纤溶酶原激活剂的仿生亲和纯化方法

摘要

一种纤溶酶原激活剂的仿生亲和纯化方法，属于生物技术领域。本发明包括以下步骤：(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，与对氨基苯甲脒反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用上述合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将含天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂的样品流过该亲和层析柱，天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，然后变换缓冲液条件，再冲洗亲和层析柱，将结合的天然或改构人组织型纤溶酶原激活剂洗脱下来，得到纯化的天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂。本发明纯化步骤少，成本低，效率高，快速、简便、低成本、大批量纯化天然或改构人组织型纤溶酶原激活剂和尿型纤溶酶原激活剂。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体地说，是一种纤溶酶原激活剂的仿生亲和纯化方法。

背景技术

组织型纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，与纤维蛋白具有很高的亲和性，在循环系统中与纤维蛋白结合后表现出活性，可激活纤溶酶原成为纤溶酶，溶解血栓。组织型纤溶酶原激活剂有天然形式，也有人工设计的部分结构域缺失的形式，如缺失纤维蛋白指环区、表皮生长因子(E)区和/或Kringle-1区的改构形式，以延长体内半衰期，加快扩散入和溶解血液凝块的速度。组织型纤溶酶原激活剂是高效溶血栓药物，是美国市场上六大类基因重组药物之一。纤溶酶原激活剂常用的纯化方法有离子交换层析，疏水层析，反相层析，以及金属螯合，赖氨酸，苯脒等亲和层析的方法。对于纤溶酶原激活剂纯化来讲，这些方法，专一性差，生产中需要多种方法组合，因此生产步骤多，生产成本高；利用天然大分子配体如蛋白酶抑制剂、抗体和凝集素的亲和层析方法虽然克服了对纤溶酶原激活剂专一性差和效率低的缺点，但这些生物配体本身制备困难，成本昂贵、性质不稳定，不适合大规模生产用。

经对现有技术文献的检索发现，Patel A在《层析期刊》上发表的《用过渡态类似物亲和纯化组织型纤溶酶原激活剂》(Affinity purification of tissueplasminogen activator using transition-state analogues J.Chromatogr.1990，510：83-93.)。该论文通过在琼脂糖上固相合成含精氨酸的三肽，用尿激酶和组织型纤溶酶原激活剂，发现D-Phe-D-Phe-Argal能够有效纯化组织型纤溶酶原激活剂。但该方法利用的D-Phe-D-Phe-Argal物质需用固相多肽合成的方法合成，制备步骤繁琐，成本高；此外D-Phe-D-Phe-Argal含多个多肽连接，性质不稳定，不能耐受在线清洗的苛刻条件。虽然可以使复杂的纯化工艺简化，但是以上缺点限制了大规模应用。因此，有必要开发高效率、低成本、步骤简便的大规模生产天然或改构人组织型纤溶酶原激活剂的方法和材料，促进产业化步伐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种纤溶酶原激活剂的仿生亲和纯化方法，使其纯化步骤少，成本低，效率高，快速、简便、低成本、大批量纯化天然或改构人组织型纤溶酶原激活剂和尿型纤溶酶原激活剂。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以基础层析介质为原料合成仿生亲和分离材料，用制备的仿生亲和分离材料纯化天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂及片段。

所述的改构的人组织型纤溶酶原激活剂，是指通过人工设计，保留催化结构域、而纤维蛋白指环区、表皮生长因子(E)区和/或Kringle-1区部分或全部缺失的组织型纤溶酶原激活剂形式。

本发明包括以下步骤：

(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，与对氨基苯甲脒反应，合成仿生亲和分离材料；

所述的步骤(1)，是指以带氨基的基础层析介质，与三氯三氮嗪反应活化；或者用常规化学方法对不带氨基的基础层析介质进行活化，与氨水或氨基化合物反应生成氨基后，再与三氯三氮嗪反应活化；

所述的不带氨基的基础层析介质包括：葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶、多孔玻璃与陶瓷。

所述的常规化学方法指C.R.Lowe在《亲和色谱导论》(洛(C.R.Lowe)著；刘毓秀译.科学出版社，1983年5月第1版，第61-84页)中提到的基质活化与功能化方法，如多糖基及含羟基的其它基质，可用卤化氰、三嗪(均二氯三嗪或三氯三嗪)、高碘酸氧化，环氧乙烷(1，4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚)，环氧氯丙醇，环氧溴丙醇，双氮丙啶，二乙烯砜，苯醌类化合物如醌，溴乙酰溴进行活化和功能化；聚丙烯酰胺基质可用无水乙二胺，酰肼化后水解，直接碱水解进行活化和功能化；硅胶、多孔玻璃与陶瓷可用硅烷化试剂进行活化和功能化；从而在基础层析介质上介绍需要的基团。

所述的仿生亲和分离材料含有两个4-氨基苯甲脒的结构。

(2)用上述合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将含天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂的样品流过该亲和层析柱，天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，再冲洗亲和层析柱，将结合的天然或改构人组织型纤溶酶原激活剂洗脱下来，得到纯化的天然或改构的人组织型纤溶酶原激活剂。

所述的步骤(2)中，亲和分离材料吸附纤溶酶原激活剂的条件为pH5-8，离子强度为0.05-0.2M的缓冲液；洗脱条件为pH1.0-12，离子强度为0.05-0.5M的缓冲液。

本发明既克服了亲和分离材料合成步骤多，操作复杂，成本高，性质不稳定，的缺点，又减少了纤溶酶原激活剂大规模纯化的步骤，降低了生产成本，可快速、简便、低成本、大批量纯化纤溶酶原激活剂。样品比活力提高5倍以上，回收率80％以上。

具体实施方式

实施例1

一、制备分离材料

取NH₂-Sepharose(250ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用去离子水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入200ml去离子水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO₃使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。

取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，称取氨基苯甲脒(20g)用去离子水(150ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，然后升温至95℃中搅拌再反应24小时。反应结束后，取出反应物，然后用12倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇储存待用。

二、用亲和纯化改构人组织型纤溶酶原激活剂(N-PA)

将1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)中的0.3g改构组织型纤溶酶原激活剂酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)洗去未吸附的物质后，用50ml 50mM醋酸铵缓冲液(pH5.0)洗结合的杂蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸铵缓冲液(pH3.4)进行洗脱，再用50ml 0.1M醋酸溶液洗脱，分步收集洗脱组分。用lowery法测定蛋白浓度，发色底物测定组织型纤溶酶原激活剂酶的活力，样品比活力提高10倍，回收率100％。12％还原SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分析纯度，不含高分子量的杂蛋白。

实施例2

一、制备分离材料

取NH₂-Sepharose(250ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用去离子水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入200ml去离子水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO₃使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。

取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，称取氨基苯甲脒(20g)用去离子水(150ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，然后升温至95℃中搅拌再反应24小时。反应结束后，取出反应物，然后用12倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇储存待用。

二、亲和纯化组织型纤溶酶原激活剂酶

将1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)中的0.25克组织型纤溶酶原激活剂酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)洗去未吸附的物质后，用50ml 50mM醋酸铵缓冲液(pH5.0)洗结合的杂蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸铵缓冲液(pH2.0)进行洗脱，分步收集洗脱组分。用lowery法测定蛋白浓度，发色底物测定组织型纤溶酶原激活剂酶的活力，样品比活力提高5倍，回收率大于70％。

实施例3

一、制备分离材料

取NH₂-Sepharose(250ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用去离子水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入200ml去离子水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO₃使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。

取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，称取氨基苯甲脒(20g)用去离子水(150ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，然后升温至95℃中搅拌再反应24小时。反应结束后，取出反应物，然后用12倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇储存待用。

二、亲和纯化组织型纤溶酶原激活剂酶

将1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)中的0.2g组织型纤溶酶原激活剂酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)洗去未吸附的物质后，用50ml 50mM醋酸铵缓冲液(pH5.0)洗结合的杂蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸铵缓冲液(pH2.4)进行洗脱，分步收集洗脱组分。用lowery法测定蛋白浓度，发色底物测定组织型纤溶酶原激活剂酶的活力，样品比活力提高7倍，回收率大于80％。

实施例4

一、制备分离材料

取NH₂-Sepharose(250ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用去离子水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入200ml去离子水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO₃使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。

取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，称取氨基苯甲脒(20g)用去离子水(150ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，然后升温至95℃中搅拌再反应24小时。反应结束后，取出反应物，然后用12倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇储存待用。

二、亲和纯化尿纤溶酶原激活剂(尿激酶)

将1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)中的尿激酶25,0000活力单位(约60mg)的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)洗去未吸附的物质后，用50ml 50mM醋酸铵缓冲液(pH5.0)洗结合的杂蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸铵缓冲液(pH3.4)洗脱尿激酶，分步收集洗脱组分。用lowery法测定蛋白浓度，发色底物测定尿激酶活力，样品比活力提高7倍，回收率大于80％。电泳分析表明纯化出了低分子量尿激酶(33KD)。尿激酶样品比活力提高43倍，总活力回收率100％。

实施例5

-、制备分离材料

取NH₂-Sepharose(250ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用去离子水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入200ml去离子水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO₃使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。

取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，称取氨基苯甲脒(20g)用去离子水(150ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，然后升温至95℃中搅拌再反应24小时。反应结束后，取出反应物，然后用12倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇储存待用。

二、亲和纯化组织型纤溶酶原激活剂酶

将1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)中的0.3g改构组织型纤溶酶原激活剂酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)洗去未吸附的物质后，用50ml 50mM醋酸铵缓冲液(pH5.0)洗结合的杂蛋白，之后用50ml 0.5M甘氨酸-盐酸(pH1.0)进行洗脱，分步收集洗脱组分。用lowery法测定蛋白浓度，发色底物测定组织型纤溶酶原激活剂酶的活力，样品比活力提高7.5倍，回收率80％。

实施例6

一、制备分离材料

取NH₂-Sepharose(250ml)，用5倍体积的1M的NaCl洗涤，再用去离子水充分洗涤后，抽去水分，倒入反应器皿中，加入200ml去离子水，放于冰盐浴中预冷。待温度降至5℃，开始搅拌。用预冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反应容器中。用饱和NaHCO₃使溶液的pH保持在6～7之间，5℃下反应3h，取出，3×10倍体积的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗涤，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。

取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，称取氨基苯甲脒(20g)用去离子水(150ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，置于温度50℃中搅拌反应24小时，然后升温至95℃中搅拌再反应24小时。反应结束后，取出反应物，然后用12倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇储存待用。

二、亲和纯化组织型纤溶酶原激活剂酶

将1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(5ml)，装入层析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)中的0.3g改构组织型纤溶酶原激活剂酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)洗去未吸附的物质后，用50ml 0.05M甘氨酸-氢氧化钠(pH12.0)进行洗脱，分步收集洗脱组分。用lowery法测定蛋白浓度，发色底物测定组织型纤溶酶原激活剂酶的活力，样品比活力提高8.5倍，回收率85％。