无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂及其制备方法和用途，该制备方法包括如下步骤：a：无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备；b：以无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质的弱阳离子交换树脂的制备；本发明改进并发展前人的合成方法，建立了一条从分散聚合制备小颗粒种子到“一步种子溶胀聚合法”制备无孔单分散亲水性的交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的新方法，并进一步以该微球为基质采用新的化学改性方法制备弱阳离子交换树脂。该树脂易再生、耐强酸强碱、机械强度高、分离速度快，蛋白质量和活性回收率高，可广泛用基因工程产品及蛋白质的快速分离纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂及其制备方法和用途。

背景技术

无孔高聚物类型的高效液相色谱(HPLC)固定相，自八十年代后期出现以来已得到迅速发展。与多孔填料相比，其最主要的特点是，消除了停滞流动相传质带来的峰加宽，提高了柱效及分离效果，同时由于被分离的生物大分子不会进入颗粒内部，只在表面进行传质交换，故可用于蛋白质和多肽等生物大分子的快速分离分析。

目前，国内外制备无孔交联单分散微球的方法仍然沿用Ugeltad et al，Jpolym Sci Polym Symp，1985(72)225发明的“二步种子溶胀聚合”的方法。该方法一般是以无乳聚合法制备的1μm左右粒度均匀的线性聚苯乙烯(PS)胶乳为种子，首先用不溶于水的有机化合物活化，然后再用由单体、交联剂和稀释剂等组成的乳液进行第二步溶胀并聚合。总之，该方法制备过程较繁琐、合成条件苛刻，由于种球至少需要两步溶胀，致使最终微球的粒径控制困难。按照“两步种子溶胀聚合法”合成的无孔单分散聚合物微球主要有交联聚苯乙烯和羟乙基丙烯酸甲酯等。苏天升(中国发明专利，CN 1132213A和CN1257891A)采用“一步种子溶胀聚合法”制备了单分散大孔交联聚苯乙烯微球和单分散大孔与无孔交联聚乙烯吡啶微球，但交联聚苯乙烯和交联聚乙烯吡啶表面呈现强的疏水性，会对生物大分子产生不可逆吸附，作为固定相只可应用于反相色谱和以有机溶剂为流动相的尺寸排阻色谱中，若用于以盐水为流动相的离子交换色谱分离生物大分子，其化学改性相当困难。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，建立了一条从分散聚合制备小颗粒种子到“一步种子溶胀聚合法”制备无孔单分散亲水性的交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的新方法，并进一步以该微球为基质采用新的化学改性方法制备无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂及其制备方法和用途。

为了实现发明目的，本发明通过如下方式实现：

一种无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂：

其结构式为：

其中P的结构为：

所述无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂的制备方法，其特征是：该制备方法包括如下步骤：

a：无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备；

b：以无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质的弱阳离子交换树脂的制备；

所述无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备方法是按下列顺序进行：

a：单分散线性低分子量0.6-3.0μm聚苯乙烯种子的制备：

在100mL圆底烧瓶中加入10-20mL单体苯乙烯(St)，0.2-0.4g引发剂偶氮二异丁晴(AIBN)，0.5-1.5g稳定剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和80-100mL无水乙醇，超声溶解，通氮气除氧，于70℃恒温水浴中搅拌加热，反应24小时，除去溶剂，用无水乙醇洗涤数次，用0.2％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液转移至锥形瓶中备用，取少量在显微镜下观察其形态及大小，该产物即为粒径0.6-3.0μm单分散聚苯乙烯微球；

b：用“一步种子溶胀聚合法”制备3.0-7.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球：

在250mL烧杯中准确移入3.5-6.0mL甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)，3.5-6.0mL乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，0.18-0.27g过氧化苯甲酰(BPO)，待过氧化苯甲酰(BPO)溶解后加入60-90mL 0.2％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液和20-30mL 5％聚乙烯醇(PVA)溶液，超声乳化30分钟(要使有机相完全乳化，上层无油滴)，将乳液缓慢加入到1.0g单分散聚苯乙烯种子(粒径0.6-3μm)溶液中，控制温度为30℃，搅拌速度为120rpm溶胀12小时，用显微镜观察有机单体是否被种子吸收完全，通氮气20分钟，在搅拌速度为120rpm的条件下70℃恒温加热搅拌聚合24小时，产物用玻砂漏斗抽滤，大量热蒸馏水洗涤，再用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空烘干4h，即可得到粒度均匀呈单分散、其分散系数在1-2％的3.0-7.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

所述以无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质的弱阳离子交换色谱固定相的制备方法是按下列顺序进行：

将4.0g上步合成的3.0-7.0μm无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入到0.1mol/L稀硫酸中，60℃水浴加热搅拌反应，反应产物先用水洗三遍，浸泡于蒸馏水中过夜，再用水洗涤，真空干燥，即得水解的微球，水解的无孔树脂悬浮于由20-40mL二甲亚砜和NaOH(9∶1)组成的混合溶液中，室温搅拌后加入环氧氯丙烷，水浴加热搅拌反应，即得环氧化的微球；将环氧化的微球再用稀酸进一步水解后，用大量水、丙酮洗涤，真空干燥，将干燥的微球加入到3-5g无水丁二酸酐溶解于30-50mL吡啶溶液中，超声分散后，恒温搅拌加热反应，产物用玻砂漏斗抽滤，再用水、0.1mol/L盐酸、水和丙酮反复洗涤，真空干燥，即可制得新型的3.0-7.0μm无孔弱阳离子交换色谱固定相；

所述的无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂作为蛋白、酶和生物工程产品的分离纯化中的应用。

本发明合成无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂所用的原料为：甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、苯乙烯(St)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、过氧化苯甲酰(BPO)、偶氮二异丁晴(AIBN)、十二烷基磺酸钠(SDS)、聚乙烯醇(PVA)和无水丁二酸酐；本发明其单体为St、引发剂为AIBN、稳定剂为PVP，反应介质为乙醇组成的混合物；本发明采用分散聚合法制备单分散线性种子。在分散聚合法中，单体、引发剂、稳定剂以及根据所加入的少量共稳定剂，在醇类反应介质中均可溶解，体系呈现为均相状态。当聚合反应所产生低聚体的分子量达到一定限度时，就聚集成为一种不再溶于介质中的聚合体而与介质产生了相分离，反应体系就变成一种聚合体微粒悬浮在介质中的非均相状态。聚合体微粒继续吸收溶在介质中的单体并继续聚合，使其微粒体积不断增大，直到单体被消耗完。

本发明所介绍的制备方法步骤简单、操作方便、容易控制、容易放大设备，制备不需要特殊复杂的设备就可以获得所需要的产品。

本发明改进并发展前人的合成方法，建立了一条从分散聚合制备小颗粒种子到“一步种子溶胀聚合法”制备无孔单分散亲水性的交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的新方法，并进一步以该微球为基质采用新的化学改性方法制备弱阳离子交换树脂(Weak cation exchange resin)。该树脂易再生、耐强酸强碱、机械强度高、分离速度快，蛋白质量和活性回收率高，可广泛用基因工程产品及蛋白质的快速分离纯化。

本发明有如下效果：

1)性能好、用途广泛：本发明制备的树脂填料机械性能好，耐压＞40Mpa，可用于高效液相色谱和毛细管电色谱，大大提高了分离和分析速度，蛋白质活性回收率高，在室温下，溶菌酶的活性回收率＞96％。肌红蛋白、核糖核酸、a-糜蛋白酶原-A、细胞色素-C和溶菌酶的质量回收率＞95％。分离重现性好、速度快，可广泛应用于蛋白、酶和生物工程产品的分离纯化。

2)树脂填料使用寿命长，在pH＝1-12情况下使用1000小时，经清洗后，分离性能未见改变。

3)耐强酸强碱.该树脂填料分别用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠浸泡一天一夜后，用大量蒸馏水洗涤中性后，用于分离标准蛋白，其分离性能未见改变。

4)树脂填料很容易再生，只要用10倍体积的稀酸或1mol/L氯化钠洗涤剂可再生使用，不象一些商品柱要在每次进样后用氢氧化钠再生。

5)生物工程产品的脲提取液可以直接上样，一步分离达到了较高纯度。

附图说明

图1为蛋白质和酶在本发明实施例一制备的无孔单分散弱阳离子交换树脂上的分离图；

图2为蛋白质和酶在本发明实施例二制备的无孔单分散弱阳离子交换树脂上的分离图；

图3为蛋白质和酶在本发明实施例三制备的无孔单分散弱阳离子交换树脂上的分离图；

图4基因工程产品重组人干扰素-γ的8mol/L脲提取液分离图。

具体实施方式

实施例一：7.0μm无孔单分散弱阳离子交换树脂的制备方法是按如下顺序进行：

1)3.0μm单分散线性低分子聚苯乙烯种子的制备：

在100mL圆底烧瓶中加入20mL St，0.4g AIBN，1.0g PVP和80mL无水乙醇，超声溶解，通氮气除氧，于70℃恒温水浴中搅拌加热，反应24小时。除去溶剂，用无水乙醇洗涤数次，用0.2％SDS溶液转移至锥形瓶中备用，取少量在显微镜下观察其形态及大小，该产物即为粒度3.0μm单分散聚苯乙烯微球。

2)7.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：

在250mL烧杯中准确移入6mL GMA，6mL EDMA，0.27g BPO，待BPO溶解后，加入90mL 0.2％SDS溶液和30mL 5％PVA溶液，超声乳化30分钟(要使有机相完全乳化，上层无油滴)，将乳液缓慢加入到1.0g单分散聚苯乙烯种子(3.0μm)溶液中，控制温度为30℃，搅拌速度为120rpm溶胀12小时，用显微镜观察有机单体是否被种子吸收完全。通氮气20分钟，在搅拌速度为120rpm的条件下70℃恒温加热搅拌聚合24小时。产物用玻砂漏斗抽滤，大量热蒸馏水洗涤，再用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空烘干4h。即可得到7.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

3)7.0μm无孔单分散弱阳离子交换树脂的制备：

将4.0g上步合成的7.0μm无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入到0.1mol/L稀硫酸中，60℃水浴加热搅拌反应。反应产物先用水洗三遍，浸泡于蒸馏水中过夜，再用水洗涤，真空干燥，即得水解的微球。水解的无孔树脂悬浮于由20mL二甲亚砜和NaOH(9∶1)组成的混合溶液中，室温搅拌后加入环氧氯丙烷，水浴加热搅拌反应，即得环氧化的微球；将环氧化的微球再用稀酸进一步水解后，用大量水、丙酮洗涤，真空干燥。将干燥的微球加入到3g无水丁二酸酐溶解于30mL吡啶溶液中，超声分散后，恒温搅拌加热反应。产物用玻砂漏斗抽滤，再用水、0.1mol/L盐酸、水和丙酮反复洗涤，真空干燥，即可制得新型的7.0μm无孔弱阳离子交换色谱固定相。

如图1所示为蛋白质和酶在7.0μm无孔单分散弱阳离子交换填料上的分离图，其中1、色谱柱：5.0×4.6cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡液)：20mmol/L NaH2PO3(pH 7.0)；流动相B(洗脱液)：A+0.5mol/LNaCl(pH 7.0)；3、流动相流速：2mL/min；4、线性梯度15min，100％A-100％B，100％B延长10min.5、标准蛋白：1.MyO，2.RNase-A，3.4.Cyt-C，5.Lys。

实施例二：5.0μm无孔单分散弱阳离子交换树脂的制备方法是按如下顺序进行：

1)2.2μm单分散线性低分子聚苯乙烯种子的制备

在100mL圆底烧瓶中加入10mL St，0.2g AIBN，0.5g PVP和90mL无水乙醇，超声溶解，通氮气除氧，于70℃恒温水浴中搅拌加热，反应24小时。除去溶剂，用无水乙醇洗涤数次，用0.2％SDS溶液转移至锥形瓶中备用，取少量在显微镜下观察其形态及大小。该产物为粒度2.2μm单分散聚苯乙烯微球。

2)5.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备

在250mL烧杯中准确移入4.5mL GMA，4.5mL EDMA，0.18g BPO，待BPO溶解后，加入70mL 0.2％SDS溶液和25mL 5％PVA溶液，超声乳化30分钟(要使有机相完全乳化，上层无油滴)，将乳液缓慢加入到1.0g单分散聚苯乙烯种子(2.2μm)溶液中，控制温度为30℃，搅拌速度为120rpm溶胀12小时，用显微镜观察有机单体是否被种子吸收完全。通氮气20分钟，在搅拌速度为120rpm的条件下70℃恒温加热搅拌聚合24小时。产物用玻砂漏斗抽滤，大量热蒸馏水洗涤，再用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空烘干4h。即可得到5.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

3)5.0μm无孔单分散弱阳离子交换树脂的制备

将4.0g上步合成的5.0μm无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入0.1mol/L稀硫酸中，60℃水浴加热搅拌反应。反应产物先用水洗三遍，浸泡于蒸馏水中过夜，再用水洗涤，真空干燥，即得水解的微球。水解的无孔树脂悬浮于由30mL二甲亚砜和NaOH(9∶1)组成的混合溶液中，室温搅拌后加入环氧氯丙烷，水浴加热搅拌反应，即得环氧化的微球；将环氧化的微球再用稀酸进一步水解后，用大量水、丙酮洗涤，真空干燥。将干燥的微球加入到4g无水丁二酸酐溶解于40mL吡啶溶液中，超声分散后，恒温搅拌加热反应。产物用玻砂漏斗抽滤，再用水、0.1mol/L盐酸、水和丙酮反复洗涤，真空干燥，即可制得新型的5.0μm无孔弱阳离子交换树脂。

如图2所示为蛋白质和酶在5.0μm无孔单分散弱阳离子交换填料上的分离图，其中1、色谱柱：5.0×4.6cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡液)：20mmol/L NaH2PO3(pH 7.5)；流动相B(洗脱液)：A+0.5mol/LNaCl(pH 7.5)；3、流动相流速：3mL/min，4、线性梯度4min，5％A-40％B，40％B延长3min.标准蛋白：1.MyO，2.RNase-A，3.4.Cyt-C，5.Lys。

实施例三：3.0μm无孔单分散弱阳离子交换树脂的制备方法是按如下顺序进行：

1)0.6μm单分散线性聚苯乙烯种子的制备：

在100mL圆底烧瓶中加入12.0mL St，0.24g AIBN，1.5g PVP和135mL90％乙醇溶液中，超声溶解，通氮气除氧，于70℃恒温水浴中搅拌加热，反应24小时。除去溶剂，用无水乙醇洗涤数次，用0.1％SDS溶液转移至锥形瓶中备用，取少量在显微镜下观察其形态及大小。该产物为粒度0.6μm单分散聚苯乙烯微球。

2)3μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：

在250mL园底烧杯中准确加入1.0g上步合成的0.6μm单分散聚苯乙烯种子和20mL 0.1％SDS溶液。在250mL烧杯中加入3.5mL GMA，3.5mL EDMA，0.21g BPO，待BPO溶解后，加入60mL 0.2％SDS溶液和30mL 5％PVA溶液，超声乳化30分钟(要使有机相完全乳化，上层无油滴)，将乳液缓慢加入到250mL园底烧杯的聚苯乙烯种子溶液中，控制温度为30℃，搅拌速度为120rpm溶胀20小时，用显微镜观察有机单体是否被种子吸收完全。通氮气20分钟，在搅拌速度为120rpm的条件下70℃恒温加热搅拌聚合24小时。产物用玻砂漏斗抽滤，大量热蒸馏水洗涤，再用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空烘干4h。即可得到3μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

3)3.0μm无孔单分散弱阳离子交换树脂的制备：

将4.0g上步合成的3.0μm无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入0.1mol/L稀硫酸中，60℃水浴加热搅拌反应。反应产物先用水洗三遍，浸泡于蒸馏水中过夜，再用水洗涤，真空干燥，即得水解的微球。水解的无孔树脂悬浮于由40mL二甲亚砜和NaOH(9∶1)组成的混合溶液中，室温搅拌后加入环氧氯丙烷，水浴加热搅拌反应，即得环氧化的微球；将环氧化的微球再用稀酸进一步水解后，用大量水、丙酮洗涤，真空干燥。将干燥的微球加入到5g无水丁二酸酐溶解于40mL吡啶溶液中，超声分散后，恒温搅拌加热反应。产物用玻砂漏斗抽滤，再用水、0.1mol/L盐酸、水和丙酮反复洗涤，真空干燥，即可制得新型的3.0μm无孔弱阳离子交换树脂。

如图3所示为蛋白质和酶在3.0μm无孔单分散弱阳离子交换填料上的分离图，其中1、色谱柱：5.0×4.6cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡液)：20mmol/LNaH2P03(pH 7.5)；流动相B(洗脱液)：A+0.5mol/L NaCl(pH 7.0)，3、流动相流速：3mL/min，4、线性梯度2min，5％A-40％B，40％B延长2min，5、标准蛋白：1.My0，2.RNase-A，3.4.Cyt-C，5.Lys。

如图4所示为本发明在基因工程产品重组人干扰素-γ的8mol/L脲提取液分离图，1、色谱柱：5.0×4.6cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡液)：20mmol/L NaH2PO3(pH 7.5)；流动相B(洗脱液)：A+0.5mol/L NaCl(pH 7.0)，3、流动相流速：2mL/min，4、线性梯度4min，5％A-40％B，40％B延长2min，5、*纯化后重组人干扰素-γ，纯化后重组人干扰素-γ的纯度为90％。