血管生长素基因重组腺相关病毒载体及制备方法和用途

摘要

本发明提供血管生长素基因重组腺相关病毒载体，是一种重组腺相关病毒，通过血管生长素基因片断的扩增；重组质粒pAAV－ANG的构建和鉴定；腺相关病毒载体rAAV－ANG的收集、纯化、鉴定和滴度测定。制备过程中所涉及的质粒等均为药理学可接受材料，安全无毒；避免了病毒带来的免疫反应等副作用。可在制备治疗缺血性心脏病和外周组织缺血性疾病药物中应用。可用于体外培养细胞和整体实验动物或者患者，应用范围广，感染效率高；使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达。本发明制备所需设备要求不高，腺相关病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和用药过程中与很多传统药物条件相似，适合推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因药物，具体涉及血管生长素(angiogenin，ANG)基因重组腺相关病毒载体(rAAV-ANG)。它可应用于缺血性心脏病包括心绞痛、急性心肌梗死、缺血性心肌病和外周缺血性疾病等的基因治疗及相关研究。本发明还提供了这种重组腺相关病毒载体的制备方法。

背景技术

随着人类基因组计划的开展和分子生物学研究的逐步深入、众多疾病的分子机制的阐明和致病基因不断发现，基因治疗已经从单基因遗传性疾病的治疗发展到多基因常见多发病的治疗，尤其在心脑血管疾病及各种肿瘤的治疗中展现出良好应用前景。基因治疗中的三个关键问题为：1、人类疾病病因和致病机理的进一步明确，尤其是从分子机制角度来研究并提出有效的基因治疗方案。2、基因治疗及相应的治疗策略的优化和合理配伍，以提高整体上对疾病的治疗效果。3、安全、高效、稳定的基因表达系统即理想的载体的构建和应用。因此，选择合适的目的基因、合适的载体以及合适的治疗策略是基因治疗研究中的热点和难点。

缺血性心脏病的主要病理生理机制是心肌血液和氧气的供需失衡，血液供应不能满足心肌细胞的需要，导致心肌细胞功能异常甚至坏死，进而出现心室重构，最终导致整体心脏功能异常。心肌梗死患者出现心功能不全的主要机制包含两个方面：坏死区心肌失去收缩、舒张功能和非坏死区的心肌重构。而且，肥厚心肌毛细血管密度降低进一步减少了氧气供应，耗氧量增加的情况下相对的心肌缺血，这导致进行性的心肌坏死或者冬眠，梗死区延展，心脏扩大，纤维沉积。因此，改善心肌血液供应，改善心室重塑，对缺血性心脏病患者的预后有很大意义。

血管生成是一个复杂的过程，涉及多个促血管生长因子和抗血管生长因子的协调配合。其中血管生长素参与血管生长多个步骤的调节，是其它促血管生长因子发挥作用的必要途径。

基因治疗是将基因转移到体细胞以治疗和预防疾病发展的治疗方法。基因治疗的策略主要有以下几种：①基因替换：用正常功能基因替代原有突变的异常基因；②基因纠正：用外源正常基因改变基因突变的缺失部分，并保持基因的正常功能；③基因增强：导入外源正常基因，调节原有基因表达水平的不足；④基因抑制：转入反义核酸，抑制目的基因的表达。

成功的基因治疗需要安全高效、稳定、持久表达的转基因载体。非病毒载体具有安全性高、容量大和易制备等优点，可能具有较好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科依赖病毒属，是一种对人和动物不致病的单链脱氧核糖核酸病毒。将腺相关病毒自身的编码基因去除，仅保留基因组两末端的反向末端重复序列(ITR)，使其能装载治疗基因及表达元件而产生重组腺相关病毒(rAAV)。腺相关病毒可感染多种组织细胞，能稳定、持久地表达外源基因。腺相关病毒载体理化性质稳定，是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。传统制备重组腺相关病毒是采用腺病毒辅助的转染方法，然而腺病毒污染的问题是其应用的障碍。寻找新的、更安全的制备方法可以使腺相关病毒载体进一步推广应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供血管生长素基因重组腺相关病毒载体(rAAV-ANG)，是一种重组腺相关病毒，转染细胞或者组织后能够表达出血管生长素蛋白，具有SEQ NO 1的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供血管生长素基因重组腺相关病毒载体的制备方法，主要通过以下步骤实现：

(1)血管生长素基因片断的扩增；

(2)重组质粒pAAV-ANG的构建和鉴定；

(3)腺相关病毒载体rAAV-ANG的包装(生产)；

(4)腺相关病毒载体rAAV-ANG的收集、纯化、鉴定和滴度测定。

步骤(1)中所说的血管生长素基因扩增，主要是通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，以pAngC基因(购自The American Type CultureCollection，No：65422)为模板，用逆转录酶将其反转录为环脱氧核糖核酸。设计带有限制性内切酶EcoRI(5’端)和BamHI(3’端)酶切位点的聚合酶链反应引物，5’端引物序列为：5’-GgaattcCCACCATGGGACAGGATAACTCCAGGTAC-3’，3’端引物序列为：5’-CGggatccTTACGGACGACGGAAAATTG-3’(小写字母为酶切位点)。以下述条件进行聚合酶链反应反应：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸10分钟，共30个循环。

步骤(2)中，本发明采用质粒辅助腺相关病毒重组系统，主要包括：腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS、携带腺相关病毒rep-cap基因的质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper。将步骤(1)的血管生长素基因聚合酶链反应产物(398bp)、pAAV-MCS质粒分别经内切酶EcoRI和BamHI双酶切后，经连接酶4℃连接过夜；连接产物转化进入感受态菌，用含氨苄青霉素的固态培养基筛选；挑取单克隆，抽提质粒pAAV-ANG，酶切和测序鉴定插入方向和序列的正确性。

步骤(3)是本发明的基因药物包装(制备)流程的主要部分。以缓冲液(pH7.5)溶解质粒pAAV-ANG、pAAV-RC和pHelper，然后各吸取10μg，用磷酸钙共沉淀法转染工程细胞(293细胞)，同时设立重组病毒的阳性对照、阴性对照以及空白对照。293细胞用含10％胎牛血清的培养基在37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养，转染6小时后换新鲜培养液，继续培养66～72小时，期间观察培养基颜色变化和293细胞病变情况。若用于包装(制备)rAAV-ANG和阳性对照的293细胞48小时内出现细胞变圆、脱壁等细胞病变，并且培养基逐渐变为橙黄色，同时阴性对照、空白对照的293细胞和培养基没有明显变化，说明有重组病毒产生。

步骤(4)是本基因药物的收集、优化部分，收集步骤(3)的细胞，反复冻融4次，离心，即可获得重组腺相关病毒；但是若要提高本发明基因药物的纯度和滴度，可以作进一步的纯化；然后以聚合酶链反应法作rAAV-ANG的鉴定和滴度测定：取部分纯化后的病毒液进行10倍稀释，脱氧核糖核酸酶37℃30分钟灭活病毒外基因组脱氧核糖核酸，56℃ 15分钟后，加等体积2×蛋白酶K，37℃反应1小时，酚氯仿抽提后溶于10μl纯水中；然后以此为模板作聚合酶链反应进行鉴定和滴度测定。

本发明的第三个目的是提供血管生长素基因重组腺相关病毒载体在制备治疗缺血性心脏病药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供血管生长素基因重组腺相关病毒载体在制备治疗外周组织缺血性疾病药物中的应用。

本发明的第五个目的是提供血管生长素基因重组腺相关病毒载体在制备有效上调心肌血管生长素蛋白表达，提高组织血管生长素水平，促进新生血管生成，改善组织供血，减轻心室重构，改善心功能药物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所用载体-腺相关病毒是一种安全的病毒，大多数人曾受到过其感染，但从未发现它能引起任何疾病；由于在构建载体时去掉了腺相关病毒本身的基因，就避免了病毒带来的免疫反应等副作用。制备(包装)过程中所涉及的质粒等均为药理学可接受材料，安全无毒；

(2)本发明能够感染多种类型的细胞以及分化和不分化细胞，可以应用于体外的培养细胞，也可以用于整体实验动物或者患者，应用范围广，感染效率高；

(3)本发明给药途径可以直接注射给药，可以经静脉给药，也可以经冠状动脉给药；可以使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达；

(4)本发明可应用于缺血性心脏病和外周组织缺血性疾病的研究和基因治疗，也可用于血管生长机制方面相关研究，适应症广泛；

(5)本发明转染心肌组织后，可以有效上调心肌血管生长素蛋白表达，提高组织血管生长素水平，促进新生血管生成，改善组织供血，减轻心室重构，改善心功能。同时不诱发心肌组织的病理改变和功能异常；

(6)本发明制备方法所需设备要求不高，腺相关病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和用药过程中与很多传统药物条件相似，适合推广应用。

附图说明

图1：血管生长素重组质粒(pAAV-ANG)琼脂糖凝胶电泳鉴定图。

图2：重组病毒rAAV-ANG上调正常大鼠和心肌梗死大鼠心肌组织血管生长素蛋白表达。

图3：重组病毒rAAV-ANG促进心肌组织毛细血管生成。

具体实施方式

实施例1：本发明rAAV-ANG的制备(包装)：

根据ANG基因序列和质粒pAAV-MCS结构，设计带有限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切位点的血管生长素基因引物，经过聚合酶链反应扩增血管生长素环脱氧核糖核酸片断(398bp)，连接到质粒pAAV-MCS中，构建质粒pAAV-ANG，酶切和测序鉴定插入方向和序列正确(参见图1)。吸取质粒pAAV-ANG、pAAV-RC和pHelper各10μg，用磷酸钙共沉淀法转染293细胞构建重组血管生长素基因腺相关病毒载体(rAAV-ANG)；同时设立阳性对照，即pAAV-LacZ、pAAV-RC和pHelper各10μg共转染293细胞构建重组报告基因LacZ病毒载体(rAAV-LacZ)。收获和纯化重组病毒，测定滴度。

实施例2：重组病毒rAAV-ANG用于正常大鼠心肌组织毛细血管密度、左室重构和心功能的研究：

大鼠以水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位，气管切开，连接动物呼吸机，打开胸腔，暴露心脏。吸取rAAV-ANG 120μL(约1.2×10⁹IU)于左室前壁四个点注射，每个部位30μL。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后，清洁级环境普通饲料饲养四周。结果显示：rAAV-ANG高效转染正常大鼠心肌组织，显著上调正常大鼠心肌组织血管生长素蛋白表达(参见图2)，增加心肌组织内毛细血管密度(参见图3)。但不影响心室重量和心肌细胞直径，不诱发心肌纤维化和炎症反应，观察四周，大鼠死亡率与对照组相比无差异。

实施例3：重组病毒rAAV-ANG用于心肌梗死大鼠基因治疗的研究：

大鼠以水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位，气管切开，连接动物呼吸机，打开胸腔，暴露心脏。打开心包壁层，将心脏快速挤出胸腔，在左心耳和右室流出道之间以8-0丝线结扎左冠状动脉前降支，造成急性心肌梗死。然后迅速将心脏放回胸腔。吸取rAAV-ANG 120μL(约1.2×10⁹IU)于左室前壁梗死区边缘分四个点行心肌内注射，每个部位30μL。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后，清洁级环境普通饲料饲养。四周后检测大鼠心肌组织血管生长素蛋白表达，检测非梗死区毛细血管密度和左室重构的指标包括心室重量与体重的比值、心肌细胞直经和心肌纤维化程度。并以超声心动图和有创血流动力学方法检测左室功能。结果显示：rAAV-ANG转染显著上调心肌梗死大鼠心肌组织血管生长素蛋白表达水平(参见图2)，增加非梗死区毛细血管密度(参见图3)，抑制左室重构，部分预防了心功能不全的发生。结果参见表1，表2。

表1.rAAV-ANG治疗后大鼠心功能的变化

  Group  n  LVSP(mmHg)  LVEDP  (mmHg)  +dp/dt_max  (mmHg.s^-1)  -dp/dt_max  (mmHg.s^-1)  LVEF(％)  Normal  10  134.38±12.81  3.11±2.83  7123±448  6497±885  67.7±7.8  Normal-rAAV-ANG  Sham-operation  MI-saline  MI-rAAV-lacZ  MI-rAAV-ANG  10  10  10  9  10  130.30±13.35  130.54±17.93  101.71±11.03^*▲    102.89±9.67^*▲    115.98±17.23^*▲#  4.18±2.16  4.92±2.16  14.50±4.73^*▲    15.27±3.49^*▲    8.36±2.98^*▲#  7370±525  7046±805  4585±866^*▲    4262±473^*▲    5333±729^*▲#  6401±706  6079±745  4012±893^*▲    3623±917^*▲    4977±1036^*▲#  70.1±5.6  70.0±6.0  47.3±8.7^*▲    46.6±7.9^*▲    55.1±11.1^*▲#

注：数据以均数±标准差表示。LVSP：左室收缩峰压；LVEDP：左室舒张末压；+dp/dt_max：左室压力最大上升速度；-dp/dt_max：左室压力最大下降速度；LVEF：左室射血分数。LVSP、LVEDP和±dp/dt_max：以有创血流动力学方法检测，LVEF以超声心动图方法检测。Normal group：正常组；Sham-opertion group：假手术组；MI-saline group：心肌梗死注射盐水组

^*P＜0.05 vs.Normal group.^▲P＜0.05 vs.Sham-operation group.^#P＜0.05 vs.MI-saline group.

表2.rAAV-ANG治疗四周后左室重构指标的变化

  Group  n  Body weight  (g)  Ventricular weight  (mg)  Ventricular  weight/body  weight ratio  Myocyte diarmeter  (μm)  Fibrosis  infiltration  (％)  Normal  Normal-rAAV-ANG  Sham-operation  MI-saline  MI-rAAV-1acZ  MI-rAAV-ANG  10  10  10  10  9  10  299±25.2  295±18.8  292±15.5  292±21.5  293±19.4  293±22.7  1112±92.6  1114±115.9  1135±131.4  1311±100.1^*▲    1297±123.3^*▲    1157±142.6^#  3.72±0.21  3.77±0.28  3.88±0.28  4.50±0.35^*▲    4.46±0.36^*▲    3.95±0.40^#  15.40±2.10  16.05±2.50  15.52±2.42  19.84±3.95^*▲    20.02±2.44^*▲    16.99±2.80^#  3.89±1.89  3.92±1.48  4.44±1.66  7.51±1.77^*▲    8.15±1.81^*▲    4.92±2.11^#

注：数据以均数±标准差表示。Ventricular weight/body weight ratio：心室重量与体重比值；Myocyte diameter：心肌细胞直经；Fibrosisinfiltration：心肌间质纤维沉积百分比；Normal group：正常组；Sham-operation group：假手术组；MI-saline group：心肌梗死注射盐水组^*P＜0.05 vs.Normal group.^▲P＜0.05 vs.Sham-operation group.^#P＜0.05 vs.MI-saline group.

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>血管生长素基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和用途

<160>3

<210>1

<211>398

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(19)...(387)

<400>1

  1ggaattccca ccatgggaca ggataactcc aggatcacac acttcctgac ccagcactat

 61gatgccaaac cacagggccg ggatgacaga tactgtgaaa gcatcatgag gagacggggc

121ctgacctcac cctgcaaaga catcaacaca tttattcatg gcaacaagcg cagcatcaag

181gccatctgtg aaaacaagaa tggaaaccct cacagagaaa acctaagaat aagcaagtct

241tctttccagg tcaccacttg caagctacat ggaggttccc cctggcctcc atgccagtac

301cgagccacag cggggttcag aaacgttgtt gttgcttgtg aaaatggctt acctgtccac

361ttggatcagt caattttccg tcgtccgtaa ggatcccg

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>用于PCR反应的上游引物

<400>2

1ggaattccca ccatgggaca ggataactcc aggtac

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于PCR反应的下游引物

<400>3

1cgggatcctt acggacgacg gaaaattg