho I酶切位点。

(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选

以pMD-18T-Wap为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为：94℃，2min预变性；94℃，30s，55℃，45s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸10min。

2％的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测。

将PCR产物作制备电泳，用UNIQ-5Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工产品)回收、纯化PCR产物，经过EcoR I和Xho I内切酶酶切，切下两端带有Xho I和EcoR I内切酶位点的家蝇防御素成熟肽cDNA片段，同样表达载体pET30a经过EcoR I和XhoI内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的Xho I和EcoR I内切酶位点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，LB+Amp平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37℃振荡扩增培养并抽提质粒，EcoR I和XhoI双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pET30a-Wap。接转化E.coli表达菌株BL21 DE3感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37℃倒置过夜培养。

(3)筛选表达菌株

从上述LB+Amp平板上挑取8个单克隆菌落，2ml LB+Amp液体培养基37℃振荡过夜培养，次日，取20μl过夜培养液加入到2ml LB+Amp液体培养基中转培养，37℃振荡培养3h，至OD₆₀₀在0.5～0.7之间，然后加入IPTG至终浓度为1mmol，继续37℃振荡培养诱导表达4h。诱导前，随机从一个样品中取出0.5ml菌液，电泳检测时作未诱导对照。

表达完后，各取0.5ml菌液，5000r/min离心5min收集细胞，包括未诱导的样品，重悬于100μl去离子水中，以此为电泳样品作15％的SDS-PGAE。根据电泳结果，鉴定表达菌株。

(5)重组对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽表达与纯化

挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，按照体积比1∶100加入到100ml LB+Amp培养基中转培养，37℃振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为0.5mmol，再37℃振荡诱导培养4h。诱导前取出0.5ml的菌液，作为诱导前对照样品。诱导培养完后，菌液在合适的离心管中7000r/min离心10min收集细胞，细胞重悬于5ml预冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混匀后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声循环为：超声1s；间隔1s；全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000r/min离心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。

重组蛋白以包含体的形式存在，以常规方法经过包含体纯化、复性和亲和层析，即获得到了重组蛋白——重组对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽(见图1A，B)。

(6)重组蛋白抑菌活性测定

以管碟法检测抑菌活性，方法如下：

固体平板制备：固体平板的下层胶为一层0.5～1cm厚度的1.5％的琼脂，上层胶为0.5～1cm厚度的含有5μL对数生长期细菌的8mL固体低营养细菌培养基(1％tryptone，0.5％NaCl，1.5％Agar，pH7.5)。水平静置，冷却，备用。

在上述固体平板上设计放置多个经过灭菌的牛津小杯(如图2)，在平板的底面做好标记，分别取50μL待测样品，加入相对应的牛津小杯中，28℃正面静置培养过夜，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径。

实验结果：本发明所述的重组的中国对虾的含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽对对大肠杆菌或藤黄微球菌有明显的抑菌效果(见图2)。

                           序列表

SEQ ID NO.1

<110>山东大学

<120>中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因及其编码的抗菌肽与应用

<141>2005-9-6

<160>2

<210>1

<211>390

<212>cDNA

<213>对虾(Fenneropenaeius chinensis)

<221>中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因

<222>(1)…(390)

<400>1

atggtgaaca tcaaggaagt tctgatcgtg tccgtgttgg tggccgcggt ggctgtttct    60

cccgccgatg ctgttccaac gagacacgct aggccccgtc ctcagcccag gccgaggcca   120

gggacgtgtc cggacacgag cgacatcgtc tccatctgcg tcgtgacgga acgcaactgc   180

ttctcggacg gcgagtgcgg agccggccag aagtgctgtc cgattggctg cgggagagag   240

tgcctggctg tgggatctcc ctacggaaaa tgaagatcgt aggaggggga cgaaatttcc   300

tcgatgggct cacagtctcc ctggaaatat tattgaagcg tgttgattca ttgataataa   360

aattgtgttg tttcaaaaaa aaaaaaaaaa                                    390

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>90

<212>PRT

<221>中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因编码的抗菌肽

<222>(1)…(90)

<400>2

Met Val Asn Ile Lys Glu Val Leu Ile Val Ser Val Leu Val Ala

                 5                  10                  15

Ala Val Ala Val Ser Pro Ala Asp Ala Val Pro Thr Arg His Ala

                20                  25                  30

Arg Pro Arg Pro Gln Pro Arg Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Asp

                35                  40                  45

Thr Ser Asp Ile Val Ser Ile Cys Val Val Thr Glu Arg Asn Cys

                50                  55                  60

Phe Ser Asp Gly Glu Cys Gly Ala Gly Gln Lys Cys Cys Pro Ile

                65                  70                  75

Gly Cys Gly Arg Glu Cys Leu Ala Val Gly Ser Pro Tyr Gly Lys

                80                  85                  90