法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-05-11
授权
授权
2006-08-30
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-07-05
公开
公开
技术领域
本发明大体而言涉及用于预防以及治疗由环氧合酶(COX)以及脂氧合酶(LOX)介导的疾病及病症的方法。具体而言，本发明涉及包含两类特殊的化合物——无取代B环类黄酮以及黄烷的混合物的新型组合物，其用于预防及治疗由COX及LOX途径介导的皮肤疾病及病症。本发明包括用于预防及治疗COX及LOX介导的疾病及病症的方法，该疾病及病症包括但不限于阳光灼伤、热灼伤、粉刺、局部创口、由真菌、微生物及病毒感染所引起的不严重的炎症(minor inflammatory conditions)、白癜风(vitilago)、全身性红斑狼疮、牛皮癣、癌、黑素瘤、以及其它哺乳动物皮肤癌、由暴露于紫外(UV)照射、化学品、热、风及干燥环境引起的皮肤损伤、皱纹、皮肤松弛、眼周边皱纹及黑眼圈、皮炎及其他过敏相关的皮肤症状。此处所述组合物的应用还具有提供弹性更佳、衰老减低及延缓、年轻的外观及肌理得以改善以及柔韧性、紧实度、光滑度及柔度得以改善的皮肤光滑及年轻的皮肤的益处。
背景技术
日光对皮肤具有显著的作用，导致过早衰老、皮肤癌以及许多其他皮肤变化如红斑和晒黑。大多数由日光所引起的损伤归因于波长从200nm到400nm的紫外(UV)照射。紫外照射根据波长被分成三类，UVA、UVB或WC。波长范围为320-400nm的UVA可导致晒黑与轻度的阳光灼伤。波长范围为290-320nm的UVB可导致阳光灼伤及促进色素沉着。波长范围为100-290nm的UVC可造成损伤而不是晒黑。将皮肤暴露于紫外照射诱导二相反应。因此，在开始暴露时就立即发生的红斑反应是一种在30分钟内消退的弱反应。在2-5小时的暴露之后发生延缓的红斑反应并在约10-24小时时达峰。前列腺素及白三烯的产生增强是UV、日光及化学品/热导致红斑的主要作用机制。(Wang(2002)Adv.Dermatol.18：247)。
自细胞膜释放及代谢的花生四烯酸(AA)经若干不同的途径导致前致炎代谢物产生。可以证明，两种最重要的炎症途径受脂氧合酶(LOX)及环氧合酶(COX)介导。这些是分别导致白三烯及前列腺素产生的平行途径，在炎性反应的起始及发展中起重要作用。这些作用于血管的化合物是化学吸引素，其既促进炎性细胞渗入组织又延长炎性反应。因此，导致这些炎症介质生成的酶成为本发明研发旨在双重抑制由两种途径引起的炎症的局部给药治疗药物的对象，这两种途径促进如阳光灼伤、热灼伤、烫伤、粉刺、局部创口、红斑狼疮、牛皮癣、癌、黑素瘤及其他哺乳动物皮肤癌的疾病及病症的生理和病理过程。
抑制COX酶是大多数非甾族抗炎药(NSAIDS)的作用机制。COX酶有两种不同的同工型(COX-1和COX-2)，它们享有约60％的序列同一性但是在表达谱和功能上有差异。COX-1是已与生理学重要的前列腺素产生相关的酶的构成形式，其帮助调节正常的生理机能如血小板凝集、保护胃的细胞功能及维持正常的肾功能(Dannhardt和Kiefer(2001)Eur.J.Med.Chem.36：109-26)。第二种同工型COX-2是一种可经前致炎细胞因子如白细胞间介素-1β(IL-1β)及其他生长因子诱导的酶的形式(Herschmann(1994)Cancer Metastasis Rev.134：241-56；Xie等(1992)Drμgs Dev.Res.25：249-65)。该同工型催化自花生四烯酸(AA)生成前列腺素E2(PGE2)。抑制COX是传统NSAID具有抗炎活性的原因。
对COX和LOX显示双重特异性的抑制剂可能具有抑制花生四烯酸代谢多重途径的显著益处。上述抑制剂可能阻断前列腺素(PG)的炎性作用，以及通过限制多种白三烯(LT)产生而阻断它们的炎性作用。这包括亦称作anaphalaxis慢反应物质的PGE2、LTB4、LTD4和LTE4的血管舒张、血管通透性和趋化性作用。在它们之中，LTB4具有最有效的趋化性和化学增活作用(Moore(1985)in Prostanoids：pharmacological，physiological and clinical relevance，Cambridge University Press，N.Y，pp.229-230)。
因为COX抑制剂的作用机制与大多数传统NSAID的部分相同，所以COX抑制剂被用于治疗许多相同的症状，包括与其中炎症起决定作用的暂时性病症(Transient conditions)及慢性疾病中炎症相关的疼痛和肿胀。暂时性病症包括治疗与不严重的擦伤或接触性皮炎相关的炎症，以及直接与前列腺素及白三烯途径有关的皮肤病症如皮肤色素过度沉着、老年斑、白癜风、全身性红斑狼疮、牛皮癣、癌、黑素瘤、及其他哺乳动物皮肤癌。COX抑制剂的应用已经扩展至包括如全身性红斑狼疮(SLE)的疾病(Goebel等(1999)Chem.Res.Toxicol.12：488-500；Patrono等(1985)J.Clin.Invest.76：1011-1018)以及风湿性皮肤病症如硬皮病。COX抑制剂还用于缓解不是由风湿病引起的炎性皮肤病症如牛皮癣，其中减少由前列腺素过量产生引起的炎症可提供直接的益处(Fogh等(1993)Acta Derm Venerologica 73：191-193)。最近已有报导5-脂氧合酶在全身性硬化症患者的皮肤中过度表达。这暗示LOX途径可能对全身性硬化症的发病机理具有意义并且可能代表有效的治疗对象(Kowal-Bielecka(2001)Arthritis Rheum.44(8)：1865)。最终，在变应原注射位点的两种COX-2及5-LOX酶活性的增加暗示存在使用双重COX/LOX抑制剂治疗早期及晚期皮肤变态反应症状的潜在可能(Church(2002)Clin.Exp.Allergy.32(7)：1013)。
已经证明，局部施用选择性环氧合酶抑制剂可抑制UVB介导的急性及长期暴露后的皮肤炎症。另外，局部施用COX抑制剂减少了肿胀、皮肤的嗜中性粒细胞浸润及活化、PGE2水平以及阳光灼伤细胞的形成(Wilgus(2000)Prostaglandins Other Lipid Mediat.62(4)：367))。已经证明，当全身(Wilgus等，(2002)Adv.Exp.Med.Biol.507：85)及局部(Wilgus等，(2000)Protaglandins Other Lipid Mediat.62：367)给药时，COX抑制剂CelebrexTM减少UV诱导的炎症的作用。在动物模型中，已知的COX抑制剂阿斯匹林和各种脂氧合酶抑制剂显示出针对由UV照射引起的炎症及血管减压的血管保护活性(Kuhn(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：S320)。急性或长期慢性的UV暴露导致特征为胶原蛋白降解以及异常弹性蛋白在真皮表层累积的皮肤损伤和光老化。双重COX/LOX抑制剂可用于通过显著地降低血管舒张、血管通透性、趋化性以及化学吸引素-前列腺素(PG)从而预防及治疗由炎性浸润引起的胶原蛋白降解以及许多白三烯(LT)的降解(Bosset(2003)Br.J.Dermatol.149(4)：826；Hase(2000)Br.J.Dermatol.142(2)：267)。此外，在口腔皮肤中化学诱导的氧化应激可通过分别给药COX及LOX抑制剂以降低白血球粘着、浸润及H2O2产生而被抑制(Nakamura(2003)Free Radical Biol.Med.35(9)：997)。
COX抑制剂除了可用作为抗炎药外，它们的另一个潜在的作用是治疗癌症。人类各种恶性肿瘤中已显示COX过度表达，并且已证明COX抑制剂在治疗患有皮肤瘤的动物中有效。虽然仍未完全了解作用机制，但是已经证明COX的过度表达抑制细胞凋亡以及增强致瘤细胞类的攻击性(Dempke等，(2001)J.Can.Res.Clin.Oncol.127：411-17；Moore和Simmons(2000)Current Med.Chem.7：1131-1144)。上调的COX生成暗示皮肤出现光化性角化病和鳞状细胞癌。还在由DNA损伤所致的病变中发现COX的量增加(Buckman等，(1998)Carcinogenesis 19：723)。因此，控制COX的表达或蛋白功能似乎可能引起炎性反应及最终发展成癌症机率的降低。实际上，已发现COX抑制剂如吲哚美辛和CelebreTM可有效治疗UV诱导的红斑及肿瘤生成(Fischer(1999)Mol.Carcinog.25：231；Pentland(1999)Carcinogenesis 20：1939)。最近，脂氧合酶的过度表达还被证明涉及表皮瘤(Muller(2002)Cancer Res.62(16)：4610)和黑素瘤癌发生(Winer(2002)Melanoma Res.12(5)：429)的形成。自脂氧合酶途径产生的花生四烯酸(AA)代谢物在肿瘤生长相关的信号转导中起重要作用，这暗示抑制脂氧合酶途径将是预防癌症发展的有效对象(Cuendet(2000)Drug Metabol Drμg Interact 17(4)：109；Steele(2003)Mutat Res.523-524：137)。因此，应用具有双重COX/LOX抑制活性的药物提供对化学预防癌症的显著益处。
前列腺素和白三烯也在创口、灼伤、烫伤、粉刺、微生物感染、皮炎以及许多其他皮肤疾病和病症的生理和病理过程中起重要作用。伴随环氧合酶及脂氧合酶活性显著升高的前致炎级联在热或化学品灼伤后激活已被充分证明，并在继发的严重症状以及可引起许多器官衰竭的免疫功能障碍中起重要作用(Schwacha(2003)Burns 29(1)：1；He(2001)J.Burn Care Rehabil.22(1)：58)。
粉刺是伴随皮脂产生紊乱、毛囊上皮细胞脱落、细菌增殖和炎症的毛囊皮脂单位(pilosebaceous unit)疾病。粉刺的炎性性质可通过偏振光摄影检测并可用于临床诊断，包括对粉刺程度的鉴定以及还可测定治疗的效力(Phillips(1997)J.Am.Acad.Dermatol.37(6)：948)。目前用于预防及治疗粉刺的治疗药物包括抗炎药如类维生素A、抗微生物药及激素药(Leyden(2003)J.Am.Acad.Dermatol.49(3 Suppl：S200)。抗炎药如类维生素A(Millikan(2003)J.Am.Acad.Dermatol.4(2)：75)和COX抑制剂水杨酸(Lee(2003)Dermatol Surg 29(12)：1196)的局部应用已经在临床上证明为治疗粉刺的有效及安全的疗法。此外，已经充分证明非甾族抗炎药(NSAID)可作为用于常见和罕见皮肤病的治疗药物，所述常见和罕见皮肤病包括粉刺、牛皮癣、阳光灼伤、结节性红斑、冷沉球蛋白血症、史维特综合症(Sweet′s syndrome)、系统性肥大细胞增生症(systemic mastocytosis)、荨麻疹、青斑样的和结节性脉管炎(Friedman(2002)J.Cutan Med.Surg.6(5)：449)。
类黄酮或生物类黄酮为广泛分布的天然产物，据报道其具有抗菌、抗炎、抗过敏、抗诱变剂、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓形成(anti-thrombic)及血管舒张活性。这组化合物共有的结构单元包括两个位于3-碳环两侧的苯环，如下结构通式所示：
连接至该总三环结构的羟基、糖、氧及甲基的各种组合产生多种类型的黄酮，其包括黄烷醇、黄酮、黄烷-3-醇(儿茶素)、花色素苷(anthocyanins)和异黄酮。
无取代B环黄酮及黄酮醇是一类特殊的类黄酮，其芳香B环上无取代基(下文称作为无取代B环类黄酮)，由如下通式所示：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，碳、氧、氮或硫，单个或者多个糖结合的糖苷，该糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X选自药物学可接受的抗衡阴离子组中，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、氟离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、碳酸根等。
无取代B环类黄酮相对稀少。在9,396种合成或自天然来源分离的类黄酮中，已知仅有231种无取代B环类黄酮(The Combined ChemicalDictionary，Chapman & Hall/CRC，Version 5：1 June 2001)。据报道无取代B环类黄酮具有种种生物活性。举例而言，高良姜精(3，5，7-三羟基黄酮)可用作抗氧化剂及自由基清除剂，并且据信是一种有前景的抗遗传毒性和癌症化学预防剂的候选物(Heo等(2001)Mutat.Res.488(2)：135-150)。其为酪氨酸酶单酚酶抑制剂(Kubo等(2000)Bioorg.Med.Chem.8(7)：1749-1755)、兔心脏羰基还原酶抑制剂(Imamura等(2000)J.Biochem.127(4)：653-658)，具有抗菌活性(Afolayan和Meyer(1997)Ethnopharmacol.57(3)：177-181)和抗病毒活性(Meyer等(1997)J.Ethnopharmacol.56(2)：165-169)。贝加因及另外两种无取代B环类黄酮对人乳腺癌细胞具有抗增殖活性(So等(1997)Cancer Lett.112(2)：127-133)。
通常，基于类黄酮的有效性随机测试其生物活性。偶尔地，特定生物活性强调需要B环上的取代，如与p-糖蛋白高亲和力结合(Boumendjel等(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11(1)：75-77)、强心作用(Itoigawa等(1999)J.Ethnopharmacol.65(3)：267-272)、抗亚油酸过氧化氢诱导的毒性的对内皮细胞的保护作用(Kaneko和Baba(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.63(2)：323-328)、COX-1抑制活性(Wang(2000)Phytomedicine7：15-19)以及前列腺素内过氧化物合酶(Kalkbrenner等(1992)Pharmacology 44(1)：1-12)需要B环上被取代。仅有为数不多的出版物提到无取代B环类黄酮中未取代的B环的重要性。一个实例为抑制NADPH醌受体氧化还原酶的2-苯基黄酮作为潜在的抗凝血剂的应用(Chen等(2001)Biochem Pharmacol.61(11)：1417-1427)。
各种无取代B环类黄酮抗炎活性的作用机制存在争议。无取代B环类黄酮柯因(Liang等(2001)FEBS Lett.496：12-18)、沃贡宁(Chi等(2001)Biochem.Pharmacol.61：1195-1203)以及halangin(Raso等(2001)Life Sci.68(8)：921-931)的抗炎活性通过过氧化物酶体增生物活化受体γ(PPARγ)的活化以及对脱粒和AA释放的影响从而与诱导型(inducible)环氧合酶和一氧化氮合酶的抑制有关(Tordera等(1994)Z.Naturforsch[C]49：235-240)。据报道，木蝴蝶素、贝加因和沃贡宁抑制12-脂氧合酶活性而不影响环氧合酶(You等(1999)Arch.Pharm.Res.22(1)：18-24)。新近据报道，沃贡宁、贝加灵和贝加因的抗炎活性通过抑制由一氧化氮抑制剂和脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和cox-2基因表达而产生(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)：1417-1427)。还有报道显示木蝴蝶素通过抑制NFκB的活化起作用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)：1417-1427)。最后，有报道显示沃贡宁抑制巨噬细胞中诱导型PGE2的生成(Wakabayashi和Yasui(2000)Eur.J.Pharmacol.406(3)：477-481)。
据报道，黄芩根抗炎活性的机制是贝加因对丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化以及对Ca2+离子载体A23187诱导的PGE2的释放的抑制(Nakahata等(1999)Nippon Yakurigaku Zasshi 114，Supp.11：215P-219P；Nakahata等(1998)Am.J.Chin.Med.26：311-323)。据报道显示源自黄芩的贝加灵抑制超抗原葡萄球菌外毒素刺激的T细胞增生和IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及干扰素-γ(IFN-γ)的生成(Krakauer等(2001)FEBS Lett.500：52-55)。因此，贝加灵的抗炎活性与由超抗原活化的前致炎细胞因子调节的信号通路的抑制有关。然而，还有人提出贝加灵的抗炎活性是由于与各种趋化因子的限制它们的生物活性的结合(Li等(2000)Immuno-pharmacology 49：295-306)。近来，有报道表明贝加灵作用于由凝血酶和凝血酶受体激动肽诱导的粘附分子表达(Kimura等(2001)Planta Med.67：331-334)，以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联(Nakahata等(1999)Nippon Yakurigaku Zasshi 114，Supp 11：215P-219P；Nakahata等(1998)Am.J.Chin Med.26：311-323)。
中国药用植物黄芩含有大量的无取代B环类黄酮，包括贝加因、贝加灵、沃贡宁和baicalenoside。传统上，该植物用于治疗许多病症，包括清热、泻火、湿温和暑热病；高烧引起的烦渴；痈、溃疡和其他化脓的皮肤感染；上呼吸道感染如急性扁桃体炎、咽喉炎和猩红热；病毒性肝炎；肾炎；盆腔炎(pelvitis)；痢疾；呕血和鼻出血。该植物传统上还用于预防流产(见Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中国，1998)。临床上，黄芩现用于治疗病症如小儿肺炎、小儿细菌性腹泻、病毒性肝炎、急性胆囊炎、高血压、由伤口和外科手术引起的局部急性发炎、支气管哮喘和上呼吸道感染(Encyclopedia ofChinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中国，1998)。黄芩的根治疗支气管哮喘的药理学效能据报道与无取代B环类黄酮的存在以及其抑制作用有关，它们可以抑制嗜酸性细胞的与嗜酸性细胞趋化因子相关的补充(Nakajima等(2001)Planta Med.67(2)：132-135)。
迄今为止，许多天然存在的无取代B环类黄酮得以商品化用于各种用途。例如，黄芩提取物的脂质体剂型用于护肤(美国专利No.5,643,598；5,443,983)。由于对致癌基因具有抑制作用，贝加灵被用于预防癌症(美国专利No.6,290,995)。贝加灵和其他化合物被用作抗病毒、抗菌和免疫调节剂(美国专利No.6,083,921和WO98/42363)并作为天然的抗氧化剂(WO98/49256和波兰专利公开9,849,256)。黄芩根提取物已被配制为辅助的防晒剂(supplemental sun screen agent)，其对局部用组合物中的各单一组分的累积SPF具有加成作用(WO 98/19651)。柯因由于其降低焦虑性质得以应用(美国专利No.5,756,538)。抗炎类黄酮用于控制和治疗肛门直肠和结肠疾病(美国专利No.5,858,371)以及抑制脂氧合酶(美国专利No.6,217,875)。这些化合物还与葡糖胺胶原以及其他成分一起配制用于修复和维护结缔组织(美国专利No.6,333,304)。类黄酮酯可构成美容组合物的活性成分(美国专利No.6,235,294)。于2002年3月1日提交的序列号为10/091,362名为“Identification of Free-B-ring Flavonoidsas Potent COX-2 Inhibitors”(无取代B环类黄酮作为有效的COX-2抑制剂的鉴定)以及于2003年7月22日提交的序列号为10/427,746名为“Formulation of a mixture of Free-B-Ring Flavonoids and Flavans as aTherapeutic Agent”的美国申请公开了通过向需要的主体给药含有无取代B环类黄酮的组合物或含有无取代B环类黄酮混合物的组合物来抑制环氧合酶COX-2的方法。这是首篇将无取代B环类黄酮与COX-2的抑制活性相联系的报导。该申请于此全文并入作为参考。
日本专利No.63027435描述了贝加因的提取及富集，以及日本专利61050921描述了贝加灵的纯化。
黄烷包括以下述结构通式所表示的化合物：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它们的化学衍生物；碳、氧、氮或硫，单个或者多个糖结合的糖苷，该糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；二聚、三聚以及其他多聚黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X选自药物学可接受的抗衡阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
儿茶素是一种黄烷，主要发现于绿茶，其具有下列结构：
儿茶素
儿茶素既单独又与其他在茶中发现的类黄酮一同起作用，并且其既具有抗病毒又具有抗氧化活性。据证实，儿茶素对病毒性肝炎的治疗有效。其还显示可预防对心脏、肾、肺、脾的氧化损伤，并可抑制胃癌细胞的生长。
儿茶素与其异构体表儿茶素抑制前列腺素内过氧化物合酶，IC50值为40μM(Kalkbrenner等(1992)Pharmacol.44：1-12)。从4种植物种类Atuna racemosa、Syzygium carynocarpum、Syzygium malaccense和Vantanea peruviana中分离出来的五种黄烷-3-醇衍生物包括(+)-儿茶素和没食子儿茶精相对于COX-1对COX-2显示出同等或较弱的抑制作用，其IC50值从3.3μM到138μM不等(Noreen等(1998)Planta Med.64：520-524)。从Ceiba pentandra皮中分离出的(+)-儿茶素抑制COX-1的IC50值为80μM(Noreen等(1998)J.Nat.Prod.61：8-12)。可从商业途径得到的纯(+)-儿茶素抑制COX-1的IC50值视试验条件而定，约为183到279μM，对COX-2不具有选择性(Noreen等(1998)J.Nat.Prod.61：1-7)。
绿茶儿茶素当补充加入至Sprague dawley雄性大鼠的膳食中时，降低了血小板PLA2的活性水平并显著减少了血小板环氧合酶水平(Yang等(1999)J.Nutr.Sci.Vitaminol.45：337-346)。儿茶素和表儿茶素据报道可微弱抑制cox-2基因在人结肠癌DLD-1细胞中的转录(IC50＝415.3μM)(Mutoh等(2000)Jpn.J.Cancer Res.91：686-691)。(+)-儿茶素保护神经不受红葡萄酒侵害的能力源自儿茶素的抗氧化剂性能，而不是其对细胞内酶类如环氧合酶、脂氧合酶或一氧化氮合酶的抑制作用(Bastianetto等(2000)Br.J.Pharmacol.131：711-720)。由绿茶和红茶中纯化而得的儿茶素衍生物如表没食子儿茶精-3-没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶精(EGC)、表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)和茶黄素，其显示出对人结肠粘膜和结肠肿瘤组织中AA的环氧合酶和脂氧合酶依赖性代谢(Hong等(2001)Biochem.Pharmacol.62：1175-1183)以及诱导型cox-2表达和PGE2生成的抑制(Park等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.286：721-725)。由Celastrus orbiculatus的气生部分分离得到的表阿夫儿茶精(Epiafzelechin)展现出剂量依赖性COX-1活性抑制，其IC50值为15μM，并且据证实，在以口服100mg/kg剂量给药之后其对角叉菜胶诱导的鼠踝肿胀具有抗炎活性(Min等(1999)Planta Med.65：460-462)。
金合欢是豆科树木和灌木属。金合欢属包括多于1000种属于豆科及含羞草亚科的物种。金合欢分布于全世界如中、南美洲、非洲、亚洲部分地区以及具有最多特有品种的澳洲的热带和亚热带地区。金合欢有重大的经济意义，其提供了鞣质、树胶、木材、燃料和饲料的原料。鞣质主要从树皮中分离得到，被广泛用于鞣制皮革和碎革。一些金合欢树皮还用于当地醑剂的调味。如藤金合欢的一些土著物种也产出皂苷，其为各种植物多糖中的任何一种，当与水一同混合并搅拌时，形成象肥皂的泡沫。皂苷用于洗涤剂、发泡剂和乳化剂。金合欢属的一些物种花气味芬芳因此用于生产香水。许多金合欢的心材用于制造农业工具，还是木柴的来源。金合欢树胶广泛用于药物和甜点，并用作纺织工业中的定型和修整材料。
迄今为止，约从各种金合欢品种中分离出330种化合物。类黄酮为从金合欢中分离出的主要类型的化合物。已鉴定有大约180种不同的类黄酮，其中111种为黄烷。萜类是从金合欢属物种中分离出的第二大类化合物，已鉴定48种化合物。从金合欢中分离出的其他类型化合物包括生物碱(28)、氨基酸/肽(20)、鞣质(16)、烃类(15)、含氧杂环(15)和脂肪族化合物(10)(Buckingham，The Combined Chemical Dictionary，Chapman & Hall CRC，5：2版，Dec.2001)。
所有金合欢品种中具有中等到高浓度的酚类化合物，特别是黄烷(Abdulrazak等(2000)Journal of Animal Sciences.13：935-940)。在历史上，金合欢属的大多数植物和提取物被用作收敛药治疗胃肠道紊乱、腹泻、消化不良以及止血(Vautrin(1996)Universite Bourgogne(France)European abstract 58-01C：177；Saleem等(1998)Hamdard Midicus.41：63-67)。AcaciaArabica Willd.的树皮和荚中含有大量的鞣质，因此被用作收敛药和祛痰药(Nadkami(1996)India Materia Medica，BombayPopular Prakashan，pp.9-17)。据报道，从来自索马里的A.tortilis的茎皮中分离出的二芳基丙醇衍生物具有松弛平滑肌作用(Hagos等(1987)Planta Medica.53：27-31，1987)。还有报道指出分离自胜利金合欢的萜类糖苷对二甲基苯并蒽诱导的鼠皮致癌作用具有抑制作用(Hanausek等(2000)Proceedings American Association for Cancer Research AnnualMeeting 41：663)且诱发细胞凋亡(Haridas等(2000)Proceedings AmericanAssociation for Cancer Research Annual Meeting.41：600)。据报道阿拉伯胶金合欢的植物提取物具有致痉、血管收缩和抗高血压作用(Amos等，(1999)Phytotherapy Research 13：683-685；Gilani等(1999)PhytotherapyResearch 13：665-669)，以及抗血小板凝集作用(Shah等，(1997)GeneralPharmacology 29：251-255)。报道指出阿拉伯胶金合欢具有抗炎活性。据推测，类黄酮、多糖和有机酸为可能的活性成分(Dafallah和Al-Mustafa(1996)American Journal ofChinese Medicine 24：263-269)。迄今为止，唯一有报道的由金合欢分离的5-脂氧合酶抑制剂为单萜氨甲酰(Seikine等(1997)Chemical Pharmaceutical Bulletin.45：148-11)。
金合欢树皮提取物在日本被授予的专利为作为增白剂外部应用(Abe，日本专利10025238)、作为葡萄糖转移酶抑制剂的牙科应用(Abe，日本专利07242555)、作为蛋白质合成抑制剂(Fukai，日本专利07165598)、作为活性氧清除剂用于外部皮肤制剂(Honda，日本专利07017847，Bindra美国专利No.6,1266,950)，以及作为透明质酸酶抑制剂口服用于预防炎症、花粉热和咳嗽(Ogura，日本专利07010768)。
迄今为止，申请人未看到任何仅将无取代B环类黄酮和黄烷作为主要生物活性组分用于双重抑制COX/LOX酶以对哺乳动物皮肤病症产生明显益处的报道。
发明内容
本发明包括可同时有效地既抑制环氧合酶(COX)又抑制脂氧合酶(LOX)的方法，其用于预防及治疗与皮肤有关疾病和症状。该同时双重抑制COX及LOX酶的方法包括向需要的主体患者给药，优选局部给药包含合成和/或从单一植物或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的组合物。本文将该组合物称作SoliprinTM。该方法的有效性由纯化的酶在不同的细胞系、多种动物模型以及最终人类临床试验中得以证实。组合物中的无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9∶0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1∶99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约80∶20。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。
本发明还包括预防和治疗由COX及LOX介导的皮肤疾病和病症的方法。该预防和治疗由COX及LOX介导的皮肤疾病和病症的方法包括向需要的主体给药，优选局部给药有效量的包含合成和/或从一种或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物以及药物学可接受载体的组合物。无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9∶0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1∶99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明特定的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约80∶20。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。
此处所述无取代B环类黄酮也指可根据以下的发明应用的无取代B环黄酮烷和黄酮醇，包括以下结构通式所示的化合物：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，碳、氧、氮或硫，单个或者多个糖结合的糖苷，该糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子以及碳酸根等。
本发明的无取代B环类黄酮可由合成方法获得，或从下列各科植物中提取，包括但不限于番荔枝科、菊科(Asteraceae)、紫葳科、使君子科、菊科(Compositae)、大戟科、唇形科、樟科(Lauranceae)、豆科、桑科、松科、凤尾蕨科、中国蕨科、榆科和姜科。该无取代B环类黄酮可由高等植物属提取、浓缩和纯化，包括但不限于假鹰爪属、Achyrocline、木蝴蝶属、Buchenavia、香青属、山芫荽属、鼠麴草属、蜡菊属、矢车菊属、泽兰属、Baccharis、乌柏属、黄芩属、Molsa、羽萼木属、水苏属、牛至属、新塔花属、山胡椒属、黄肉楠属、金合欢属、鱼藤属、甘草属、鸡血藤属、水黄皮属、灰毛豆属、木波罗属、榕属、粉叶蕨属、隐囊蕨属、松属、榆属和山姜属。
可根据以下发明应用的黄烷包括以下的结构通式所示的化合物：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯；碳、氧、氮或硫，单个或者多个糖结合的糖苷，该糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；二聚、三聚以及其他多聚黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子以及碳酸根等。
本发明的黄烷可由选自金合欢属的一种或多种植物中提取而来。在一个优选的具体实施方案中该植物选自以下组中：儿茶、Acaciaconcinna、金合欢、阿拉伯胶树、Acacia speciosa、阿拉伯金合欢、Acaciacaesia、蛇藤、藤金合欢、黑荆树、Acacia picnantha、白粉金合欢、大叶相思、Acacia holoserecia和马占相思。
在一个具体实施方案中，本发明包括预防和治疗许多由COX和LOX介导的皮肤疾病和病症的方法，该疾病和病症包括但不限于阳光灼伤、热灼伤、粉刺、局部的创口、由真菌、微生物及病毒感染所引起的不严重的炎症、白癜风、全身性红斑狼疮、牛皮癣、癌、黑素瘤、以及其它哺乳动物皮肤癌。在另一具体实施方案中，本发明包括预防和治疗由暴露于紫外(UV)照射、化学品、热、风及干燥环境引起的皮肤损伤的方法。在另一具体实施方案中，本发明包括预防和治疗皱纹、皮肤松弛、眼周边皱纹及黑眼圈、皮炎及其他与过敏相关的皮肤症状的方法。
本发明还包括含有本发明治疗药物的治疗组合物。此处所述的治疗组合物除了可用于预防和治疗上述皮肤疾病和症状外，还可用于舒缓敏感性皮肤以及提供因改善弹性、减少和延缓衰老、增强年轻的外观和肌理及增加柔韧性、紧实度、光滑度及柔度的光滑、年轻的肌肤。
本发明预防和治疗的方法包括向需要的主体局部给药治疗有效量的从单一或多种来源分离的无取代B环类黄酮和黄烷的组合物。根据用于获得该组合物的方法，所述单一和/或多种无取代B环类黄酮及黄烷的纯度包括但不限于0.01％到100％。在一个优选的具体实施方案中，含有无取代B环类黄酮和黄烷的它们的混合物的剂量通常是选自基于局部组合物总重量的0.001％到100％范围中的有效、无毒的量。本领域技术人员采用常规的临床试验可决定用于治疗特定疾病的最佳剂量。
本发明包括采用酶促及体内模型对无取代B环类黄酮和黄烷组合物进行评价以优化组合物和获得期望的生理活性。该组合物的有效性和安全性还通过人类临床试验得以证实。本发明的组合物可通过本领域技术人员所知的任何方法给药。给药方式包括但不限于肠内(口服)给药、非胃肠道(静脉内、皮下和肌内)给药和局部施用。在一个优选具体实施方案中，本发明的方法包括向需要的主体局部给药治疗有效量的合成和/或从单一或多种来源分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物。
应理解为前述总体描述及下述详细描述都仅是举例说明和解释，而并非对所要求保护的本发明的限制。
附图说明
图1图示从黄芩分离的标准化的无取代B环类黄酮提取物(HPLC测定含83％贝加灵)对COX-1和COX-2的抑制作用曲线。测定该提取物对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经计算，COX-1的IC50为0.24μg/mL/酶单位而COX-2的IC50为0.48ug/mL/酶单位。
图2图示从黄芩分离的纯化成分贝加灵对COX-1和COX-2的抑制作用曲线。测定该化合物对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经测定，COX-1的IC50为0.44μg/mL/酶单位以及而COX-2的IC50为0.28μg/mL/酶单位。
图3图示从黄芩分离的纯化成分贝加因对COX-1和COX-2的抑制作用曲线。测定该化合物对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对与抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经测定，COX-1的IC50为0.18μg/mL/酶单位以及而COX-2的IC50为0.28μg/mL/酶单位。
图4图示从儿茶分离的含50％总黄烷的标准化的黄烷提取物对COX-1和COX-2的抑制作用曲线。测定该提取物对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经计算，COX-1的IC50为0.17μg/mL/酶单位而COX-2的IC50为0.41μg/mL/酶单位。
图5图示从儿茶分离的含超过90％黄烷的组合物对COX-1和COX-2的抑制作用曲线。测定该组合物对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用曲线。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经计算，COX-1的IC50为0.11μg/mL/酶单位而COX-2的IC50为0.42μg/mL/酶单位。
图6图示一组合物对COX-1和COX-2的抑制作用曲线，该组合物由从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物与从儿茶树皮分离的黄烷提取物以80∶20比例相结合得到。测定该下文称作SoliprinTM的组合物对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经计算，COX-1的IC50为0.76μg/mL/酶单位而COX-2的IC50为0.80μg/mL/酶单位。
图7图示一组合物对COX-1和COX-2的抑制作用曲线，该组合物由从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物与从儿茶树皮分离的黄烷提取物以50∶50比例相结合得到。测定该组合物SoliprinTM对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对与抑制剂浓度(μg/mL)的作图。经计算，COX-1的IC50为0.38μg/mL/酶单位而COX-2的IC50为0.84μg/mL/酶单位。
图8图示一组合物对COX-1和COX-2的抑制作用曲线，该组合物由从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物与从儿茶树皮分离的黄烷提取物以20∶80比例相得到。测定该组合物SoliprinTM对重组绵羊COX-1(◆)或绵羊COX-2(■)过氧化物酶活性的抑制作用。数据显示为百分抑制率对与抑制剂浓度(μg/mL)的作图。COX-1的IC50为0.18μg/mL/酶单位而COX-2的IC50为0.41μg/mL/酶单位。
图9图示源自儿茶的黄烷提取物对5-LO的抑制作用曲线。对该组合物对重组马铃薯5-脂氧合酶活性(◆)的抑制作用的测定如实施例4所述。数据显示为没有抑制剂试验的抑制百分比。对5-LO的IC50为1.38μg/mL/酶单位。
图10描述在如实施例9所述条件下高效液相色谱法(HPLC)测定含有从黄芩根分离的无取代B环类黄酮提取物与从儿茶树皮分离的黄烷提取物80∶20的混合物的典型组合物的色谱图。
图11图示如实施例10所述在THP-1或HT-29细胞中(ATCC)以ELISA测定的提高SoliprinTM浓度对LPS诱导的新合成的LTB4(◆)的作用。该SoliprinTM通过从黄芩根分离的无取代B环类黄酮与从儿茶树皮分离的黄烷标准化的提取物以80∶20比例结合得到产生。SoliprinTM组合物的活性以诱导的LTB4合成的％抑制率表示。
图12是如实施例10中所示，将以ELISA测定的在未诱导的细胞中以3μg/mL SoliprinTM处理后残留在HT-29细胞中的LTB4水平同以3μg/mL布洛芬的处理进行比较。处理两天后SoliprinTM组合物显示对HT-29细胞中LTB4的80％的抑制率。
图13图示如实施例11所述的用以测定炎症抑制的方法的耳肿胀数据。将由从黄芩根分离的无取代B环类黄酮与从儿茶树皮分离的黄烷标准化的提取物80∶20比例相结合得到的SoliprinTM与未处理小鼠以及通过口腔灌服给药吲哚美辛(1.5μg/kg)的小鼠进行比较。数据表示为对每只小鼠未处理对比处理过的耳垂的微米级测量的差异。
图14图示100mg/kg由黄芩根分离的无取代B环类黄酮与从儿茶树皮分离的黄烷标准化的提取物80∶20比例结合得到的SoliprinTM对注射AA的小鼠踝(SoliprinTM+花生四烯酸)的作用与未处理小鼠(未处理+花生四烯酸)、未注射AA的小鼠(阴性对照)或注射液体载体的小鼠(载体对照)进行比较。
图15图示如实施例12所述的用UV光照射小鼠后作为时间的函数的不同治疗组中无毛小鼠皮肤红斑分值的变化。用SoliprinTM处理组B-1、A-1、B-2和A-2中的小鼠，组B-1和B-2在照射前处理，组A-1和A-2在照射后处理。SoliprinTM由从黄芩根分离的无取代B环类黄酮与从儿茶树皮分离的黄烷的标准化的提取物以80∶20比例相结合得到。参考图15，可见在UV照射前后局部施用SoliprinTM与对照组及给药标准治疗药物Sooth-a-caine的组比较显著降低红斑分值。
具体实施方式
此处所使用的各种术语涉及本发明的多个方面。提供以下定义以帮助阐明对本发明成分的说明。
应注意术语“一个”(“a”或“an”)实体是指一个或多个该实体；例如一种类黄酮指一种或多种类黄酮。同样地，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在此处可互相替换。
此处所用的“无取代B环类黄酮”为一类特殊的类黄酮，如下列结构通式所示，其芳香B环无取代基：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，碳、氧、氮或硫，单个或者多个糖结合的糖苷，该糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子以及碳酸根等。
“黄烷”为一类特殊的类黄酮，其通常可由下列结构通式代表：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自以下组中：-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它们的化学衍生物；碳、氧、氮或硫，单个或者多个糖结合的糖苷，该糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它们的化学衍生物；二聚、三聚以及其他多聚黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；以及
X选自药物学可接受的抗衡阴离子，其包括但不限于羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
本文所用“治疗的”包括治疗和/或预防。当使用时，治疗是指人类以及其他动物。
“药物学或治疗有效的剂量或量”指足以引发所需生物学结果的剂量水平。该结果可以是病征、症状或疾病的起因的缓解或任何其他所需的生物学系统的改变。
“安慰剂”指由非活性物质对该足以引发所需的可缓解病征、症状或疾病的起因的生物学结果的药物学或治疗有效的剂量或量的替代。
“主体”或“患者”为向其给药本此处所述组合物的为人或动物的生存的对象。因此，本文所述的发明可用于兽医以及人类施用，并且术语“患者”或“主体”不应以限制性方式解释。在兽医施用的情形下，可在考虑到动物的体重下，如下述确定。
注意本申请从头到尾提供各种引用。各个引用特定地全文并入此处作为参考。
本发明提供用有机和水溶液提取含无取代B环类黄酮和黄烷植物(实施例1，表1)的方法。检定粗提取物对环氧合酶的抑制活性(实施例2，表2和3)。纯化的无取代B环类黄酮和黄烷分别显示对环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的抑制活性，如实施例3和4所述。实施例5和6中描述对提取物分析和定量的方法，实施例7和8中提供从药材来源获得标准化的无取代B环类黄酮和黄烷的工艺。
在本发明一具体实施方案中，如实施例1、2、5和8中所述，标准化的无取代B环类黄酮提取物包含纯度在总无取代B环类黄酮的1-99重量％之间的活性化合物。贝加灵是提取物中的主要活性成分，其含量大约为总无取代B环类黄酮的50-90重量％。在一优选的具体实施方案中，该标准化提取物含有＞70％的总无取代B环类黄酮，其中＞75％的无取代B环类黄酮是贝加灵。
在一具体实施方案中，如在实施例1、4、6和7中所述，标准化的黄烷提取物包含纯度在总黄烷1-99重量％之间的活性化合物。儿茶素是提取物的主要活性成分，其含量达总黄烷的50-95重量％。在一优选的具体实施方案中，该标准化黄烷提取物含有＞80％总黄烷，其中＞70％的黄烷是儿茶素。
在一具体实施方案中，通过以99∶1到1∶99的比例混合上述两种提取物或合成化合物制备SoliprinTM。无取代B环类黄酮与黄烷优选的比例为如实施例9和表10所述的80∶20无取代B环类黄酮∶黄烷，以及如实施例9中所述的为15∶85。
在SoliprinTM中无取代B环类黄酮的浓度可以为从约1％到99％，且SoliprinTM中黄烷的浓度可以为从99％到1％。在本发明一个优选的具体实施方案中，SoliprinTM中总无取代B环类黄酮的浓度约为20％，其中贝加灵的含量约为SoliprinTM总重的15％；SoliprinTM中总黄烷的浓度约为75％，其中儿茶素的含量约为70％。在该具体实施方案中，SoliprinTM中的总活性成分(无取代B环类黄酮加上黄烷)为＞总重量的90％。
本发明包括可同时有效地既抑制环氧合酶(COX)又抑制脂氧合酶(LOX)的方法，可用于预防和治疗与皮肤相关的疾病和病症。该同时双重抑制COX和LOX酶的方法包括向需要的主体给药优选为局部给药含有合成和/或从一种或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的组合物。本文称该组合物为SoliprinTM。该方法的有效性由纯化的酶在不同的细胞系、多种动物模型以及最终人类临床试验中得以证实。组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9∶0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1∶99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约20∶80。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，而黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。
本发明还包括预防和治疗由COX及LOX介导的皮肤疾病和病症的方法。该预防和治疗由COX及LOX介导的皮肤疾病和病症的方法包括向需要的主体给药，优选局部给药有效量的含有合成和/或从一种或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物以及药物学可接收载体的组合物。无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99.9∶0.1无取代B环类黄酮比黄烷到0.1∶99.9无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明特定的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为20∶80。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，而黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。
在一个具体实施方案中，本发明包括预防和治疗许多由COX和LOX介导的皮肤疾病和病症的方法，包括但不限于阳光灼伤、热灼伤、粉刺、局部的创口、由真菌、微生物及病毒感染所引起的不严重的炎症、白癜风、全身性红斑狼疮、牛皮癣、癌、黑素瘤、以及其它哺乳动物皮肤癌。在另一具体实施方案中，本发明包括预防和治疗由暴露于紫外(UV)照射、化学品、热、风及干燥环境引起皮肤损伤的方法。在另一具体实施方案中，本发明包括预防和治疗皱纹、皮肤松弛、眼周边皱纹及黑眼圈、皮炎及其他过敏相关的皮肤症状的方法。
本发明还包括含有本发明治疗药物的治疗组合物。此处所述的治疗组合物除了可用于预防和治疗上述皮肤疾病和症状外，还可用于舒缓敏感性皮肤以及提供弹性更佳、衰老减低及延缓、年轻的外观及肌理得以改善以及柔韧性、紧实度、光滑度及柔度得以改善的光滑及年轻肌肤的益处。
根据本发明方法可以应用的无取代B环类黄酮包括上述提出的结构通式所示的化合物。本发明的无取代B环类黄酮可由合成方法获得，或从下列各科植物中提取，包括但不限于番荔枝科、菊科(Asteraceae)、紫葳科、使君子科、菊科(Compositae)、大戟科、唇形科、樟科(Lauranceae)、豆科、桑科、松科、凤尾蕨科、中国蕨科、榆科和姜科。该无取代B环类黄酮可由高等植物属提取、浓缩和纯化，包括但不限于假鹰爪属、Achyrocline、木蝴蝶属、Buchenavia、香青属、山芫荽属、鼠麴草属、蜡菊属、矢车菊属、泽兰属、Baccharis、乌柏属、黄芩属、Molsa、羽萼木属、水苏属、牛至属、新塔花属、山胡椒属、黄肉楠属、金合欢属、鱼藤属、甘草属、鸡血藤属、水黄皮属、灰毛豆属、木波罗属、榕属、粉叶蕨属、隐囊蕨属、松属、榆属和山姜属。
无取代B环类黄酮存在于植物的不同部位中，包括但不限于茎、茎皮、嫩枝、块茎、根、根皮、嫩梢、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶及其他气生部分。于2002年3月1日递交的名为“Identification ofFree-B-ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors”(无取代B环类黄酮作为有效的COX-2抑制剂的鉴定)的第10/091,362号美国申请公开了分离和纯化无取代B环类黄酮的方法。此处全文并入作为参考。
根据本发明方法可以应用的黄烷包括上述结构通式所示的化合物。本发明的黄烷从选自金合欢属植物的一种或多种植物中提取。在一个优选的具体实施方案中该植物选自以下组中：儿茶、A.concinna、金合欢、阿拉伯胶树、A.speciosa、阿拉伯金合欢、A.caesia、蛇藤、藤金合欢、黑荆树、A.picnantha、白粉金合欢、大叶相思、4.holoserecia和马占相思。
黄烷存在于植物的不同部位中，包括但不限于茎、茎皮、干、主干树皮、嫩枝、块茎、根、根皮、嫩梢、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶及其他气生部分。于2002年3月22日递交的名为“Isolation of a DualCOX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor form Acacia”(从金合欢分离双重COX-2和5脂氧合酶抑制剂)的第10/104,477号美国申请公开了分离和纯化黄烷的方法。此处全文并入作为参考。
本发明采用将一系列体内炎症及毒性试验及体外生化、细胞和基因表达筛选结合的策略来鉴定特异地抑制COX和LOX酶活性以及影响mRNA基因表达并减轻炎症的活性植物提取物。此处用以鉴定特异地抑制COX和LOX的活性植物提取物的方法记载于实施例1和2。于在2002年3月1日递交的名为“Identification of Free-B-ring Flavonoids as PotentCOX-2 Inhibitors”(无取代B环类黄酮作为有效的COX-2抑制剂的鉴定)的第10/091,362号美国申请、于2002年3月22日递交的名为“Isolation ofa Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor form Acacia”(从金合欢分离双重COX-2和5脂氧合酶抑制剂)的第10/104,477号美国申请以及于2003年中4月30日递交的名为“Formulation with Dual COX-2 and5-Lipoxygenase Inhibitory Activity”的第10/427,746号美国申请，在此各自全文并入作为参考。
用于测定对COX抑制作用的生化试验依靠在血红素和花生四烯酸存在下的蛋白的过氧化物酶的活性。该如实施例3所述的试验显示从黄芩分离得到的纯化的无取代B环类黄酮、贝加灵和贝加因和从儿茶分离提取的黄烷，以及含有高浓度的无取代B环类黄酮和黄烷的各种分别的标准化的提取物抑制COX活性(图1-5)。此外，如实施例9所述制备的不同比例的各种分别的标准化的提取物的组合物(即80∶20、50∶50及20∶80的无取代B环类黄酮∶黄烷)在体外全高效地抑制COX的活性。(图6-8)。如实施例4所述，应用体外脂氧合酶筛查试验评价从儿茶分离的黄烷提取物对LOX活性的抑制。结果如图9所示显示。此外，如实施例10所述，使用SoliprinTM样品进行以在LOX途径中花生四烯酸的分解中抑制化合物，即白三烯B4为目标的细胞试验。图11和图12显示SoliprinTM对LTB4的抑制结果。
体内有效性通过如实施例11所示，于小鼠耳部和踝关节应用皮肤刺激性物质如AA并测量以SoliprinTM处理后肿胀的减少得以证实。结果如图13和图14显示。最后，实施例12和图15描述局部施用SoliprinTM组合物对预防和治疗UV诱导的红斑的有效性。在实施例12所述的研究中，将无取代B环类黄酮∶黄烷为80∶20混合比例的SoliprinTM溶于水中，并以两种浓度，于UV曝露前后分别局部施用于无毛小鼠的皮肤。相对于对照组和用Sooth-A Cain治疗的组中的严重及扩大的红斑，四个SoliprinTM组、在两种浓度以及施用时间不管是UV暴露之前还是之后的都显示于更小皮肤面积中的更轻微的红色。
实施例13(表11和12)描述采用药理学、皮肤病学和美容学可接受的赋形剂制备SoliprinTM乳膏剂的一般方法。以说明为目的，该实施例提供了制备0.5重量％和1.5重量％两种SoliprinTM乳膏剂的工艺。最后，将如实施例13所述制备的两种SoliprinTM乳膏剂在人类皮肤上评价可能的刺激性和接触致敏作用的生成。
总之，本发明包括同时有效地既抑制COX酶又抑制LOX酶的方法。该同时双重抑制COX和LOX途径的方法包括向需要的主体给药含有合成和/或从一种或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物的组合物。无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99∶1无取代B环类黄酮比黄烷到1∶99无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明特定的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约20∶80。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，而黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。
本发明还包括预防和治疗由COX及LOX介导的皮肤疾病和病症的方法。该预防和治疗由COX及LOX介导的皮肤疾病和病症的方法包括向需要的主体给药有效量的含有合成和/或从一种或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物以及药物学可接收载体的组合物。无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为99∶1无取代B环类黄酮比黄烷到1∶99无取代B环类黄酮比黄烷。在本发明特定的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自以下组中：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的具体实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约20∶80。在优选的具体实施方案中无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，而黄烷从一种或多种金合欢属植物中分离。
申请人相信于2002年3月22日提交的名为“Isolation of a DualCOX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor form Acacia”(从金合欢分离双重COX-2和5脂氧合酶抑制剂)的第10/104,477号美国申请为分离自金合欢属植物的证明具有对COX和LOX双重特异性的组合物的最初报道，并且在2002年3月1日提出的名为“Identification of Free-B-ringFlavonoids as Potent COX-2 Inhibitors”(无取代B环类黄酮作为有效的COX-2抑制剂的鉴定)的第10/091,362号美国申请为无取代B环类黄酮结构和COX-2抑制活性之间相关性的最初报道。这些发现导致产生一种新型的两种特殊化合物——无取代B环类黄酮和黄烷——的混合物，该混合物用以制备此处所谓SoliprinTM的组合物，如2003年4月30日提出名为“Formulation With Dual Cox-2 And 5-Lipoxygenase InhibitoryActivity.”的第10/427,746号美国申请所述，其可用于预防和治疗由COX和LOX介导的疾病和病症。COX和LOX介导的疾病和病症包括但不限于皮肤的疾病和症状，皮肤的疾病和症状包括但不限于阳光灼伤、热灼伤、粉刺、局部的创口、由真菌、微生物及病毒感染所引起的不严重的炎症、白癜风、全身性红斑狼疮、牛皮癣、癌、黑素瘤、以及其它哺乳动物皮肤癌、由暴露于UV照射、化学品、热、风及干燥环境引起的皮肤损伤、皱纹、皮肤松弛、眼周边皱纹及黑眼圈、皮炎及其他过敏相关的皮肤症状。虽然不受理论的局限，但是据信这类化合物的作用机制是直接双重抑制COX和LOX酶的活性。
本发明还包括含有本发明的治疗药物的治疗组合物，包括其各种剂型。实施例5-9和图10描述这些组合物的制备方法、以及测定其纯度以及特定组分的方法。
在优选的具体实施方案中，本发明的预防和治疗COX和LOX介导的皮肤相关疾病和病症的方法包括向需要的主体局部给药治疗有效量的从单一来源或多种来源分离的无取代B环类黄酮和/或黄烷的组合物。根据用于获得该化合物的方法，单一和/或多种无取代B环类黄酮及黄烷的纯度包括但不限于0.01％到100％。在一个优选的具体实施方案中，含有无取代B环类黄酮和黄烷的它们的混合物的剂量是通常选自基于局部组合物总重量的0.001％到100％的有效、无毒的量。本领域技术人员采用常规的临床试验可决定用于治疗特定疾病的最佳剂量。
如下所述，本发明包括对采用酶促及体内抗炎模型对不同组成的对无取代B环类黄酮和黄烷进行评价以优化组合物并获得最大效力。本发明提供用于分离、纯化及使金合欢黄烷和无取代B环类黄酮相结合以生成具有期望生理活性的组合物的商业上可行的工艺。除了用于预防和治疗上述皮肤的疾病和症状外，此处所述的治疗组合物还可用于舒缓敏感性皮肤以及提供弹性更佳、衰老减低及延缓、年轻的外观及肌理得以改善以及柔韧性、紧实度、光滑度及柔度得以改善的光滑及年轻肌肤的益处。
可将本发明的组合物配制成含有其他组分如药物学和/或美容可接受的赋形剂、佐剂和/或载体的药物组合物。例如，本发明的组合物可在被治疗的主体可耐受的赋形剂中配制。赋形剂是用作药物的稀释剂或载体的惰性物质。所述赋形剂的实例包括但不限于水、缓冲液、盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液、甘露醇、Hank’s溶液、防腐剂和其他水性生理平衡盐溶液。也可使用非水性载体，如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的组合物包括含有增粘剂的混悬剂，增粘剂如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂还可含有少量添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质。缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和甘氨酸缓冲剂或它们的混合物。防腐剂的实例包括但不限于硫柳汞、m-或o-甲酚、甲醛溶液和苯甲醇。标准组合物可为液体或可被合适的液体吸收作为为用于给药的混悬剂或溶液剂的固体。因此，在非液体组合物中，赋形剂可以含有右旋糖、人血清蛋白、防腐剂等，并可在给药之前向其中加入无菌水或盐水。
在本发明的一个具体实施方案中，该组合物还可包括佐剂或载体。佐剂为通常提高哺乳动物对特定的生物活性物质的生化反应的典型物质。合适的佐剂包括但不限于弗氏佐剂；其他细菌细胞壁成分；基于铝的盐类；基于钙的盐类；硅石；类霉素；血清蛋白；病毒外壳蛋白；其他由细菌衍生的制剂；γ干扰素；嵌段共聚物佐剂如Hunter’s Titermax佐剂(Vaxcel.TM.，Inc.Norcross，Ga)；Ribi佐剂(可从Ribi ImmunoChemResearch，Inc.，Hamilton，Mont.得到)；和皂苷及其衍生物如Quil A(可从Superfos Biosector A/S，Denmark得到)。载体为提高治疗组合物在所治疗动物中半衰期的典型化合物。合适的载体包括但不限于聚合控释剂型、生物可降解植入物、脂质体、细菌、病毒、油、酯和二醇类。
在一个具体实施方案中，该组合物被制备为可缓慢释放本发明组合物至主体中的控释剂型。如此处所使用的控释剂型包含在控释载体中的本发明组合物。合适的控释载体为本领域技术人员所公知的那些。优选的控释剂型为生物可降解的(即可生物侵蚀的)。
本发明的治疗药物优选以本领域技术人员所知的用于局部给药治疗组合物的任何适宜的方式局部给药，包括但不限于软膏剂、凝胶剂、洗剂、或乳膏基质或乳剂、贴剂、敷料或面膜、无粘性纱布(nonstickinggauze)、绷带、拭子或涂抹布(cloth wipe)。该局部施用可采用任何已知用于局部给药的标准方式局部给药于任何患病区域。治疗组合物可根据给药方法以各种单位剂量形式给药。对于特定的传递模式，本发明的治疗组合物可在本发明的赋形剂中配制。本发明的治疗试剂可向优选哺乳动物、更优选人类的任何主体给药。特定的给药方式取决于要治疗的疾病。
在一个具体实施方案中，适宜的软膏剂包含所希望浓度，即为通常选自基于局部组合物总重量的0.001％到100％范围的有效、无毒的量的无取代B环类黄酮和黄烷混合物、65％到100％(优选75％到96％)的白软石蜡、0到15％的液体石蜡、以及0％到7％(优选3到7％)的羊毛脂或其合成的等效衍生物。在另一具体实施方案中，软膏剂可包含聚乙烯—液体石蜡基质。
在一个具体实施方案中，适宜的乳膏剂包括乳化系统以及如期望浓度的如上所述的无取代B环类黄酮和黄烷。该乳化系统优选包括2到10％聚氧乙烯醇(如可以商标名CetomacrogolTM1000购得的混合物)、10％到25％的十八烷醇、20％到60％的液体石蜡以及10％到65％的水；连同一种或多种防腐剂如0.1-1％的N，N”-亚甲基双[N’-[3-(羟甲基)]-2，5-二氧-4-咪唑烷基]脲](可以Imidurea USNF的名称获得)、0.1到1％的4-羟基苯甲酸烷基酯(如从Nipa Laboratories获得的商标名为Nipastat的混合物)、0.01到0.1％的丁基4-羟基苯甲酸钠(可从NipaLaboratories以商标名Nipabutyl sodium获得)以及0.1到2％的苯氧乙醇。实施例13描述作为乳膏剂的本发明的两种不同浓度组合物的配方，并且实施例14描述用以评价乳膏剂对皮肤的刺激性和致敏作用的研究。从该研究可确定SoliprinTM是可以有效浓度局部施用而不会对皮肤引起刺激或导致致敏作用的安全组合物。
在一个具体实施方案中，适宜的凝胶剂由半固体系统组成，其中液相被束缚在高度交联的三维聚合基质内。液相可包括水以及期望量的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物，0到20％可与水溶混的添加剂如甘油、聚乙二醇或丙二醇，和0.1到10％、优选0.5到2％的增稠剂，该增稠剂可为天然产物如黄蓍胶、果胶、角叉菜、琼脂和海藻酸，或合成或半合成化合物如甲基纤维素、聚羧基甲烯(carboxypolymethylene)(Carbopol)；以及一种或多种防腐剂如0.1到2％的4-羟基苯甲酸甲酯(羟苯甲酸甲酯)或苯氧乙醇-differential。另一种适宜的基质包括期望量的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物、以及70到90％的聚乙二醇(例如，根据U.SNational Formulary(USNF)制备的含有40％的聚乙二醇3350和60％的聚乙二醇400的聚乙二醇软膏剂)、5到20％的水、0.02-0.25％的抗氧化剂(如丁基化羟基甲苯)和0.005到0.1％的螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))。
如上所用的术语软石蜡包括乳膏剂或软膏剂基质白软石蜡和黄软石蜡。术语羊毛脂包括天然的羊毛脂和纯化的羊毛脂。羊毛脂的衍生物特别包括经化学修饰以改变其物理或化学性质的羊毛脂，羊毛脂的合成等效物特别包括合成或半合成的已知且用于药物和美容领域作为羊毛脂的供选物的化合物和混合物，并且可例如被称作羊毛脂的替代品。
一种可应用的适宜的羊毛脂合成等效物是可以商标SoftisanTM处得到的物质，其被称为Softisan 649。从Dynamit Nobel Aktiengesellschaft处得到的Softisan 649是天然植物脂肪酸、异硬脂酸和己二酸的甘油酯；H.Hermsdorf在Fette，Seifen，Anstrichmittel，Issue No.84，No.3(1982)，pp.3-6中详述其性质。
此上提及可作为适宜软膏剂或乳膏剂基质成分的其他物质及其性质在标准参考著作中有详尽描述，如药典。Cetomacrogol 1000具有CH3(CH2)m(OCH2CH2)nOH的分子式，其中m可为15或17，n可为20到24。丁基化羟基甲苯是2，6-二叔丁基对甲苯酚。Nipastat是4-羟基苯甲酸的甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的混合物。
本发明的组合物可通过传统的制药技术生产。因此，例如，前述的组合物可传统地通过在升高的温度，优选60-70℃下将软石蜡、若存在的话液体石蜡、以及羊毛脂或其衍生物或其合成等效物一起混合而制备。然后将混合物冷却至室温，并在加入莫匹罗星钙盐的水合结晶体、连同皮质甾类及任何其他的成分后搅拌以确保充分分散。
不管给药的方式如何，都根据主体的大概体重计算具体剂量。确定涉及每一上述组合物治疗的适当剂量必须进一步改善该计算值，这是本领域技术人员的例行工作，并且在他们日常开展的工作范围内，无需过度试验，特别是根据本文公开的剂量信息和试验进行该项工作时。这些剂量可通过应用测定所用剂量的确定的试验结合适当剂量—反应数据而确定。
应理解的是，本文所述的发明可用于兽医以及人类的应用，并且不应以限制性的方式解释术语“主体”。在兽医应用的情况下，剂量范围可在考虑动物的体重的情况下如上所述确定。
本发明的组合物可以本领域技术人员所知的任何方法给药。给药方式包括但不限于肠内(口服)给药、非胃肠道(静脉、皮下和肌肉内)给药和局部施用。本发明的治疗方法包括向需要的患者内部或局部给药治疗有效量的合成和/或从一种或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物。在一个优选的具体实施方案中，局部给药该组合物。
下列实施例仅供以描述目的，而并非为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1金合欢和黄芩植物中有机和水提取物的制备
将源自儿茶树皮、直萼黄芩根、黄芩根或Scutellaria lateriflora全株的植物材料研磨成粒径不大于2mm的颗粒。之后将干燥研细的植物材料(60g)转移至锥形瓶并加入甲醇∶二氯甲烷(1∶1)(600mL)。振摇混合物一小时，过滤，将生物量再次用甲醇∶二氯甲烷(1∶1)(600mL)提取。合并有机提取液，真空蒸发得到有机提取物(见以下表1)。有机提取之后，将该生物量风干并用超纯水(600mL)提取一次。过滤水溶液并冻干得到水提取物(见以下表1)。
表1.金合欢和黄芩物种中有机和水提取物的产率
实施例2.儿茶、各种黄芩和其他植物的植物提取物对COX-2和COX-1过氧化物酶活性的抑制
确定特定COX-2抑制剂的筛选方法由生物测定指导，并如下所述设计为测定酶的过氧化物酶活性：
过氧化物酶测定。将寻找COX-2抑制剂的测定改进为配合高通量平台使用(Raz.)。简而言之，将过氧化物酶缓冲液(100mM TBS，5mM EDTA，1μM血红素，1mg肾上腺素，0.094％苯酚)中的重组绵羊COX-2(Cayman)与提取物(1∶500稀释)一起温育15分钟。加入Quantablu(Pierce)底物，并使之在25℃反应45分钟。之后应用Wallac Victor 2读板器读出荧光值。结果如表2所示。
表2所示为有机和水提取物对酶的抑制，该提取物源自5种植物物种，包括儿茶的树皮、两种黄芩的根和其他三种植物物种的提取物，其由结构相似的无取代B环类黄酮组成。数据显示为相对于仅单独为重组绵羊COX-2酶和底物的过氧化物酶活性百分率。有机提取物的抑制百分率范围为30％到90％。
表2.各物种对COX-2过氧化物酶活性的抑制
将对COX-1和COX-2同种型的相对抑制进行比较需要得到所有这些酶的IC50值。IC50值定义为特定抑制剂对酶活性相对于对照抑制率为50％时的浓度。在这些试验中，如表3所示，对COX-2和COX-1酶的IC50值各自在6到50μg/mL和7到80μg/mL不等。对COX-2和COX-1 IC50值的比较证明源自各种植物的有机提取物对所有这些酶都具有专一性。例如Scutellaria lateriflora的有机提取物显示其对COX-2相对COX-1的优先抑制的IC50值各自为30和80μg/mL。尽管某些提取物证实对COX-2优先抑制，而其他的并非如此。对HTP部分和纯化自该部分的化合物的检查是确定这些提取物和化合物抑制的真实专一性所必须的。
表3.有机提取物对人和绵羊COX-2和COX-1的IC50值
实施例3.COX-2和COX-1过氧化物酶活性的抑制
为了筛选抑制COX-1和COX-2活性的化合物，利用抑制两种酶的过氧化物酶的活性开展高通量的体外试验(Needleman等，(1986)AnnuRev Biochem.55：69)。简而言之，对定量的COX-1和COX-2酶滴定被测试的组合物或化合物。在测定中引入可断裂的过氧化物发色团以在花生四烯酸作为辅因子存在下可视化每种酶的过氧化物酶活性。典型地，该测定于96孔规格进行。取自100％DMSO中10mg/mL储备液的每种抑制剂一式三份在室温下采用下列浓度范围进行测定：0、0.1、1、5、10、20、50、100和500μg/mL。向每孔中加入pH7.5的100mM Tris-HCl 150μL和22μM在三羧甲基氨基甲烷缓冲液中稀释的正铁血红素10μL、在DMSO中稀释的抑制剂10μL和25单位的COX-1或COX-2酶。在转台上将各成分混合10秒，之后加入20μL 2mM的N，N，N’N’-四甲基对亚苯基二胺二盐酸盐(TMPD)和20μL的1.1mM花生四烯酸以发动反应。振摇板10秒，之后，在于570nm处读取吸收值前温育5分钟。将抑制剂浓度对百分抑制率作图并通过沿等温线取最大值中点并与浓度在x轴相交确定IC50。之后将IC50标准化至测定中酶单位的数目。表4总结该结果。
表4.纯化的无取代B环类黄酮对COX酶活性的抑制
图1、2和3分别提供分离自黄芩根的标准化的无取代B环类黄酮提取物贝加灵和贝加因的剂量反应及IC50值。图4和5分别提供分离自儿茶心材的两种标准化黄烷提取物(分别是50％及＞90％的黄烷)的剂量反应和IC50值。图6(80∶20混合)、图7(50∶50混合)及图8(20∶80混合)分别提供不同组成的三种无取代B环类黄酮和黄烷组合物的剂量反应和IC50值。
实施例4.从儿茶分离的儿茶素对5-脂氧合酶的抑制
与炎症反应相关的最重要的途径之一由非血基质、含铁的脂氧合酶(5-LO、12-LO和15-LO)产生，该酶催化分子氧加成至脂肪酸如AA上以生成过氧化物5-、12-和15-HPETE，其然后转化为白三烯。明显的迹象显示自儿茶的黄烷提取物能提供一定程度的5-LO抑制，从而阻止5-HPETE的生成。脂氧合酶抑制剂筛选测定试剂盒(Cayman Chemical，Inc.，Cat#760700)被用以评价自儿茶分离的含＞90％黄烷的提取物是否直接在体外抑制LOX。在通过微孔过滤完成由磷酸到基于三羧甲基氨基甲烷的缓冲液的缓冲液更换后，用马铃薯LOX代替源自大豆的通常用于试剂盒中的15-LO。该测定通过氧敏产色(oxygen sensing chromagen)检测过氧化氢的生成。简而言之，加入0.17单位/μL的马铃薯5-LO 90μL、1.1mM的AA 20μL、氧敏产色剂(oxygen-sensing chromagen)100μI以及10μL纯化的黄烷抑制剂至最终浓度在0到500μg/mL范围，以此一式三份进行测定。该组合物抑制5-LO的IC50经测定为1.38μg/mL/酶单位。结果如图9所示。
实施例5.分离自直萼黄芩(根)、黄芩(根)和木蝴蝶(种子)的活性提取物中无取代B环类黄酮的HPLC定量
用HPLC测定如实施例1和2所述的分离自三种不同植物物种的五种活性提取物中的无取代B环类黄酮的存在和量，结果在下表5给出。应用HPLC对无取代B环类黄酮进行定量分析，使用Luna C-18柱(250×4.5mm，5μm)，采用1％磷酸和乙腈梯度为22分钟内从80％到20％。采用UV检测器在254nm处检测无取代B环类黄酮，并通过与贝加灵、贝加因和其他无取代B环类黄酮标准品比较基于保留时间进行鉴定。
表5.活性植物提取物中的无取代B环类黄酮含量
实施例6.源自儿茶的活性提取物的HPLC定量
如实施例1和2所述的分离自儿茶的有机和水提取物中的黄烷的含量通过HPLC使用PhotoDiode阵列检测器(HPLC/PDA)以及Luna C18柱(250mm×4.6mm)进行定量。使用乙腈梯度在20分钟周期内从10％到30％ACN并继之以5分钟60％ACN将黄烷由柱中洗脱。结果如表6所示。以儿茶素和表儿茶素为标准品基于保留时间对黄烷定量。两种主要黄烷的保留时间分别为12.73分钟和15.76分钟。
表6.活性植物提取物中的无取代B环类黄酮含量
实施例7.儿茶标准化提取物的制备
儿茶(500mg研细的根)用25mL(2×25mL)以下溶剂系统提取两次。(1)100％水，(2)80∶20 水∶甲醇，(3)60∶40 水∶甲醇，(4)40∶60水∶甲醇，(5)20∶80 水∶甲醇，(6)100％甲醇，(7)80∶20 甲醇∶THF，(9)60∶40 甲醇∶THF。将源自每种提取方法的两次提取物合并、真空下浓缩并干燥。采用应用PhotoDiode阵列检测器(HPLC/PDA)以及250mm×4.6mm C18柱的HPLC对所有提取物中的化学成分进行鉴定。以儿茶素和表儿茶素作为标准品，基于保留时间和PDA数据定量该化学成分。结果如表7所示。如表7所示，以80％甲醇/水溶剂提取产生的黄烷提取物的黄烷成分浓度最高。
表7.自儿茶制备标准黄烷提取物的溶剂
采用乙醇/水和/或水性溶剂作为重结晶溶剂将儿茶素含量介于8％-15％的提取物重结晶可获得高纯度物质。重结晶前可能必须通过添加活性炭或其他脱色剂至提取物的热饱和溶液进行脱色。然后冷却热饱和溶液结晶出高纯度儿茶素。随之将晶体过滤以除去溶剂、干燥及研磨成细粉。必要时可重复进行重结晶以获得期望的纯度(60％-100％儿茶素黄烷)。
实施例8.各种黄芩物种的标准化的无取代B环类黄酮提取物的制备
将直萼黄芩(500mg研细的根)用25mL下述溶剂提取两次。(1)100％水，(2)80∶20 水∶甲醇，(3)60∶40 水∶甲醇，(4)40∶60 水∶甲醇，(5)20∶80 水∶甲醇，(6)100％甲醇，(7)80∶20 甲醇∶THF，(9)60∶40 甲醇∶THF。将提取物合并，在真空下浓缩和干燥。采用应用PhotoDiode阵列检测器(HPLC/PDA)以及250mm×4.6mm C18柱的HPLC对所有提取物中的化学成分进行鉴定。以贝加因、贝加灵、黄芩配基和沃贡宁作为标准品，基于保留时间和PDA数据定量该化学成分。结果如表8所示。
表8.自直萼黄芩中提取的无取代B环类黄酮的定量
将黄芩(1000mg研细的根)用50mL如下甲醇和水混合物提取两次：(1)100％水，(2)70∶30 水∶甲醇，(3)50∶50 水∶甲醇，(4)30∶70 水∶甲醇，(5)100％甲醇。将提取物合并，在真空下浓缩和干燥。采用应用PhotoDiode阵列检测器(HPLC/PDA)以及250mm×4.6mm C18柱的HPLC对所有提取物中的化学成分进行鉴定。以贝加因、贝加灵、黄芩配基和沃贡宁作为标准品，基于保留时间和PDA数据定量该化学成分。结果如表9所示。
表9.自黄芩中提取的无取代B环类黄酮的定量
采用乙醇/水作为重结晶溶剂将无取代B环类黄酮含量介于8％-15％的提取物重结晶可获得高纯度无取代B环类黄酮。重结晶前必须通过添加活性炭或其他脱色剂至提取物的热饱和溶液进行脱色。然后冷却热饱和溶液结晶出高纯度无取代B环类黄酮。将晶体过滤、干燥及研磨成细粉。必要时重复进行重结晶以获得期望的纯度(60％-100％无取代B环类黄酮)。
实施例9.以自黄芩根部的标准化无取代B环类黄酮提取物和自儿茶树皮的标准化黄烷提取物制备组合物
采用两种分别源自金合欢属和黄芩属的标准化提取物同一种或多种赋形剂共同制备此处谓之SoliprinTM的一种新型组合物。下面给出制备这种组合物的通用实施例。该实施例中所用的金合欢属提取物含有＞80％的总黄烷，为儿茶素和表儿茶素，黄芩属提取物含有＞80％无取代B环类黄酮，其主要为贝加灵。黄芩属提取物还包含如表11所述的其他少量无取代B环类黄酮。还向组合物中加入一种或多种赋形剂/防腐剂。黄烷和无取代B环类黄酮的比例可以基于COX-2相对5-LO的抑制有关的适应症及特定需要、透皮需要以及产品效力的需要如所需的效力持续时间加以调节。赋形剂的数量可以根据每种成分的实际活性含量加以调节。用于每个单独批次产品的混合表必须根据单独批次成分的产品规格和QC结果生成。推荐活性成分范围为2-5％的附加量用以满足产品规格的需要。
将含有无取代B环类黄酮含量为82.2％(贝加灵)的黄芩根提取物(38.5kg)(lot#RM052302-01)；总黄烷含量为80.4％的儿茶树皮提取物(6.9kg)(lot#RM052902-01)；以及赋形剂(5.0kg的Candex)加以混合以得到活性无取代B环类黄酮和黄烷重量的混合比例为85∶15的SoliprinTM组合物(50.4kg)。表10所示为该SoliprinTM特定批次的无取代B环类黄酮和黄烷的含量(Lot#G1702-COX-2)，其测定方法如实施例6和8所述。参见表10可知，该特定批次的SoliprinTM含有86％总活性成分，包括75.7％无取代B环类黄酮和10.3％黄烷。图10是典型SoliprinTM样品的HPLC色谱图，其活性无取代B环类黄酮和黄烷重量混合比例为80∶20。
表10.SoliprinTM剂型的无取代B环类黄酮和黄烷含量
采用相同方法，使用混合比例各自为12∶88和15∶85的源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化黄烷提取物的组合制备以下批次的SoliprinTM。
将含有无取代B环类黄酮含量为87.9％(贝加灵)的黄芩根提取物(58.0g)(lot#RM021203-01)以及总黄烷含量为84.9％的儿茶树皮提取物(442.0g)(lot#RM050603-01)加以混合以得到活性无取代B环类黄酮和黄烷的重量混合比例为12∶88的SoliprinTM组合物(500g，lot#QJ205-19)。采用如实施例6和8所述的方法，该特定批次SoliprinTM(Lot#QJ205-19)的无取代B环类黄酮(贝加灵)含量为9.65％和黄烷(总儿茶素及表儿茶素)的含量为73.2％。
将含有无取代B环类黄酮含量为82.9％(贝加灵)的黄芩根据取物(300g)(lot#RM060403-01)以及总黄烷含量为90.8％的儿茶树皮提取物(1700g)(lot#RM050603-01)加以混合以得到活性无取代B环类黄酮和黄烷的重量混合比例为15∶85的SoliprinTM组合物(2000g，lot#A1904)。采用如实施例6和8所述的方法，该特定批次SoliprinTM(LotA1904)的无取代B环类黄酮(贝加灵)含量为15.6％和黄烷(儿茶素及表儿茶素)的含量为75.0％。
实施例10.SoliprinTM组合物5-LO酶抑制的剂量反应和IC50值的测定
如实施例9所述(还可参考于2003年4月30日提交，名为“Formulation With Dual COX-2和5-Lipoxygenase Inhibitory Activity”的第10/427,746号美国专利申请，此处并入其全文作为参考)，使用混合比例80∶20的源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自几茶树皮的标准化黄烷提取物的组合制备SoliprinTM(80∶20)的组合物。将该样品在含有THP-1和HT-29细胞、表达COX-1、COX-2和5-LO的单核细胞细胞系的组织培养基中滴定。用于白三烯B4(LTB4；Neogen，Inc.，Cat#406110)的竞争性ELISA被用以评价SoliprinTM组合物对每个细胞系中LTB4的新合成水平的作用，并作为SoliprinTM对5-LO途径抑制作用的测定。在6孔板中每孔加入160,000到180,000细胞并由此一式二份地进行该测定。将SoliprinTM组合物以3、10、30和100μg/mL加入THP-1培养液中，并在潮湿环境中，5％CO2且37℃条件下温育整夜(～12-15小时)。结果如图11所示，其显示出将SoliprinTM以3到10μg/mL加入至THP-1培养液中几乎完全抑制了新的LPS诱导的LTB4的生成。
向HT-29细胞中以3μg/mL加入SoliprinTM和另一已知的5-LO抑制剂布洛芬并在潮湿环境中5％CO2和37℃条件下温育48小时。所有经处理的细胞系都通过离心收获(harvest)并通过生理缓冲液中的温和少量均质溶胞作用使之破裂。如图12所示，SoliprinTM抑制了HT-29细胞中80％的新合成LTB4的生成。而布洛芬在相同的时期内仅显示LTB4量的20％的减少。
实施例11.通过体内小鼠耳肿胀模型对SoliprinTM有效性的评价
如实施例9所述，使用混合比例80∶20的源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化黄烷提取物的组合制备一SoliprinTM剂型。为测定该组合物是否可用于体内治疗炎症，在以花生四烯酸(AA)处理4-5周龄ICR小鼠(Harlan Labs)耳部前一天向其经口灌服该组合物。向受试小鼠饲以悬浮于橄榄油中的SoliprinTM 50、100和200mg/kg的剂量等效量，而对照小鼠仅饲以橄榄油。之后的一天，向小鼠的一只耳朵上涂敷330mM的95％乙醇中的AA 20μL，而向另一只耳朵上涂以乙醇作为对照。如图13所示，以SoliprinTM处理的小鼠显示出循SoliprinTM剂量增加的可测量的剂量反应。参照图13可知，与“无处理”对照相比，200mg/kg的剂量减少肿胀达50％。SoliprinTM的50mg/kg剂量与另一强效抗炎药吲哚美辛的50mg/kg剂量同样有效。
在为证明SoliprinTM的抗炎活性设计的另一动物模型中，在向4-5周龄ICR小鼠(Harlan Labs)后踝关节注射95％乙醇中的100mM AA 20μL约12小时前饲以悬浮于橄榄油中的上述80∶20组合物100mg/kg。向受试组饲以SoliprinTM组合物而未向对照组饲以该组合物。对照组包括未经注射花生四烯酸的小鼠(阴性对照)和注射不含AA的95％乙醇(载体对照)的组。这些组也都未给予SoliprinTM。结果如图14所示。参照图14可见，与对照组相以及未处理的花生四烯酸注射组相比，注射AA的饲以SoliprinTM的小鼠显示出肿胀的背景水平。该结果证实了SoliprinTM对于减少关节肿胀的有效性、作用的部位。
实施例12.SoliprinTM预防和治疗皮肤暴露于UV照射引起的损伤的有效性的评价
连续三天在麻醉时以0.626mW/cm2照射六组无毛雌性小鼠(每组5只)(Strain SKH-1，Harlan Labs)3分钟以测试SoliprinTM组合物预防和治疗皮肤暴露于UV照射引起的损伤的有效性。如实施例9所述，该SoliprinTM组合由使用混合比例80∶20的源自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和源自儿茶树皮的标准化黄烷提取物的组合制备。六治疗组如下所示：
组#
小鼠经3天UV曝露和处理后，根据红斑(红色)水平对其打分，采用下列分值：0-无可见红斑；1-轻微的红斑；2-明显的红斑；3-严重的红斑；4-形成肿瘤。目视对各组红斑打分。图15显示该结果。参考图15可见，对照组(组1)在第三天(曝露于UV照射3天后72小时)出现严重的红斑。Sooth-a-caine组在3天后也出现最大的红斑(组2)。用SoliprinTM处理的组(组3-6)都未超过2分值。虽然这些分值是主观的，但其证明SoliprinTM可同时预防和治疗UV导致的皮肤红斑。
第四天典型小鼠的照片清晰显示对照组、Sooth-a-cainTM处理组和SoliprinTM处理组(数据未提供)间的差异。无论是UV曝露前还是后，相对于用SoliprinTM组合物处理的动物，对照组和Sooth-a-cainTM治疗组显示出大面积深红色的红斑。在UV照射前用5mg/mLSoliprinTM治疗的动物相对于所有其他动物显示出最少的红斑。
实施例13.将SoliprinTM组合物配制为乳膏剂
如下列程序及表11和12所述将两种不同浓度的SoliprinTM(0.5％和1.5％重量的SoliprinTM)(如实施例9描述的lot#A1904)配制为乳膏剂。
于室温将SoliprinTM(lot#A1904)溶于水中，并用搅拌器搅匀直至其完全分散于溶液中(约5分钟)。室温下及无需搅拌或搅动溶液，通过将其洒至溶液表面添加Ultrez-21卡泊姆，使其充分润湿(目视无白色区域)并沉入溶液内。之后，轻微搅拌下将溶液加热至40℃并加入甘油(A部分)。然后再搅拌该混合物5分钟。将剩余的成分(B部分)称重并在搅拌的同时加热至40℃。40℃时，将剩余的成分(B部分)加至A部分中，将所得组合物充分搅拌直至均匀(约5分钟)。冷却该乳液到30℃，并在用搅拌棒和/或刮勺边搅拌该乳液的同时滴加中和剂调节其pH值到约5.5(5.3到5.7)。由于中和剂诱导卡泊姆的构造发生变化，乳液变得非常粘稠。乳液逐渐获得乳膏剂(emulsion cream)的适宜粘度。然后将该乳膏剂混合均匀，之后倒入洁净的储存容器并于2℃到8℃贮存一个月。
表11.0.5％Soliprin乳膏剂的成分列表
表12.1.5％Soliprin乳膏剂的成分列表
实施例14.对SoliprinTM乳膏剂反复施用于人类皮肤的刺激性及所引起的接触致敏作用的评价
利用改编的Draize Patch Test(Marzulli和Maibach(1977)ContactAllergy：Predictive Testing in Humans.In Advances in Modern Toxicology，Dermatotoxicology and Pharmacology.Eds.Marzulli，F.N and Maibach，H.I.4，353-372)在人类皮肤上对SoliprinTM进行测试。试验部位位于上臂或后背的脊椎旁区域(paraspinal region)。每个测试样有一个诱导部位(induction sites)和一个激发部位(challenge sites)。诱导部位包括两个分部位：原部位(original-site)和移动部位(move-site)。对原位点反部位复施用每个贴剂含0.2ml Soliprin乳膏剂的贴剂，直到发生足够强烈的刺激反应，然后该贴剂必须对移动部位施用。由临床研究机构施加贴剂，受试者约24或48/72小时后将其移除并丢弃。在诱导期，反复将测试样施用于皮肤上的同一部位，在4周期内使用9个诱导贴剂。介于施用最后的诱导贴剂和施用激发贴剂间的休息期是10到21天。在该段时间内不对测试区域施用测试样和任何其他的物质。在激发期，将贴剂施用于身体另一侧的首次用于试验的部位并由受试者在约24或48小时后将其清除。
在100瓦白炽蓝色灯泡提供的灯光下检测每次施用贴剂的皮肤反应并根据指定的评分尺度对其评分。在强烈刺激反应而导致必须将测试样施用于移动部位的情况下，应记录所有先前暴露部位的残余分值，直到诱导末期(或若诱导结束后反应仍持续则直到消失)。记录所有皮肤反应。在激发期间，在施用贴剂后约48和72小时或96小时评价皮肤反应。关于诱导敏感性的结论主要源于激发评价。
根据上述方案，对如实施例13制备，SoliprinTM浓度为0.5％和1.5％的两种SoliprinTM乳膏剂进行评价。每组招募总共120位受试者。97位受试者完成0.5％SoliprinTM组研究以及101位受试者完成1.5％SoliprinTM组研究。0.5％SoliprinTM和1.5％SoliprinTM的乳膏剂都无明显的致敏反应。对0.5％SoliprinTM而言，在诱导期间，16位受试者显示偶尔发生轻微到轻度的红斑(+和/或1的分值)。在激发时，四位受试者在48小时显示轻微到轻度的红斑，在96小时内消失。对1.5％SoliprinTM而言，在诱导期间，26位受试者显示偶尔发生轻微到轻度的红斑(+和/或1的分值)。在激发时，1位受试者在48小时显示轻微到轻度的红斑，在96小时内消失。
该研究证明有效浓度的SoliprinTM是可局部施用于人类皮肤，而不会导致刺激或致敏作用的安全成分。
机译： 环氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）双重抑制剂的配制，用于哺乳动物的皮肤护理
机译： 环氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）双重抑制剂的配制，用于哺乳动物的皮肤护理
机译： 配制双环氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）抑制剂，用于哺乳动物的皮肤护理
