利用促生拮抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法

摘要

本发明涉及一种利用促生拮抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法，在优化的培养基和培养条件下，利用促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G和M18R，分别生产出高含量吩嗪－1－羧酸和藤黄绿菌素的发酵液，再分别将M18G发酵液和M18R发酵液制备成干粉，并以M18G干粉中的吩嗪－1－羧酸和M18R干粉中的藤黄绿菌素的重量百分比为90％～10％和10％～90％进行物理复配，制备成高效防治植物病害的微生物源杀菌剂。与现有技术相比，本发明提供的杀菌剂是以微生物代谢产物为活性成分的可湿性粉剂而非活菌制剂，因而具有高稳定性，其药效不易受环境条件的影响，同时在低剂量使用的前提下，对植物的多种病害具有更高的防治效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物源杀菌剂的制备方法，尤其涉及一种利用促生拮抗菌M18衍生菌株的代谢产物制备防治植物病害的杀菌剂的方法。属于微生物源农药技术领域。

背景技术

植物病害引起的农作物减产幅度约占总产量的25～75％，造成巨大经济损失。以我国的主要粮食作物水稻为例，每年种植面积约4亿亩，按亩产量400公斤，水稻病害引起减产10％计，每年造成经济损失达300亿元人民币之巨。目前，生产上控制植物病害除了选用良种和改进栽培措施外，主要依靠喷洒化学杀菌剂。但是，大多化学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用，残留在植物可食部分的有害成份对人体健康造成的潜在威胁，已经引起政府和社会各阶层的关注；不仅如此，化学农药一般不易分解，会长期地累积在生态系统中，造成对环境的污染，不利于社会和经济的可持续发展；而且，现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。因此，需要发展新一代高效低毒、对环境相容性好的化学农药，同时还需要大力研究和发展生物源农药。

1992年，世界环境与发展大会曾经提出，在新世纪之前，生物源农药的使用量要达到农药使用总量60％的目标，然而，时至今日，作为发达国家的美国还只占15％左右，而我国约占5％。目前，与化学农药相比，在生产上已经推广使用的生物源农药，品种和数量都较少，有些品种由于使用年久，已经引起植物病原菌产生不同程度的抗药性，防治效果不够理想。以水稻纹枯病为例，该病害与稻瘟病、白叶枯病并列为水稻生产中的三大主要病害，防治该病害的药剂主要依赖于生物源农药井岗霉素，但是，经过30多年来长期地单一使用，部分水稻纹枯病菌的融合群已产生抗药性；而且，井岗霉素仅对水稻纹枯病菌有效，对其他病原菌没有明显的防治效果，使用范围有很大局限性。

生物农药促生拮抗菌M18，对植物病害的杀菌作用具有高效、安全、广谱、与环境相容性好等特征，已经获得国家发明专利，专利号为00119857.2。该促生拮抗菌M18已于2000年6月27日在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0462。但是，生物农药促生拮抗菌M18是一种活菌菌剂，其合成抗植物病害的活性成分含量容易受到环境条件的影响，因而会影响抗植物病害的能力和防治效果的稳定性。

已经查明，促生拮抗菌M18防治植物病害的主要机理是分泌两种抗菌物质，分别是吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素。近年来，本发明申请人运用分子生物学的技术，对促生拮抗菌M18合成这两种抗菌物质的调控机制，开展了深入地研究。运用基因工程手段，对促生拮抗菌M18基因组中的双元调控基因gacA开展了定向突变，获得了M18衍生菌株M18G，能提高吩嗪-1-羧酸的产量，该研究成果的技术方法已经公开于2004年《微生物学学报》44卷第761～765页，论文题目为《假单胞菌gacA插入突变对吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素合成代谢的差异性调控》。同时，对促生拮抗菌M18基因组中的另一个调控基因rsmA开展定向突变，获得了M18衍生菌株M18R，能提高藤黄绿菌素的产量，该研究成果的技术方法也已经公开于2004年《微生物学学报》44卷第189-193页，论文题目为《荧光假单胞菌rsmA突变株的构建及其对藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸合成的区别性调控作用》。如何进一步利用以上所述两种M18衍生菌株的特性制备高效的微生物杀菌剂是一项新的研究课题，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种利用促生拮抗菌M18衍生菌株制备杀菌剂的方法，利用微生物的代谢产物而非微生物活体制备杀菌剂，能更加稳定、有效的控制植物病害。

本发明可以通过以下技术方案来实现：在优化的培养基和培养条件下，利用促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G和M18R，分别生产出高含量吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素的发酵液，再分别将M18G发酵液和M18R发酵液制备成干粉，并以M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黄绿菌素含量的重量百分比为90％～10％和10％～90％进行物理复配，制备成高效防治植物病害的微生物源杀菌剂。

本发明的方法具体包括以下步骤：

1、将M18G菌株接种在甘油培养基的平板上，在26～30℃下活化生长20～24小时，然后将活化的M18G菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在26～30℃的摇床中振荡培养10～14小时，摇床转速为210～230转/分；然后继续转接2～3次，在甘油培养液中进行多级放大发酵培养；最后转接到葡萄糖培养液中进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为70～74小时，得到吩嗪-1-羧酸含量为1500～1700毫克/升的M18G菌株发酵液。其中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％，pH 6.8～7.2；所述葡萄糖培养液的组分重量百分比为：黄豆粉4.5～5.5％、葡萄糖3.8～4.2％、豆油0.3～0.5％、尿素0.1～0.3％、其余为水，pH 6.8～7.2。

2、将M18R菌株接种在甘油培养基的平板上，在26～30℃下活化生长18至24小时；然后将活化的M18R菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在26～30℃的摇床中振荡培养10～14小时，摇床转速为230～250转/分；然后继续转接3～4次，在甘油培养液中进行多级放大发酵培养，最后一级的发酵时间为68～72小时，温度和转速不变，得到藤黄绿菌素含量为750～850毫克/升的M18R菌株发酵液。其中，所述的甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比与步骤1中所述相同。

3、分别将M18G菌株发酵液和M18R菌株发酵液，按常规技术，干燥成粉，制备成M18G干粉和M18R干粉。

4、将M18G干粉和M18R干粉混合，制成可湿性粉剂，即为本发明的杀菌剂，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黄绿菌素重量百分比分别为90％～10％和10％～90％。

利用本发明制备的微生物源杀菌剂对植物进行喷雾或灌根施用，使用浓度为15毫克/升，亩用量0.3克，可以有效防治水稻纹枯病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、棉花枯萎病、炭疽病、立枯病和各种腐霉和疫霉等引起的多种植物病害。

在上海郊区、江西、浙江、江苏等地开展的对水稻纹枯病的防治示范推广试验，取得了80％以上的防治效果，推广应用面积达到7万亩。

本发明制备的杀菌剂保持了促生拮抗菌M18原有的安全、广谱及与环境相容性好等特征外，还具有以下优点：

1、杀菌剂中的活性成分吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素的含量较为稳定。与促生拮抗菌M18相比，杀菌剂的上述两种活性成分是在可控条件下产生的，而促生拮抗菌M18的活性成分是由该活菌在田间使用时的环境条件下产生，其活性成分含量容易受环境条件的影响。

2、杀菌剂中的活性成分吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素的含量大幅度提高。促生拮抗菌M18菌株合成这两种抗菌物质的效价都比较低，在通常条件下，每升发酵液中，吩嗪-1-羧酸的效价为100至150毫克，藤黄绿菌素的效价仅为20至40毫克左右。利用本发明方法，在优化的培养基和发酵条件下，通过衍生菌株M18G合成吩嗪-1-羧酸，每升发酵液中的含量可达到1500毫克以上，与原技术相比，发酵效价提高了约10倍；同时，在适宜的培养基和优化的发酵条件下，通过衍生菌株M18R合成藤黄绿菌素，每升发酵液中含量可达到750毫克以上，与原技术相比，发酵效价提高了约20倍。

3、杀菌剂的抗菌效果成倍地提高。将M18G干粉和M18R干粉进行复配，能够产生加成作用，因而，对包括水稻纹枯病在内的植物病害的抑制作用，比同剂量单剂的药效提高5至10倍。以防治水稻纹枯病为例，单用吩嗪-1-羧酸对水稻纹枯病菌的抑制作用，达到50％效果时的浓度，即EC50，为8.4毫克/升，单用藤黄绿菌素对水稻纹枯病菌的EC50为53.4毫克/升，将M18G干粉和M18R干粉进行复配，使吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素的重量百分比为90％∶10％时，对水稻纹枯病菌的EC50下降为0.74毫克/升，分别比单用吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素抑制效果提高了10倍和70倍以上。

4、杀菌剂的剂型优越，能延长保存期。本发明制成的杀菌剂，为可湿性粉剂。其特征在于，其活性成分是在可控条件下产生的微生物代谢产物，而不是活菌，制备成粉剂后，有效成分的含量比较稳定，能长期保存。相比之下，促生拮抗菌M18活菌制剂，其发酵液中的活菌数会随着保存期的延长而减少，保存期较短。

5、杀菌剂的使用方便。由于本发明方法得到的杀菌剂，是稳定的可湿性粉剂，而非液体活菌制剂，因而在包装、储存、运输和使用方面简便易行。

6、杀菌剂的生产成本和使用成本低。与相关活菌制剂相比，同剂量的生产成本和使用成本降低50％以上。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案及技术效果作进一步描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

实施例1：

将促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G接种在甘油培养基的平板上，在26℃下活化生长24小时，然后将活化的M18G菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中，在26℃的摇床中振荡培养14小时，摇床转速为210转/分。然后继续转接，在甘油培养液中进行3级放大发酵培养。最后，转接到葡萄糖培养液中进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为74小时，得到M18G菌株发酵液。其中，所述的甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8％、甘油1.3％、硫酸镁0.07％、磷酸二氢钾0.03％、pH 7.0；所述的葡萄糖培养液的组分重量百分比为：黄豆粉5.0％、葡萄糖3.8％、豆油0.4％、尿素0.2％、余量为水，pH 7.0。测定74小时M18G菌株发酵液中的吩嗪-1-羧酸含量为1500毫克/升。按常规干燥技术，将发酵液制备成M18G干粉。

将促生拮抗菌M18的衍生菌株M18R接种在甘油培养基的平板上，在26℃下活化生长24小时；然后将活化的M18R菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在26℃的摇床中振荡培养14小时，摇床转速为230转/分。然后继续转接，在甘油培养液中进行3级放大发酵培养，第三级的发酵培养时间延长为72小时，温度和转速不变，得到M18R菌株发酵液；其中，所述的甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8％、甘油1.3％、硫酸镁0.07％、磷酸二氢钾0.03％、pH7.0。测定72小时M18R菌株发酵液中的藤黄绿菌素含量为800毫克/升。按常规干燥技术，将发酵液制备成M18R干粉。

将M18G干粉和M18R干粉混合，制成可湿性粉剂的杀菌剂，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黄绿菌素重量百分比分别为90％和10％。

在此配比下制备的杀菌剂，对水稻纹枯病，具有最大的增效作用，比同剂量单剂的药效提高10倍以上。

实施例2：

将促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G菌株接种在甘油培养基的平板上，在28℃下活化生长22小时，然后将活化的M18G菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在28℃的摇床中振荡培养12小时，摇床转速为220转/分。然后继续转接，在甘油培养液中进行3级放大发酵培养，最后转接到葡萄糖培养液中进行放大发酵培养，发酵温度和转速不变，发酵时间延长为72小时，得到M18G菌株发酵液。其中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.0％、甘油1.7％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.05％、pH7.2；所述葡萄糖培养液的组分重量百分比为：黄豆粉5.5％、葡萄糖4.0％、豆油0.5％、尿素0.3％、余量为水，pH 7.2。测定72小时M18G菌株发酵液中的吩嗪-1-羧酸含量为1700毫克/升。按常规干燥技术，将发酵液制备成M18G干粉。

将促生拮抗菌M18的衍生菌株M18R接种在含有甘油培养基的平板上，在28℃下活化生长22小时，然后将活化的M18R菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在28℃的摇床中振荡培养12小时，摇床转速为240转/分；然后继续转接，在甘油培养液中进行3级放大发酵培养，第三级的发酵时间为70小时，温度和转速不变，得到M18R菌株发酵液。其中，所述的甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.0％、甘油1.7％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.05％、pH 6.8。

测定70小时M18R菌株发酵液中的藤黄绿菌素含量为850毫克/升。按常规技术干燥发酵液，制备成M18R干粉。

将M18G干粉和M18R干粉混合，制成可湿性粉剂的杀菌剂，其中，M18G干粉中所含的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中所含的藤黄绿菌素的重量百分比分别为16％和84％。

在此配比下制备的杀菌剂，对瓜果疫霉具有最大的增效作用，比同剂量单剂的药效提高5倍以上。

实施例3：

将促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G菌株接种在甘油培养基的平板上，在30℃下活化生长20小时，然后将活化的M18G菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在28℃的摇床中振荡培养12小时，摇床转速为220转/分；然后继续转接，在甘油培养液中进行3级放大发酵培养。最后，转接到葡萄糖培养液中进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为70小时，得到M18G菌株发酵液。其中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.2％、甘油1.7％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.01％，pH 6.8；所述葡萄糖培养液的组分重量百分比为：黄豆粉4.5％、葡萄糖4.2％、豆油0.3％、尿素0.1％、pH 6.8。测定70小时M18G菌株发酵液中的吩嗪-1-羧酸含量达1600毫克/升。按常规技术干燥，将发酵液制备成M18G干粉。

将促生拮抗菌M18的衍生菌株M18R菌株接种在甘油培养基的平板上，在32℃下活化生长18小时，然后将活化的M18R菌株转接到含有甘油培养液的三角瓶中放大，在32℃的摇床中振荡培养12小时，摇床转速为2250转/分。然后继续转接，在甘油培养液中进行3级放大发酵培养，第三级的发酵时间为68小时，温度和转速不变，得到M18R菌株发酵液。其中，所述的甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨2.2％、甘油17％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.01％，pH6.8。

测定68小时M18R菌株发酵液中的藤黄绿菌素含量为750毫克/升。按常规技术干燥，将发酵液制备成M18R干粉。

将M18G干粉和M18R干粉混合，制成可湿性粉剂杀菌剂，其中，M18G干粉中的吩嗪-1-羧酸和M18R干粉中的藤黄绿菌素的重量百分比均为50％。

在此配比下制备的杀菌剂，对各种枯萎病，具有最大的增效作用，比同剂量单剂的药效提高8倍以上。