具有抗骨质疏松作用的雌激素－RGD肽缀合物及在医学中的应用

摘要

本发明公开了一系列新的具有良好的抗骨质疏松活性的雌激素－RGD肽缀合物及其制备方法。本发明雌激素肽缀合物通过下述方法制备而成：将雌酮或雌二醇的3位或17位引入连接臂，然后把液相方法合成的保护中间体引入到连接臂上，再经脱保护即得。动物模型试验证实，本发明系列化合物的抗骨质疏松活性要优于雌二醇和雌酮且无明显的副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种雌激素缀合物，尤其涉及一种雌激素肽缀合物、其制备方法及应用。

背景技术

骨质疏松是一种多原因代谢性骨病，以骨质弥漫性减少为特征。50岁以上的绝经妇女有50％以上在生活的某个时期经历有骨质疏松引起的骨折(Davidson M，DeSimone M E.Confronting osteoporosis：what we know，wherewe’re headed.Clin Rev；12，76-82，2002)。在骨质疏松引起骨折的妇女中，50％以上要花很长时间康复，这就避免不了发生一些后遗症包括死亡。据估计，遭遇骨折的妇女至少有20％会死亡(Michaelsson K，Baron J A，et al.，Influenceof parity and lactation on hip fracture risk.Am J Epidemiol；153，1166-1172，2001)。对北京和上海的初步调查表明，60岁以上女性骨质疏松症患病率为40-50％。骨质疏松正日益成为一个国际公认的健康问题。在当前常见疾病中，骨质疏松位于前十位(陈星飚等，运动防止绝经后骨质疏松症的研究进展，国外医学，老年医学分册，23(2)，85-88，2002)。

早在1941年，Albright发现骨质疏松症常见于绝经后妇女，提出雌激素缺乏是绝经后骨质疏松的主要病因(Albright F，Smith P H，et al，Postmenopausalosteoporosis.JAMA，116，2465-2474，1941)。妇女绝经的平均年龄是51岁。这就意味着妇女1/3以上的时间将在绝经期后度过，也就是妇女要在雌激素缺乏的环境下生活30年以上(Mikinlay SM，Brambilla DJ，The normal menopansetransition，Maturitas，14，103-15，1992)。如果没有激素替代治疗(HRT)，这些妇女不仅将处于无劳动能力的状态，而且也将经历一些机体上因骨质疏松引起的病症，如心血管疾病等，甚至是致死性(Michael J.S，Selective estrogenreceptor modulators：the ideal estrogen replacement，8，25-30，2001)。一位妇女一生得骨质疏松症性骨折的几率是11-18％，其中每6位就有一位会因骨质疏松症的并发症而死亡(Spencer C P.Morris E P，et al.，Selective estrogen receptormodulators：women’s penacea for the next millennium？Am J obstet Gynecol，180，763-770，1999)。

雌激素替代疗法(ERT)能够减轻妇女绝经期的症状，能够减少心血管疾病的风险，能够阻止骨丢失(Stampter M，Colditz.G.，et al.，Estrogen replacementtherapy and coronary heart disease：a quantitative assessment of theepidimiological evidence.Prev Med，20，47-63，1991)。使用雌激素进行治疗能够明显地抑制骨质缺损和骨代谢，明显地增大骨骼中矿物质的密度(BMD)，绝经早期的妇女使用雌激素进行治疗时，雌激素可使脊椎骨中矿物质的密度增高3～4％(Hosking D，Chilrers C E D，et al.Prevention of Bone loss withAlendronate in Postmenopausal Women under 60 Years of Age，N Engl J Med，338，485-492，1998)。那些使用激素(雌激素/孕激素)进行替代疗法(HRT)的患者或者在最近的5～9年内进行至少为期5年的HRT治疗的患者，其骨折的危险率降低了50％以上(Michealsson K，Baron J A.，et al.，Hormone replacementtherapy and risk of hip fracture：Population based case-control study.The SwedishHip Fracture Study Group，BMJ，316，1858-1863，1998)。尽管雌激素是现今为止治疗绝经后妇女骨质疏松的最有效的药物，但长期使用激素替代治疗或雌激素替代治疗，不可避免地会引起一些并发症，如使骨形成表面显著下降，引起子宫内膜增生或肿瘤，引起阴道出血，使乳房变软，增加乳腺癌的危险性，引起高血压或使原有高血压恶化，可明显增加静脉血栓栓塞性疾病的危险性等(Colditz G A，Hankinson S E，et al.，The use of estrogen and progestin and the riskof breast cancer in postmenopausal women.N Engl J.Med.332，1589-93，1995)，雌激素的使用期通常不超过3年(Scalley E K，Henrich J B，et al.；An overview ofestrogen replacement therapy in postmenopausal women.，J.Women Health，2，289～294，1993；Witt D M，Lousberg T R..Controversies surrounding estrogen usein postmenopausal women.Ann Pharmaeother，31，745～755，1997；Josse R G，Effect of ovarian hormonal therapy on skeletal and estraskeletal tissues in women.Can Med Assoc J，155，929～934，1996)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗骨质疏松活性高、副作用低的雌激素肽缀合物。

本发明的一种雌激素肽缀合物，具有下述通式I的结构：

               通式I

其中，当R₃为H时，R₁和R₂一个为H，一个为-OCOCH₂CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Ser-OH、CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Val-OH、-OCOCH₂-CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Phe-OH、Ser-Asp-Gly-Arg-H、＝NNH-Val-Asp-Gly-Arg-H或＝NNH-Phe-Asp-Gly-Arg-H；当R₁和R₂一个为H，一个为OH时，R₃选自-CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Ser-OH、-CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Val-OH、-CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Phe-OH、-CH₂CONHNH-Ser-Asp-Gly-Arg-H、-CH₂CONH-NH-Val-Asp-Gly-Arg-H或-CH₂CONHN-Phe-Asp-Gly-Arg-H；当R₁和R₂共同为羰基氧时，R₃选自-CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Ser-OH、-CH₂CO-Arg-Gly-Asp-Val-OH或-CH₂CO-Arg>

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种雌激素肽缀合物的制备方法。

本发明的雌激素肽缀合物的制备方法，包括以下步骤：

将雌酮和雌二醇的3位或17位引入连接臂(COCH₂CH₂CO、CH₂CO或CH₂CONH)，然后把液相方法合成的Arg-Gly-Asp-Ser-OH、Arg-Gly-Asp-Val-OH或Arg-Gly-Asp-Phe-OH的保护中间体引入到连接臂上，再经脱保护即得。

本发明系列化合物经试验证实具有良好的抗骨质疏松活性。本发明利用雌激素对绝经型骨质疏松的明显治疗作用、利用RGD(Arg-Gly-Asp)肽的靶向性、利用RGD三肽序列对破骨细胞与骨表面粘附的抑制作用，把RGD肽与雌激素缀合，因此所得到的雌激素缀合物比雌激素具有更好的抗骨质疏松活性。

整合素介导的细胞粘附过程与一系列重要疾病的病理相关联。例如血小板活化后的表面的整合素受体与血液中的纤维蛋白原、粘连蛋白或VWF粘连，形成血栓。癌细胞表面的整合素与正常组织粘连，造成癌转移。破骨细胞表面的整合素与骨基质蛋白粘连，造成骨质疏松。整合素受体可分为细胞表面部分和跨膜进入胞浆区的铰链部分。整合素介导的细胞黏附由配基结合域参与。在癌转移、血栓形成和骨质疏松发病中与整合素的配基结合域粘附的蛋白的共同序列为RGD。

骨吸收装置的形成有赖于破骨细胞表面整合素与特异的骨基质蛋白成份之间的相互作用。在破骨细胞膜上鉴定出来的整合素主要有avβ3、a2β1和avβ1三种。其中avβ3是破骨细胞识别骨基质的主要整合素。与avβ3结合的特异性骨基质蛋白骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨唾液蛋白(bone sialoptein，BSP-II)和纤维连接素(fibronectin，FN)均含RGD三肽序列。整合素介导的破骨细胞粘附过程，对于破骨细胞分化、成熟、募集、活化以及骨吸收十分重要。体外实验表明，整合素avβ3单抗、人工合成的骨桥蛋白、RGD三肽序列、RGD多肽或RGD肽段，可抑制破骨细胞骨吸收。

多肽与甾体激素两个主体之间存在“允许作用”。“允许作用”是指类固醇激素可以对多肽和其它递质的生物效应起增效作用，反之亦然。随着分子生物学的发展，提示其可能的机制主要表现在对其它激素所作用的受体和受体后信息传递物质的调节，以及直接或间接作用于靶细胞基因。发明人在研究具有较强镇痛作用的内源性小分子二肽京都啡肽时，发现它们与氢化可的松及雌酮的缀合物的镇痛作用可增强。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，由通式(I)所示结构的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即将药学上可接受用量的通式(I)化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。

该组合物可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂，或口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。

根据不同的给药方法，组合物可以含有0.1％～99％重量的活性物质，优选10～60％重量的活性物质。

具体实施方式

以下将结合实施例和试验例具体说明本发明，本发明的实施例和试验例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

原料和试剂：

各种保护氨基酸和雌二醇、雌酮购自sigma公司；所用氨基酸均为L-构型；薄层层析硅胶GF254、柱层析200-300目硅胶和硅胶H为青岛海洋化工厂生产；其它试剂除注明外均为国内市售分析纯。无水四氢呋喃用适量五氧化二磷干燥24小时后，过滤所得滤液用金属钠回流(二苯甲酮为指示剂)变蓝，常压蒸馏收集65-66℃的馏分。

绝对乙醇按常规方法制备，即于1.5L的圆底烧瓶中加5g干净的金属镁和0.5g的碘，然后加入50～75ml无水乙醇，加热至碘消失，继续加热至镁都转换完全，再加入900ml无水乙醇，回流30min，常压蒸馏收集80℃的馏分。密封保存。

无水二甲基甲酰胺按常规方法制备，即市售二甲基甲酰胺，过干燥的强酸型离子交换柱，后加入其1/3体积的苯进行蒸馏，等基本蒸去苯后，减压蒸出二甲基甲酰胺(沸程1℃)的馏分，加入4A分子筛适量，密封保存备用。吡啶精制：吡啶用氢氧化钾干燥，经蒸馏后收集114～116℃的馏分。

4N HCl/乙酸乙酯按常规方法制备，即市售乙酸乙酯用无水碳酸钾干燥24小时后，过滤，得干燥的乙酸乙酯。用NaCl浓硫酸发生氯化氢气体，气体经浓硫酸洗瓶及氯化钙干燥塔后通入乙酸乙酯溶液中吸收。至增重4N为止，溶液密封保存。

测试仪器

核磁仪器型号为VXR-300S(300MHz)或INOVA-500(500MHz)。质谱仪器型号为FAB-MS用英国VG公司的ZAB-MS，美国Thermo Finnigan公司的Trace MS System质谱仪和MALDI-TOF-MS。熔点仪为北京科仪电光仪器厂生产的XT5热台式显微熔点仪，温度未校正。旋光仪为SCHMIDT-HAENSCH公司的POLAARTRONIC D型微量旋光仪，样品池为5厘米，体积0.7ml。

实施例1 Boc-Ser(Bzl)-OBzl(化合物1)的合成

将1.0g(3.386mmol)Boc-Ser(Bzl)-OH溶于2.5ml无水乙醇中，加入0.557g(1.693mmol)Cs₂CO₃水溶液，室温反应2小时后，减压浓缩至干，残留物加无水乙醇，减压浓缩至干，反复3次，得无色固体。置干燥器中干燥过夜。该无色固体溶于2ml无水DMF中，加入0.402ml(3.386mmol)溴苄，55℃左右反应16小时。将反应液倒入培养皿中用吹风机吹干溶剂。残留物用乙酸乙酯溶解，滤掉不溶物，滤液依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液各洗三遍(上述操作在下文统称常规处理)。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，得无色粗产品，用乙酸乙酯—石油醚重结晶，得纯的标题化合物1.223g(94％)。

实施例2 HCl·H-Ser(Bzl)-OBzl(化合物2)的合成

500mg(1.299mmol)Boc-Ser(Bzl)-OBzl溶于3ml 4NHCl/乙酸乙酯中，室温反应1.5小时，TLC显示原料点消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物再用乙酸乙酯溶解，减压浓缩至干。该操作反复4次，残留物用无水乙醚泡洗，得标题化合物，直接用于下步反应。ESI-MS：286.6[M+H]⁺，571.2[2M+H]⁺.

实施例3 Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物3)的合成

A)420mg(1.299mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH溶于2ml无水THF中，冰浴下加入175.5mg(1.299mmol)HoBt和268mg(1.299mmol)的DCC的无水THF溶液，0℃反应30分钟。

B)417.6mg(1.299mmol)HCl·H-Ser(Bzl)-OBzl溶于2ml无水THF中，冰浴下加入155μl N-甲基吗啉，反应10分钟后，将该溶液加入到上面A反应液中。加N-甲基吗啉使两者混和反应液的pH＝8～9左右，室温反应8小时后，TLC显示原料点消失。过滤掉不溶物，滤液减压浓缩至干，残留物用石油醚和无水乙醚泡洗6次后，用乙酸乙酯溶解残留物，滤液依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液各洗三遍。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得无色产品。用乙酸乙酯—石油醚重结晶。得标题化合物722.3mg(94.3％)。

实施例4 HCl·H-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物4)的合成  

500mg(1.299mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于3ml 4NHCl/乙酸乙酯中，室温反应2小时，TLC显示原料点消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物再用乙酸乙酯溶解，减压浓缩至干，该操作反复3次，残留物用无水乙醚泡洗，得标题化合物，直接用于下步反应。ESI-MS：491.7[M+H]⁺，981.2[2M+H]⁺.

实施例5 Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物5)的合成

采用实施例3的操作，由114mg(0.8432mmol)Boc-Gly-OH和444.5mg(0.8432mmol)HCl·H-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl制得494mg(90.5％)标题化合物。ESI-MS 648.4[M+H]⁺.

实施例6 HCl·H-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物6)的合成

采用实施例4的操作，由400mg(0.6179mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl制得347.5mg(96％)标题化合物。ESI-MS：548.7[M+H]⁺，1095.6[2M+H]⁺.

实施例7 Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物7)的合成

采用实施例3的操作，由197mg(0.6197mmol)Boc-Arg(NO₂)-OH和363mg(0.6179mmol)HCl·H-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl制得466mg(88.7％)。Mp72-74℃，[a]²⁰_D＝+5.0°(c＝1，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，FAB-MS(m/e)848.1[M-H]⁺.

实施例8 HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物8)的合成

采用实施例4的操作，由400mg(0.4710mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl制得标题化合物370mg(92.7％)，FAB-MS(m/e)750.3[M+H]⁺。

实施例9 HCl·H-Arg-Gly-Asp-Ser-OH(化合物9)的合成

100mg(0.1273mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于甲醇/水＝3/2混合溶剂，加入10mg10％Pd/C，通H₂，进行催化氢解反应。室温反应5小时，停反应，过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用无水乙醚磨洗数次，得54mg(90.2％)标题化合物，为无色固体粉末。mp183-187℃，[a]²⁰_D＝+6°(c＝1，H₂O)，ESI-MS：434.6[M+2H]⁺.

实施例10 Boc-Val-OBzl(化合物10)的合成

将Boc-Val-OH 1g(4.608mmol)溶于2.5ml无水乙醇中，加入Cs₂CO₃0.750g(2.304mmol)的水溶液，室温反应2小时后，反应混合物减压浓缩至干，残留物再加无水乙醇，再减压浓缩至干，反复3次，得无色固体。置干燥器中干燥过夜。将所得无色固体溶于3ml无水DMF中，加入0.547ml(4.608mmol)溴苄，55℃左右反应16小时。反应混合物减压浓缩至干。残留物再用乙酸乙酯溶解，过滤掉不溶物，滤液依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液各洗三遍。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，得无色粗产品，用乙酸乙酯—石油醚重结晶，得纯的标题化合物1.34g(94.7％)。

实施例11 HCl·H-Val-OBzl(化合物11)的合成

采用实施例4的操作，由400mg(1.303mmol)Boc-Val-OBzl得311mg(98％)标题化合物。ESI-MS：208.5[M+H]⁺，415.4[2M+H]⁺.

实施例12 Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物12)的合成

采用实施例3的操作，由422mg(1.303mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和317mg(1.303mmol)HCl·H-Val-OBzl制得634mg(95.0％)标题化合物，为无色固体，FAB-MS：513.4[M+H]⁺。

实施例13 HCl·H-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物13)的合成

采用实施例4的操作，由300mg(0.5854mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl得254.9mg(97％)标题化合物。

实施例14 Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物14)的合成

采用实施例3的操作，由102mg(0.5854mmol)Boc-Gly-OH和263mg(0.5854mmol)HCl·H-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得319mg(95.7％)标题化合物。mp77-79℃。ESI-MS：570.5[M+H]⁺，592.6[M+Na]⁺，1161.2[2M+Na]⁺.

实施例15 HCl·H-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物15)的合成

采用实施例4的操作，由300mg(0.5268mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得261mg(96％)标题化合物，ESI-MS：470.7[M+H]⁺。

实施例16 Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物16)的合成

采用实施例3的操作，由167mg(0.5268mmol)Boc-Arg(NO₂)-OH和266.5mg(0.5268mmol)HCl·H-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得405.8mg(88.9％)标题化合物。mp95-97°，[a]²⁰_D＝+7(c＝1，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，FAB-MS(m/e)771.3[M+H]⁺.809.3[M+K]⁺.。

实施例17 HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物17)的合成

采用实施例4的操作，由500mg(0.6489mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得470mg(94％)标题化合物，FAB-MS(m/e)671.5[M+H]⁺。

实施例18 HCl·H-Arg-Gly-Asp-Val-OH(化合物18)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.1298mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得55mg(88.7％)标题化合物，为无色粉末。mp180-182℃，[a]²⁰_D＝+3°(c＝1，H₂O)，ESI-MS：445.4[M+H]⁺

实施例19 Boc-Phe-OBzl(化合物19)的合成

将Boc-Phe-OH 1g(3.774mmol)溶于3ml无水乙醇中，加入Cs₂CO₃0.621g(1.887mmol)的水溶液，室温反应2小时后，减压蒸干溶剂，再加无水乙醇，减压蒸干，反复3次，得白色固体。置干燥器中干燥过夜。将上述所得无色固体溶于3ml无水DMF中，加入0.448ml(3.774mmol)溴苄，55℃左右反应16小时。将反应液倒入培养皿中用吹风机吹干溶剂。然后再用乙酸乙酯溶解，过滤掉不溶物，滤液依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液各洗三遍。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得无色粗产品，用乙酸乙酯—石油醚重结晶，得1.261g(95％)纯标题化合物。Rf＝0.72(A).ESI-MS：378.4[M+Na]⁺.。

实施例20 HCl·H-Phe-OBzl(化合物20)的合成

采用实施例4的操作，由500mg(1.407mmol)Boc-Phe-OBzl得470mg(94％)标题化合物，直接用于下步反应。

实施例21 Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物21)的合成

采用实施例3的操作，由455mg(1.407mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和516mg(1.407mmol)HCl·H-Phe-OBzl得757mg(96％)标题化合物。mp88-90℃.ESI-MS：583.6[M+Na]⁺，1143.0[2M+Na]⁺

实施例22 HCl·H-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物22)的合成

采用实施例4的操作，由500mg(0.8919mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得403mg(98％)标题化合物。ESI-MS：461.8[M+H]⁺.

实施例23 Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物23)的合成

采用实施例3的操作，由153mg(0.8746mmol)Boc-Gly-OH和403mg(0.8746mmol)HCl·H-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得509mg(94.3％)标题化合物。mp 72-74℃。ESI-MS：618.5[M+H]⁺，640.6[M+Na]⁺，1257.0[2M+Na]⁺.

实施例24 HCl·H-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物24)的合成

采用实施例4的操作，由500mg(0.8097mmol)Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得411mg(98％)标题化合物，直接用于下步反应。ESI-MS：518.7[M+H]⁺，1035.4[2M+H]⁺.

实施例25 Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物25)的合成

采用实施例3的操作，由236mg(0.7412mmol)Boc-Arg(NO₂)-OH和411mg(0.7412mmol)HCl·H-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得528.5mg(87％)标题化合物。mp148-150℃，[a]²⁰_D＝+7°(c＝1，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，FAB-MS(m/e)818.6[M-H]⁺.

实施例26 HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物26)的合成

采用实施例4的操作，由500mg(0.6101mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl制得461mg(93.3％)标题化合物，直接用于下步反应，FAB-MS(m/e)720.5[M+H]⁺。

实施例27 HCl·H-Arg-Gly-Asp-Phe-OH(化合物27)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.1323mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，得64mg(92％)标题化合物，为无色粉末。mp158-160℃，[a]²⁰_D＝+4°(c＝2，H₂O)，ESI-MS：492.5[M+2H]⁺

实施例28γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酸(化合物28)的合成

100mg(1mmol)丁二酸酐，溶于1ml吡啶中，待温热溶解后，加入100mg(0.3676mmol)雌二醇，90℃反应10小时后，薄层检测，原料点消失。停止反应后，加入20ml冰水和75mg氯化钠，剧烈搅拌后用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水Na_2SO₄干燥，过滤，真空浓缩干有机溶剂，得黄色粘浆。将此粘浆溶于1ml甲醇中，加入适量冷的10％K₂CO₃溶液，使pH维持在8.5-9，室温放置18小时，后滴加50％乙酸至pH＝6，真空浓缩除去有机溶剂后，加入2ml冰水和75mg氯化钠，用乙酸乙酯萃取，有机层用冷冰水反洗几次。无水Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩干有机溶剂，得浅黄色粘浆。置冰箱中过夜，第二天析出固体，用少量冷苯洗涤，得乳白色粉末。柱层析分离，洗脱剂是氯仿∶甲醇＝10∶1，得137mg(94.5％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.33(C)。FAB-MS(m/e)373.6[M+H]⁺。mp148-150℃。[a]²⁰_D＝+35°(c＝1，THF).¹HNMR(DMSO-d6)δ0.774(s，3H，18-CH₃)；

4.618(t，1H，17-H)；6,400(s，1H，4-H)；6.517(d，1H，3-OH)；7.04(d，1H，1-H)；8.993(s，1H，3-OH)；12.192(s，1H，COOH)

实施例29 N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物29)的合成

采用实施例3的操作，由88mg(0.2355mmol)γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酸(28)和185mg(0.2355mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(8)得158mg(60.8％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.42(C)。mp143-145℃，[a]²⁰_D＝+20°(c＝1，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，ESI-TOF：1104.4[M+H]⁺

实施例30 N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物30)的合成

采用实施例3的操作，由121mg(0.3253mmol)γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酸(28)和230mg(0.3253mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(17)得177mg(53.1％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.53(C)。mp151-153℃，[a]²⁰_D＝+30°(c＝1，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，ESI-TOF：1025.5[M+H]⁺

实施例31 N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物31)的合成

采用实施例3的操作，由39mg(0.1041mmol)γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酸(28)和78mg(0.1041mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(26)得65mg(58.2％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.51(C)mp156-158℃，[a]²⁰_D＝+23°(c＝2，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，ESI-TOF：1074.2[M+H]⁺    

实施例32 N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg-Gly-Asp-Ser-OH(化合物32)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09067mmol)N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(29)得44mg(62％)目标化合物，为无色粉末。Rf＝0.47(D)，mp178-180℃，[a]²⁰_D＝+50°(c＝1，MeOH)，FAB-MS：788.4[M+H]⁺，IR(KBr)3367cm^-1(νCO-NH)，1720，1658cm^-1(νC＝O).

¹HNMR(ppm)δ0.773(s，3H，18-CH₃)；4.601(t，1H，17-H)；6.439(s，1H，4-H)；6.514(d，1H，2-H)；7.045(d，1H，1-H)；9.068(s，1H，3-OH)

实施例33 N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg-Gly-Asp-Val-OH(化合物33)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09766mmol)N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(30)得53.4mg(68.4％)目标化合物，为无色粉末。Rf＝0.50(D)，mp193-195℃，[a]²⁰_D＝+56°(c＝0.5，MeOH)，MALDI-TOF：800.4[M+H]⁺.IR(KBr)3360cm^-1(νCO-NH)，1659cm^-1(νC＝O).¹HNMR(ppm)δ0.754(s，3H，18-CH₃)；0.850(d，6H，Val-2CH₃)；

6.429(s，1H，4-H)；6.494(d，1H，2-H)；6.931(d，1H，1-H)；9.032(s，1H，3-OH)

实施例34 N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg-Gly-Asp-Phe-OH(化合物34)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09320mmol)N-[γ-(3-羟基雌二醇-17β-氧基)丙酰基]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(31)得45.8mg(58％)目标化合物，为无色粉末。，Rf＝0.48(D)，mp196-198℃，[a]²⁰_D＝+45°(c＝0.5，MeOH)，MALDI-TOF：848.4[M+H)⁺，870.4[M+Na]⁺IR(KBr)3391cm^-1(νCO-NH)，1661cm^-1(νC＝O).¹HNMR(ppm)δ0.764(s，3H，18-CH₃)；6.434(s，1H，4-H)；6.502(d，1H，2-H)；7.009(d，1H，1-H)；7.023(m，1H，aromatic H of Phe)；7.075(m，2H，aromatic H of Phe)；7.103(m，2H，aromatic H of Phe)；9.045(s，1H，3-OH)

实施例35 3-乙氧羰亚甲氧基-雌二醇(化合物35)的合成

500mg(1.85mmol)雌二醇溶于10ml无水THF中，加入1.32ml2M乙醇钠的乙醇溶液，反应30分钟后，加入0.612ml(5mmol)溴乙酸乙酯，55℃反应16小时后，反应混合物减压浓缩至干，残留物再用溶剂溶解并减压浓缩至干，该操作反复4次，以便去除残留的溴乙酸乙酯。残留物柱层析分离纯化(氯仿/乙醚，100/3)，得550mg(83％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.42(E)。mp88-90℃。[a]²⁰_D＝+60°(c＝1，THF)。

实施例36 3-羧亚甲氧基-雌二醇(化合物36)的合成

450mg(1.257mmol)3-乙氧羰亚甲氧基-雌二醇(35)溶于3ml无水乙醇中，冰浴下滴加适量2NNaOH水溶液，室温反应2.5小时后，薄层检测原料点消失，加适量KHSO₄固体使反应液pH＝7，反应混合物减压浓缩去除有机溶剂后，补加少量水，再用适量KHSO₄固体使反应液pH＝2，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩，得397mg(95.6％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.27(B)。mp214-215℃。[a]²⁰_D＝+50°(c＝0.6，THF)。EI-MS(m/e)330[M]⁺.

实施例37 N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物37)的合成

采用实施例3的操作，由50mg(0.1514mmol)3-羧亚甲氧基-雌二醇(36)和119mg(0.1514mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(8)得150mg(93.2％)纯标题产品，为无色粉末。Rf＝0.44(C)，mp114-116℃。[a]²⁰_D＝+55°(c＝0.5，MeOH)。ESI-MS 1062.5[M+H]⁺

实施例38 N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物38)的合成

采用实施例3的操作，由50mg(0.1514mmol)3-羧亚甲氧基-雌二醇(36)和107mg(0.1514mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(17)得111mg(73.5％)纯标题产品，为无色粉末。Rf＝0.52(C)。mp130-132℃。[a]²⁰_D＝+60°(c＝1，MeOH)，FAB-MS(m/e)1025.9[M+H]⁺.

实施例39 N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物39)的合成

采用实施例3的操作，由50mg(0.1514mmol)3-羧亚甲氧基-雌二醇(36)和119mg(0.1514mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(26)得96.5mg(60.9％)纯标题产品，为无色粉末。Rf＝0.55(C)。mp136-138℃。[a]²⁰_D＝+55°(c＝1，MeOH)，FAB-MS(m/e)1048.2[M+H]⁺.

实施例40 N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg-Gly-Asp-Ser-OH(化合物40)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09421mmol)N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(37)得49.1mg(70％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.41(D)，mp155-157℃。[a]²⁰_D＝+39°(c＝0.5，MeOH)，ESI-TOF：746.3[M+H]⁺IR(KBr)3387cm^-1(νCO-NH)，1659cm^-1(νC＝O).¹HNMR(ppm)δ＝0.663(s，3H，18-CH₃)；4.513(s，2H，3-O-CH₂)；6.645(s，1H，4-H)；6.701(d，1H，2-H)；7.156(d，1H，1-H)；

实施例41 N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg-Gly-Asp-Val-OH(化合物41)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09757mmol)N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(38)得53.9mg(73％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.43(D)，mp174-176℃。[a]²⁰_D＝+45°(c＝0.5，MeOH)，FAB-MS：757.9[M+H]⁺。IR(KBr)3402cm^-1(νCO-NH)，1660cm^-1(νC＝O).¹HNMR(DMSO-d6)δ＝0.646(s，3H，18-CH₃)；0.731(d，6H，Val-2CH₃)；3.006(d，1H，Val-CH-CO)；4.505(s，2H，3-O-CH₂-CO)；6.596(s，1H，4-H)；6.949(d，2H，2-H)；7.136(d，2H，1-H)。

实施例42 N-(雌二醇-3-氧基亚甲羰基)-Arg-Gly-Asp-Phe-OH(化合物42)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09549mmol)17β-OH-雌二醇-3-O-乙酰基-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(39)得59.2mg(77％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.45(D)，mp180-182℃。[a]²⁰_D＝+48°(c＝0.5，MeOH)，，FAB-MS：806.3[M+H]⁺IR(KBr)3405cm^-1(νCO-NH)，1660cm^-1(νC＝O).¹HNMR(ppm)δ0.659(s，3H，18-CH₃)；6.645(s，1H，4-H)；6.667(d，1H，2-H)；7.063(d，1H，1-H)；7.079(m，1H，aromatic H of Phe)；7.127(m，2H，aromatic H of Phe)；7.275(m，2H，aromatic H of Phe).

实施例43 3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物43)的合成

200mg(0.5587mmol)3-乙氧羰亚甲氧基-雌二醇(35)溶于3ml甲醇，于55℃下滴加1ml80％水合肼，反应4小时后，停止反应，冰箱放置过夜，第二天将析出的固体过滤，水洗，干燥，得184mg(96％)标题化合物，为无粉末。Rf＝0.21(C)。mp153-155℃，FAB-MS(m/e)345.5[M+H]⁺

实施例44 Boc-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物44)的合成

采用实施例3的操作，由163mg(0.5523mmol)BocSer(Bzl)OH和190mg(0.5523mmol)3-肼基亚甲氧基-雌二醇(43)得305mg(89.1％)纯标题化合物，为无色固体粉末。Rf＝0.34(B).FAB-MS(m/e)620.6[M+H]⁺.

实施例45 Boc-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物45)的合成

采用实施例3的操作，由120mg(0.5523mmol)BocValOH和190mg(0.5523mmol)3-肼基亚甲氧基-雌二醇(43)得288mg(96％)纯标题化合物，为无色固体粉末。mp173-174℃，Rf＝0.35(B).FAB-MS(m/e)543[M]⁺.

实施例46 Boc-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物46)的合成

采用实施例3的操作，由39mg(0.1453mmol)BocPheOH和50mg(0.1453mmol)3-肼基亚甲氧基-雌二醇(43)得73mg(85％)纯标题产品，为无色固体粉末。Rf＝0.31(B).FAB-MS(m/e)592[M+H]⁺

实施例47 HCl Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物47)的合成

采用实施例4的操作，由100mg(0.1615mmol)Boc-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(44)得79mg(94％)标题化合物，为无色粉末。

实施例48 HClVal-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物48)的合成

采用实施例4的操作，由140mg(0.2579mmol)Boc-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(45)得110.8mg(97％)标题化合物，为无色粉末。

实施例49 HClPhe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物49)的合成

采用实施例4的操作，由100mg(0.1691mmol)Boc-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(46)得78.8mg(95％)标题化合物，为无色粉末。

实施例50 BocAsp(OBzl)-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物50)的合成

采用实施例3的操作，由52mg(0.1615mmol)BocAsp(OBzl)OH和84mg(0.1615mmol)HCl Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(47)得115mg(85％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.53(B)。FAB-MS(m/e)826.3[M+H]⁺

实施例51 Boc-Asp(OBzl)-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物51)的合成

采用实施例3的操作，由83.4mg(0.2579mmol)BocAsp(OBzl)OH和114.2mg(0.2579mmol)HClVal-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(48)得174mg(90％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.48(B)。FAB-MS(m/e)749.7[M+H]⁺

实施例52 BocAsp(OBzl)-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物52)的合成

采用实施例3的操作，由55mg(0.1691mmol)BocAsp(OBzl)OH和83mg(0.1691mmol)HClPhe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(49)得185mg(89％)标题化合物，为无色粉末。mp110-112℃，Rf＝0.56(B)。FAB-MS(m/e)797.4[M]⁺

实施例53 HClAsp(OBzl)-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物53)的合成

采用实施例4的操作，由219mg(0.2650mmol)BocAsp(OBzl)-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(50)得184.5mg(96％)纯标题化合物，直接用于下步反应。

实施例54 HClAsp(OBzl)-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物54)的合成

采用实施例4的操作，由100mg(0.1335mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(51)得79.7mg(92％)纯标题化合物，直接用于下步反应。

实施例55 HClAsp(OBzl)-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物55)的合成

采用实施例4的操作，由100mg(0.1255mmol)BocAsp(OBzl)-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(52)得80.3mg(94％)纯标题化合物，直接用于下步反应。

实施例56 HCl·H-Gly-OCH₃(化合物56)的合成

25ml无水甲醇冷却到-10℃，搅拌下慢慢加入6.5mlSOCl₂，10分钟后，加入2g甘氨酸。室温反应2天后，减压浓缩，再加入12ml甲醇，反复浓缩二次。用甲醇重结晶。得产品2.75g(95％)。

实施例57 BocArg(NO₂)-Gly-OCH₃(化合物57)的合成

500mg(1.5660mmol)BocArg(NO₂)OH溶解在7ml无水THF中，冰盐浴下加入0.1863ml(1.5660mmol)NMM，几分钟后，加入氯丁酸异丁酯0.295ml(1.879mmol)，几分钟后再加入225mg(1.5660mmol)化合物(56)和0.1863ml(1.5660mmol)NMM的无水THF溶液。3小时后停反应，常规处理，得525.6mg(86％)纯标题产品，为无色粉末。

实施例58 BocArg(NO₂)-Gly-OH(化合物58)的合成

采用实施例36的操作，由200mg(0.4935mmol)BocArg(NO₂)-Gly-OCH₃(57)得151mg(81％)纯标题产品，为无色粉末。Rf＝0.21(C)。

实施例59 BocArg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物59)的合成

采用实施例3的操作，由100mg(0.2650mmol)BocArg(NO₂)-Gly-OH和202mg(0.2650mmol)HClAsp(OBzl)-Ser(Bzl)-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(53)得204mg(71％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.23(C)。FAB-MS(m/e)：1085.3[M+H]⁺

实施例60 BocArg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物60)的合成

采用实施例3的操作，由50mg(0.1335mmol)BocArg(NO₂)-Gly-OH和92mg(0.1335mmol)HClAsp(OBzl)-Val-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(54)得93.4mg(69.5％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.20(C)。FAB-MS(m/e)：1007.6[M+H]⁺。

实施例61 BocArg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(化合物61)的合成

采用实施例3的操作，由46mg(0.1255mmol)BocArg(NO₂)-Gly-OH和89.8mg(0.1255mmol)HClAsp(OBzl)-Phe-3-肼基亚甲氧基-雌二醇(55)得92.6mg(70％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.27(C)。FAB-MS(m/e)：1055.5[M+H]⁺。

实施例62 3-乙氧羰亚甲氧基-雌酮(化合物62)

采用实施例35的操作，由500mg(1.8491mmol)雌酮和0.750ml(5.5mmol)溴乙酸乙酯得593mg(90％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.53(E)，mp98-100℃，[a]²⁰_D＝+138°(c＝0.5，THF)，FAB-MS(m/e)357.3[M+H]⁺.

实施例63 3-羧亚甲氧基雌酮(化合物63)的合成

采用实施例36的操作，由500mg(1.4025mmol)3-乙氧羰亚甲氧基-雌酮(62)溶于3ml无水乙醇中，冰浴下滴加适量2NNaOH水溶液，室温反应2.5小时后，薄层检测原料点消失，加适量KHSO₄固体使反应液pH＝7，真空浓缩干有机溶剂后，补加少量水，再用适量KHSO₄固体使反应液pH＝2，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩至干，得442mg(96％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.42(B)。mp 214-215℃；[a]²⁰_D＝+159°(c＝0.45，THF)，FAB-MS(m/e)329.3[M+H]⁺

实施例64 N-(雌酮-3-氧乙酰基)Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(化合物64)的合成

50mg(0.1514mmol)3-羧亚甲氧基雌酮(63)和20mg(0.1514mmol)HoBt，溶于1ml无水THF中，冰浴下加入33mg(0.1514mmol)的DCC，30分钟后将反应液加入到119mg(0.1514mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(8)的无水THF溶液中，并用NMM维持反应液的pH＝8左右。室温反应8小时后，薄层分析原料点基本消失，常规处理，粗品经柱层析分离纯化(氯仿/甲醇，10/1)，得99mg(62％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.47(C)。mp133-135℃，[a]²⁰_D＝+32°(c＝0.5，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，FAB-MS(m/e)1059.6[M]⁺.

实施例65 N-(雌酮-3-氧乙酰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(化合物65)的合成

50mg(0.1514mmol)3-羧亚甲氧基雌酮(63)和20mg(0.1514mmol)HoBt，溶于1ml无水THF中，冰浴下加入33mg(0.1514mmol)的DCC，30分钟后将反应液加入到107mg(0.1514mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(17)的无水THF溶液中，并用NMM维持反应液的pH＝8左右。室温反应8小时后，薄层分析原料点基本消失，常规处理，粗品经柱层析分离纯化(氯仿/甲醇，10/1)，得101mg(68％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.56(C)。mp124-126℃[a]²⁰_D＝+26°(c＝0.5，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，FAB-MS(m/e)981.5[M+H]⁺

实施例66 N-(雌酮-3-氧乙酰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(化合物66)的合成

50mg(0.1514mmol)3-羧亚甲氧基雌酮(63)和20mg(0.1514mmol)HoBt，溶于1ml无水THF中，冰浴下加入33mg(0.1514mmol)的DCC，30分钟后将反应液加入到119mg(0.1514mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(26)的无水THF溶液中，并用NMM维持反应液的pH＝8左右。室温反应8小时后，薄层分析原料点基本消失，常规处理，粗品经柱层析分离纯化(氯仿/甲醇，10/1)，得110mg(70.3％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.57(C)。mp130-132℃，[a]²⁰_D＝+28°(c＝0.5，CHCl₃∶MeOH＝10∶1)，FAB-MS(m/e)1028.5[M-H]⁺.

实施例67 N-(雌酮-3-氧乙酰基)Arg-Gly-Asp-Ser-OH(化合物67)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.0944mmol)N-(雌酮-3-氧乙酰基)Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl(64)得40mg(57％)目标化合物，为无色粉末。Rf＝0.55(D)，mp170-172℃，[a]²⁰_D＝+55°(c＝1，MeOH)，FAB-MS：743.5[M]⁺¹HNMR(ppm)δ0.827(s，3H，18-CH₃)；4.534(s，2H，3-O-CH₂)；6.646(s，1H，4-H)；6.700(d，1H，2-H)；7.174(d，1H，1-H)；

实施例68 N-(雌酮-3-氧乙酰基)Arg-Gly-Asp-Val-OH(化合物68)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.1020mmol)N-(雌酮-3-氧乙酰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(65)得58.5mg(76％)目标化合物，为无色粉末。，Rf＝0.60(D)，mp164-166℃，[a]²⁰_D＝+44°(c＝0.5，MeOH)FAB-MS：756.3[M+H]⁺¹HNMR(ppm)δ0.747(d，6H，Val-2CH₃)；0.829(s，3H，18-CH₃)；4.531(s，2H，3-O-CH₂)；6.640(s，1H，4-H)；6.700(d，1H，2-H)；7.171(d，1H，1-H)；

实施例69 N-(雌酮-3-氧乙酰基)-Arg-Gly-Asp-Phe-OH(化合物69)的合成

采用实施例9的操作，由100mg(0.09713mmol)N-(雌酮-3-氧乙酰基)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(66)得43.7mg(56％)目标化合物，为无色粉末。Rf＝0.53(D)，mp167-169℃，[a]²⁰_D＝+32°(c＝0.5，MeOH)，FAB-MS：803.2[M]⁺¹HNMR(ppm)δ0.810(s，3H，18-CH₃)；4.548(3-O-CH₂)；6.653(s，1H，4-H)；6.708(d，1H，2-H)；7.092(d，1H，1-H)；7.113(m，1H，aromatic H of Phe)；7.129(m，2H，aromatic H of Phe)；7.151(m，2H，aromatic H of Phe)；9.045(s，1H，3-OH)

实施例70 17-肼基雌酮(化合物70)的合成

100mg(0.37mmol)雌酮溶于0.5ml1，4-二氧六环中，加热至60℃，再加入1ml80％水合肼，60℃下反应4小时后，置冰箱中冷却，过滤收集析出的固体物质。得产品98mg(93％)标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.52(B)，mp.240(dec)，[a]²⁰_D＝+102°(C＝1，DMF).EI-MS(m/e)284[M]⁺.

实施例71 H-Asp(OBzl)-OH(化合物71)的合成

将新蒸的苄醇(50ml)加入到无水乙醚(50ml)和浓硫酸(5ml)的混合溶液中，真空抽净乙醚后，搅拌下分批加入天冬氨酸(6.7g，50mmol)。室温反应24小时后，用100ml95％的乙醇稀释反应液，再在剧烈搅拌情况下滴加25ml吡啶中和反应液。反应混合液置冰箱中过夜。过滤收集析出的固体。用乙醚充分泡洗。用含吡啶的热水重结晶。得4.5g(40％)标题化合物，为无色粉末。mp.218-220℃。[a]²⁰_D＝+28°(C＝1，HCl)

实施例72 BocGlyONp(化合物72)的合成

采用实施例3的操作，由500mg(2.8571mmol)BocGlyOH和405mg(2.9142mmol)HONP，得835mg(98.8％)纯标题化合物，为浅黄色固体，Rf＝0.64(F)。

实施例73 BocGly-Asp(OBzl)-OH(化合物73)的合成

A)230mg(0.7770mmol)化合物(72)溶于2mlTHF中；B)用少量水溶解174mg(0.7770mmol)化合物(71)和65mg(0.7770mmol)NaHCO₃.将A反应液加入到B反应液中，室温反应24小时后，反应过程中补加些NMM使反应pH维持在弱碱性。反应结束后真空浓缩干有机溶剂，加少量水溶解残留物，用乙醚先萃取几次，水层用固体KHSO₄酸化至pH＝2，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩干滤液，得269mg(91％)标题化合物，为无色固体。

实施例74 17-Boc-Ser(Bzl)-肼基雌酮(化合物74)的合成

采用实施例3的操作，由300mg(1.016mmol)BocSer(Bzl)OH和17-肼基雌酮(70)得455.5mg(79.9％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.51(B)。FAB-MS(m/e)562.4[M+H]⁺.mp 127-129℃.

实施例75 17-Boc-Val-肼基雌酮(化合物75)的合成

采用实施例3的操作，由400mg(1.8433mmol)BocValOH和523.5mg(1.8433mmol)17-肼基雌酮(70)得643mg(72.5％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.50(B)。mp131-133℃，FAB-MS(m/e)483.7[M+H]⁺.

实施例76 17-Boc-Phe-肼基雌酮(化合物76)的合成

采用实施例3的操作，由234mg(0.8805mmol)BocPheOH和250mg(0.8805mmol)17-肼基雌酮(70)得433mg(92.5％)纯标题化合物，为无色粉末。Rf＝0.62(B)。mp 125-127℃.FAB-MS(m/e)531.7[M+H]⁺。

实施例77 17-Ser(Bzl)-肼基雌酮盐酸盐(化合物77)的合成

采用实施例4的操作，由179mg(0.3189mmol)17-Boc-Ser(Bzl)-肼基雌酮(74)得154mg(97％)纯标题化合物，为无色粉末，直接用于下步反应。

实施例78 17-Val-肼基雌酮盐酸盐(化合物78)的合成

采用实施例4的操作，由150mg(0.3106mmol)7-Boc-Val-肼基雌酮(75)得122.4mg(94％)纯标题化合物，为无色粉末，直接用于下步反应。

实施例79 17-Phe-肼基雌酮盐酸盐(化合物79)的合成

采用实施例4的操作，由178mg(0.3350mmol)17-Boc-Phe-肼基雌酮(76)得150.3mg(96％)纯标题化合物，为无色粉末，直接用于下步反应。

实施例80 17-Boc-Gly-Asp(OBzl)Ser(Bzl)-肼基雌酮(化合物80)的合成

采用实施例3的操作，由121mg(0.3189mmol)BocGly-Asp(OBzl)-OH(73)和154mg(0.3095mmol)17-Ser(Bzl)-肼基雌酮盐酸盐(77)得223mg(85％)标题化合物，为无色粉末。

实施例81 17-Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-肼基雌酮(化合物81)的合成

采用实施例3的操作，由118mg(0.3106mmol)BocGly-Asp(OBzl)-OH(73)和122.4mg(0.2920mmol)17-Val-肼基雌酮盐酸盐(78)得213mg(92％)标题化合物，为无色粉末。

实施例82 17-Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-肼基雌酮(化合物82)的合成

采用实施例3的操作，由127mg(0.3350mmol)BocGly-Asp(OBzl)-OH(73)和150.3mg(0.3217mmol)17-Phe-肼基雌酮盐酸盐(79)得242.6mg(91.3％)标题化合物。ESI-TOF(m/e)794.6[M+H]⁺，816.6[M+Na]⁺

实施例83 17-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-肼基雌酮盐酸盐(化合物83)的合成

采用实施例4的操作，由100mg(0.1214mmol)17-Boc-Gly-Asp(OBzl)Ser(Bzl)-肼基雌酮(80)得86.9mg(94％)标题化合物，为无色固体，直接用于下步反应。

实施例84 17-Gly-Asp(OBzl)-Val-肼基雌酮盐酸盐(化合物84)的合成

采用实施例4的操作，由100mg(0.1342mmol)17-Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-肼基雌酮(81)得85.7mg(93.5％)标题化合物，为无色固体，直接用于下步反应。

实施例85 17-Gly-Asp(OBzl)-Phe-肼基雌酮盐酸盐(化合物85)的合成

采用实施例4的操作，由61mg(0.07688mmol)17-Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-肼基雌酮(82)得51.7mg(92％)标题化合物，，直接用于下步反应。

实施例86 17-Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-肼基雌酮(化合物86)的合成

采用实施例3的操作，由39mg(0.1214mmol)BocArg(NO₂)OH和92.3mg(0.1214mmol)17-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-肼基雌酮盐酸盐(83)得84.6mg(68％)标题化合物，为无色固体。Rf＝0.43(C)。FAB-MS(m/e)1026[M+H]⁺.

实施例87 17-Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-肼基雌酮(化合物87)的合成

采用实施例3的操作，由43mg(0.1342mmol)BocArg(NO₂)OH和91.6mg(0.1342mmol)17-Gly-Asp(OBzl)-Val-肼基雌酮盐酸盐(84)得92.7mg(73％)标题化合物。mp137-139℃，FAB-MS(m/e)947.4[M+H]⁺

实施例88 17-Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe--肼基雌酮(化合物88)的合成

采用实施例3的操作，由25mg(0.07688mmol)BocArg(NO₂)OH和56.2mg(0.07688mmol)17-Gly-Asp(OBzl)-Phe-肼基雌酮盐酸盐(85)得61mg(80％)标题化合物。ESI-TOF(m/e)995.7[M+H]⁺，1017.7[M+Na]⁺.

试验例1本发明化合物的抗骨质疏松活性试验

一、材料和试剂

1、供试样品：本发明实施例9、18、27、67、68、69、32、33、34、40、41和42所制备的相应化合物9、18、27、67、68、69、32、33、34、40、41和42。

2、阳性对照药物：雌二醇、雌酮。

3、实验动物：7周龄的昆明种雌小鼠，体重30.7±3.1g，由北京大学医学部动物部提供。

4、试剂配制：

1)称取32.5mg邻甲酚酞络合酮(OCPC)，1.1g8-羟基喹啉，加水250ml，加浓盐酸7.5ml，充分搅拌溶解后，加超纯水至500ml得OCPC试液。量取二乙胺21ml加超纯水稀释至500ml得二乙胺试液。

2)精密称取新烘干的无水碳酸钙2.5g，加超纯水100ml，滴加浓盐酸5ml，稀释至1000ml得钙标准液(1mg/ml)。

3)称取三氯醋酸50g，硫脲5g，用300ml超纯水溶解，再加入硫酸亚铁铵20g，使溶解，稀释至500ml得亚铁-三氯醋酸试剂。

4)缓慢加入浓硫酸45ml至200ml冷超纯水中，边加边搅拌，冷却至室温，称取钼酸铵22g，溶于200ml超纯水中，与硫酸溶液混和并稀释至500ml得钼酸铵试剂。

5)称取无水磷酸二氢钾109.9mg，溶于500ml超纯水中，加2ml氯仿防腐得磷标准液(50mg/L)。

6)称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于1000ml超纯水中得碳酸盐缓冲液(pH＝10)，在棕色瓶中保存。

7)先煮沸超纯水500ml，消灭微生物，迅速加入磷酸苯二钠(含两分子结晶水)2.54g，冷却后，加入2ml氯仿防腐得磷酸苯二钠底物液(20mmol/L)，冰箱保存。

8)称取铁氰化钾2.5g溶于400ml超纯水中，称取硼酸17g溶于400ml超纯水中，混合两液，稀释至1000ml得铁氰化钾溶液，置棕色瓶中避光保存。

9)精密称取50mg苯酚，超纯水稀释至1000ml得酚标准溶液的配制(0.05g/L)。

10)称取牛血清白蛋白0.5g，加超纯水20ml混匀，于56℃水浴中保温1小时，取出放冷，置冰箱中速冻备用。临用前将备用液37℃水浴融化，倒入含有5g醋酸钠的水溶液中，再加浓盐酸3.5ml，超纯水稀释至500ml，测pH＝4.0为血清对照品。

二、试验方法及结果

将192只7周龄雌性昆明种小鼠随机分为16组，即卵巢切除组(OVX)、假手术组(sham)、卵巢切除+17β-雌二醇治疗组、卵巢切除+雌酮组、卵巢切除+化合物8治疗组、卵巢切除+化合物17治疗组、卵巢切除+化合物26治疗组、卵巢切除+化合物67治疗组、卵巢切除+化合物68治疗组、卵巢切除+化合物69治疗组、卵巢切除+化合物32治疗组、卵巢切除+化合物33治疗组、卵巢切除+化合物34治疗组、卵巢切除+化合物40治疗组、卵巢切除+化合物41治疗组、卵巢切除+化合物42治疗组。

用2％的戊巴比妥钠按40mg/Kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠，剪开小鼠腹腔，找到两侧的输卵管，在两侧输卵管的盲端找到卵巢，去除小鼠双侧卵巢，结扎输卵管(手术过程中如果小鼠苏醒过来，则用棉花蘸取适量无水乙醚置于小鼠的鼻子处使之麻醉)。结扎好后，滴加几滴青霉素至小鼠腹腔，再将小鼠腹腔缝合好，于伤口外面涂上适量0.1％苯扎溴铵消毒液，以避免伤口感染。

术后5天开始给药。卵巢切除组和假手术组每天腹腔注射空白溶液(5‰羧甲基纤维素水溶液)，其它组每天腹腔注射一次药物(剂量为0.1103μmol/Kg)。给药四周后，称体重，小鼠摘除眼球取血处死，静置30min后，3000g/分离心20min，得血清，于-20℃保存。用邻甲酚酞络合酮法测定血钙含量，用钼蓝法测定血磷含量，用磷酸苯二钠为底物测定碱性磷酸酶(ALP)的含量。分离小鼠的肺、肝、脾、子宫，得它们的净重。取小鼠左侧股骨，剔除干净肌肉组织，用游标卡尺测定股骨的解剖长度，即双踝长度。然后再用氯仿∶甲醇(2∶1)浸泡两次(每次3小时)，进行脱脂。将脱脂后的股骨置于120℃烘箱中6小时，冷却后称干重。将已测定干重的股骨，置于800℃马福炉中煅烧8小时，冷却后称灰重。计算灰重与干重的比值(g/g)，得到骨矿含量(BMC)。将已灰化的股骨用0.5ml 6N的盐酸溶解，超纯水稀释至5ml，再取0.05ml该溶液，稀释至1ml，备用。

血钙测定

按表1进行操作。摇匀后，用721型紫外可见分光光度计在570nm处测定吸收度，在钙标准曲线上找到相应的钙离子浓度。将配制的钙标准液稀释至2.5mg/ml，3.0mg/ml，3.5mg/ml，4.0mg/ml，4.5mg/ml，5.0mg/ml，5.5mg/ml，6.0mg/ml，8.0mg/ml。用邻甲酚酞络合酮法测定570nm的吸收度，绘制标准曲线。

表1邻甲酚酞络合酮法测定血清钙离子浓度^*

  试剂  对照管  测定管  血清  钙显色剂  血清对照品  -  4ml  50μl  50μl  4ml  -

^*血钙浓度(mmol/L)＝0.5*测定钙离子浓度血磷测定

按表2进行操作。摇匀后，用721型紫外可见分光光度计在660nm测定吸收度。

             表2硫酸亚铁链法测定血磷含量^*

  试剂(ml)  U(测定管)  S(标准管)  B(空白管)  血清  50mg/L磷标准液  超纯水  亚铁-三氯醋酸试   剂  0.2ml  -  -   4.8ml   -  0.2ml  -  4.8ml    -  -  0.2ml   4.8ml               混匀，静置10分钟，离心沉淀10分钟  上清液  4.0ml  钼酸铵试剂    0.5ml  4.0ml   0.5ml  4.0ml   0.5ml

血清无机磷(mmol/L)＝Au×1.615/As

血清碱性磷酸酶测定

按表3进行操作。摇匀后，以蒸馏水调零点，用721型紫外可见分光光度计在510nm处测定吸收度。以(A_U-A_C)差值查酚标准曲线，求出酶活力单位。

    表3比色法测定血清碱性磷酸酶(金氏单位)^*

  试剂  测定管(A_U)  对照管(A_C)  血清  磷酸盐缓冲液   预温37℃的底物溶   液   铁氰化钾溶液  血清对照品  0.1ml  1.0ml    1.0ml    3.0ml  -  -  1.0ml  37℃水浴5min   1.0ml   37℃水浴15min   0.1ml

                                          表4酚标准曲线的测定

  试剂  B  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  酚标准液(μl)  超纯水(ml)  碳酸盐缓冲液(ml)  -  1.1  1.0  2  1.098  1.0  5  1.095  1.0  8  1.09  1.0  10  21.09  1.0  12  1.088  1.0  15  1.085  1.0  18  1.082  1.0  20  1.08  1.0  22  1.078  1.0  25  1.075  1.0                                                                        37℃水浴5min  铁氰化钾溶液(ml)  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0  3.0

骨钙测定

按表5进行操作。摇匀后，用721型紫外可见分光光度计在570nm处测定吸收度，在钙标准曲线上找到相应的钙离子浓度。

表5邻甲酚酞络合酮法测定骨钙含量^*

  试剂  对照管  测定管  溶液H  钙显色剂  超纯水  -  4ml  50μl  50μl  4ml  -

^*骨钙含量＝2*测定钙浓度/骨灰重

骨磷测定

按表6进行操作。摇匀后，用721型紫外可见分光光度计在660nm处测  定吸收度。

                  表6硫酸亚铁铵法测定骨磷含量^*

  试剂(ml)  U(测定管)  S(标准管)  B(空白管)  溶液H  磷标准溶液  超纯水  亚铁-三氯醋酸试剂  钼酸铵试剂  0.2ml  -  -  4.8ml  0.625ml  -  0.2ml  -  4.8ml  0.625ml  -  -  0.2ml  4.8ml  0.625ml

^*骨磷含量＝5*A_U/A_S*骨灰重

腹腔注射给药的治疗结果

每天腹腔注射本发明的化合物1次(剂量为0.1103μmol/Kg)，连续治疗4周，测定的结果列入表7-10。

               表7治疗前后小鼠的体重

  组别  初体重(g)  终体重(g)  卵巢切除组  假手术组  雌二醇  雌酮  9  18  27  67  68  69  32  33  34  40  41  42  31.1±2.2  30.0±1.5  31.0±2.6  30.4±2.5  30.7±2.5  30.3±1.5  29.8±1.7  29.9±1.9  30.3±2.1  30.4±2.2  30.3±1.8  30.4±1.9  29.8±2.9  30.9±1.5  30.5±2.6  30.1±2.0  37.2±2.6  34.5±2.9^a  36.1±2.3^h  34.3±2.1^a  34.0±3.4^a  33.4±2.5^d  33.3±1.8^d  32.9±2.2^d，h  34.1±2.6^a  34.5±2.8^a  35.8±2.7^a  34.5±2.8^a  34.8±2.7^a  35.2±1.6^a  35.2±2.5^a  33.1±1.9^d

a)与卵巢切除组比，P＜0.05；b)与雌二醇组比，P＜0.05；c)与雌酮组比，

P＜0.05；d)与卵巢切除组比，P＜0.01；e)与雌二醇组比，P＜0.01；

f)与雌酮组比，P＜0.01；g)与假手术组比，P＜0.01；h)与假手术组比，P＜0.05；n＝12

表7表明治疗各组的最终体重都比初始体重明显增大。所有组的初始体重之间都没有差异。假手术组与模型对照组相比最终体重明显大、其它各组最终体重与模型对照组最终体重明显小。与假手术组相比，雌二醇组最终体重体重明显大、化合物67组的最终体重明显小、其它各组的最终体重与假手术组最终体重相当。

                             表8小鼠的肺、肝、脾及其子宫重量

  组别  肺重(g)  肝重(g) 脾重(g)  子宫重(g)  卵巢切   除组  假手术  组  雌二醇  雌酮  9  18  27  67  68  69  32  33  34  40  41  42   0.163±0.0231   0.184±0.0277   0.168±0.0308  0.176±0.0259  0.168±0.0227  0.171±0.0259  0.163±0.0177  0.173±0.0164  0.0168±0.0107  0.179±0.0160  0.151±0.0188  0.167±0.0279  0.184±0.0245^a  0.173±0.0201  0.182±0.019^a  0.169±0.0303  1.329±0.156^e    1.367±0.198^b   1.565±0.199^a，h  1.318±0.113^d，e  1.295±0.186^e  1.15±0.110^{a，f，g，e}  1.413±0.122^b  1.347±0.146^e  1.389±0.139^b，c  1.458±0.199^b  1.371±0.178^b  1.353±0.221^b  1.391±0.129^b  1.377±0.185^b  1.363±0.133^e  1.395±0.160^b 0.130±0.0319   0.151±0.041  0.151±0.0357 0.156±0.0510 0.138±0.0376 0.127±0.033 0.114±0.025^{a，e，f，g} 0.123±0.026^b 0.131±0.037 0.143±0.041 0.130±0.037 0.143±0.067 0.142±0.032 0.124±0.036 0.132±0.045 0.131±0.034  0.0390±0.0249^e，f，g    0.0915±0.0301^d，e，f   0.177±0.0436^c，d，g  0.141±0.0457^g  0.0710±0.0522  0.0611±0.0287^a，h  0.0698±0.0419^d  0.0633±0.0434^f  0.0519±0.0320^g，f  0.0558±0.0326^h，f  0.0555±0.0344^h，e  0.0694±0.0336^a，e  0.0710±0.0260^d，e  0.0425±0.0187^e，g  0.0503±0.0311^e，g  0.0554±0.0288^e，g

a)与卵巢切除组比，P＜0.05；b)与雌二醇组比，P＜0.05；c)与雌酮组比，P＜0.05；d)与卵巢切除组比，P＜0.01；e)与雌二醇组比，P＜0.01；f)与雌酮组比，P＜0.01；g)与假手术组比，P＜0.01；h)与假手术组比，P＜0.05；n＝12

从表8可以看出，治疗后各组小鼠的肺和脾重量无明显差异。与假手术组及模型对照组相比，雌二醇治疗组小鼠的肝重量明显大，P＜0.05。其它组小鼠肝重和假手术组及模型对照组相比差异不明显。化合物67、68、69、32、33、34、40、41和42治疗组小鼠的肝重量明显小于雌二醇组。提示，使用雌二醇治疗时有可能引起脂肪肝。

从小鼠子宫重量可以看出，雌二醇和雌酮治疗组小鼠的子宫重量明显大于假手术组，P＜0.01，雌二醇和雌酮治疗有明显的子宫增生现象。其它组子宫重量呈现不同程度小于雌二醇和雌酮组。模型对照组的小鼠子宫重量明显小于假手术组，P＜0.01，提示去势小鼠的子宫明显萎缩。与模型对照组一样，67、68、69、32、33、34、40、41和42治疗组小鼠子宫也明显萎缩。提示，本发明的化合物不会引起子宫增生。

                表9小鼠股骨干重、灰重、骨长、骨矿含量及灰重/骨长

  组别  股骨干重(g)  灰重(g)  骨矿含量  骨长(cm)  灰重/骨长(g/cm)  卵巢切  除组   假手术   组   雌二醇    雌酮  9   18   27   67   68   69   32   33   34   40   41   42   0.0585±     0.00394^g  0.0740±    0.00832^d   0.0577±     0.00696^g  0.0611±    0.00587^g  0.0598±    0.00465^g  0.0588±    0.00465^h  0.0620±    0.00949^g  0.0669±    0.00570^c，d，h  0.0639±    0.00710^a，h  0.0657±    0.00637^d，h  0.0664±    0.00538^d，e，g  0.0573±    0.00368^g  0.0660±    0.00548^d，e，h  0.0634±    0.00739^b，g  0.0637±    0.00627^a，d，g  0.0612±    0.00532^g  0.0178±    0.00217^g   0.0429±    0.00483^d   0.0285±    0.00680^d，g   0.0208±    0.00430^a，g  0.0178±    0.00406^g  0.0188±    0.00353^g  0.0205±    0.00743^g  0.0226±    0.00297^d，g  0.0213±    0.00632^g  0.0238±    0.00453^d，c，g  0.0344±    0.00565^d，b，g  0.0358±    0.00313^d，e，g  0.0348±    0.00467^b，d，g  0.0370±    0.00625^d，e，h  0.0400±    0.00481^d，e  0.0358±    0.00437^d，e，g  0.304±    0.0272^g   0.587±    0.0922^d   0.496±    0.0945^d，h   0.330±    0.0522^e，g  0.296±    0.0460^g  0.314±    0.0411^g  0.323±    0.0685^g  0.338±    0.0388^a，g  0.329±    0.0687^g  0.362±    0.0510^d，g  0.520±    0.0819^d  0.625±    0.0399^d，e  0.533±    0.0921^d  0.582±    0.0512^b，d  0.630±    0.0690^d，e  0.585±    0.0555^b，d  1.597±    0.0390^g   1.646±    0.0438^d   1.628±    0.0346   1.606±    0.0317^h  1.617±    0.0397  1.614±    0.0455  1.623±    0.0343  1.614±    0.0559  1.626±    0.0609  1.639±    0.0456^a  1.634±    0.0358^a  1.615±    0.0490  1.635±    0.0273^a  1.642±    0.0500  1.640±    0.0306^d  1.623±    0.0474  0.0112±0.00148^g    0.0261±0.00295^d    0.0175±0.00420^d，g    0.0130±0.00280^e，g   0.0110±0.00259^e，g   0.0115±0.00222^e，g   0.0126±0.00439^b，g   0.0140±0.00202^d，g   0.0132±0.00423^g   0.0145±0.00281^d，g   0.0210±0.00329^b，d，g   0.0222±0.00220^d，e，g   0.0213±0.00291^b，d，g   0.0226±0.00405^d，e，h   0.0243±0.00286^d，e   0.0220±0.00270^d，e，g 

a)与卵巢切除组比，P＜0.05；b)与雌二醇组比，P＜0.05；c)与雌酮组比，P＜0.05；d)与卵巢切除组比，P＜0.01；e)与雌二醇组比，P＜0.01；f)与雌酮组比，P＜0.01；g)与假手术组比，P＜0.01；h)与假手术组比，P＜0.05；n＝12

小鼠股骨干重、灰重、骨长、骨矿含量及灰重/骨长见表9。从表9可以看出，模型对照组股骨干重明显小于假手术组。提示，去势小鼠明显丢失骨量。其它组股骨干重明显大于模型对照组，其中化合物68、67、69、32、34、41治疗组小鼠的股骨干重增加非常明显大于模型对照组股骨干重，P＜0.01。可见，本发明的化合物和雌二醇及雌酮可以预防骨质疏松。与假手术组相比，各组小鼠股骨干重明显小。其中模型对照组、雌二醇组、雌酮组、化合物9、27、32、33、40、41和42治疗组小鼠的股骨干重非常明显小于假手术组，P＜0.01，化合物17、67、68、69和34治疗组小鼠的股骨干重明显小于假手术组，P＜0.05。可见，本发明的化合物和雌二醇及雌酮不能逆转骨质疏松。与雌二醇治疗组相比，化合物32和34治疗组小鼠的股骨干重显著大(P＜0.05)，可见，本发明的化合物32和34比雌二醇及雌酮优秀。

从表9的小鼠股骨灰重可以看出，除化合物9、18、27、68外，各治疗组小鼠股骨的灰重均不同程度大于模型对照组(P＜0.05-0.01)。除化合物41治疗组小鼠股骨灰重和假手术组没有显著性差异外，其它各组小鼠股骨的灰重均有不同程度小于假手术组。化合物32、34组小鼠股骨灰重明显大于雌二醇组，P＜0.05，化合物33、40、41、42治疗组小鼠股骨灰重非常明显大于雌二醇组，P＜0.01。可见，本发明的化合物32、33、34、40、41、和42比雌二醇及雌酮优秀。

从表9小鼠骨矿含量(BMC)可以看出，模型对照组的BMC明显低于假手术组。说明模型对照组小鼠明显骨质疏松。与模型对照组相比，雌二醇组、化合物69、32、33、34、40、41和42的BMC非常明显高，P＜0.01，化合物67治疗组小鼠的BMC显著高，P＜0.05。雌酮、化合物9、18、27和68治疗组小鼠的BMC与模型对照组相当。除化合物33和41治疗组小鼠BMC外，其余各组小鼠BMC均不同程度低于假手术组，其中模型对照组、雌酮组、化合物9、18、27、68、69治疗组小鼠BMC非常显著低于假手术组，P＜0.01，雌二醇组显著低于假手术组，化合物32、33、34、40、41和42治疗组小鼠BMC和假手术组之间没有显著性差异，分别与正常值接近或相当。可见，本发明的化合物显示明确的抗骨质疏松作用。

表9中小鼠的灰重与股骨长度的比值说明，与假手术组相比模型对照组小鼠的灰重/骨长的比值明显小。雌二醇组、化合物67、69、32、33、34、40、41和42治疗组小鼠的灰重/骨长的比值则明显大于模型对照组，P＜0.01，其余各组与模型对照组相当。化合物41治疗组小鼠的灰重/骨长的比值与假手术组相当，接近正常值。化合物40治疗组小鼠的灰重/骨长的比值显著小于假手术组，P＜0.05。其余各组小鼠的灰重/骨长的比值非常显著小于假手术组，P＜0.01。除化合物32、33、34、40、41和42治疗组小鼠的灰重/骨长的比值显著大于雌二醇组治疗组外，其余各治疗组小鼠灰重/骨长的比值显著小于雌二醇组。

表9的数据明确地显示本发明的化合物不仅有良好的抗骨质疏松作用，其中32、33、34、40、41和42的抗骨质疏松作用明显优于雌二醇和雌酮，而且都未观察到子宫增生副作用。

表10说明，与假手术组相比模型组小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)活性明显高，说明模型对照组小鼠的骨转换作用较强。雌二醇组、化合物68、69、32、33、34、40、41和42组小鼠ALP活性非常显著低于模型对照组，P＜0.01。雌酮、化合物27和67组小鼠ALP活性显著低于模型对照组，P＜0.05。除化合物9和18组小鼠ALP水平显著高于假手术组和化合物33和41组小鼠ALP水平显著低于假手术组外，其它组与假手术组相当。这些数据说明，经本发明的化合物治疗后小鼠的骨转换作用或者降低或者接近正常。

             表10.治疗后的骨钙、骨磷、血钙、血磷和ALP

  组别  骨钙(％)   骨磷(％)   血钙  (mmol/L)  血磷(mmol/L)   ALP   卵巢切除  组  假手术组   雌二醇   雌酮  39.545±  2.551 53.213±  2.365^d 54.466±  3.0413^d 43.84±  2.659^d，g，e  22.951±    1.960^g  24.811±    1.049^d  24.695±    2.307  23.979±    1.087  2.015±    0.0545  2.064±    0.0783  2.020±    0.0382  2.050±    0.0175  1.601±    0.00268  1.602±    0.00519  1.601±    0.00521  1.601±    0.00417  40.086±    2.884^e，g  34.171±3.341^d   31.286±1.733^d   36.271±    3.228^a，e  9   18   27   67   68   69   32   33   34   40   41   42   39.48±    2.331^，g，e，f  40.139±    1.816^g，e，f  37.815±    1.792^g，e，f  41.61±    1.891^{a，g，e，c}  41.173±    1.772^g，e  39.550±    2.436^g，e  51.312±    2.602^d，b，  53.078±    2.349^d，f  52.798±    1.376^d，f  54.885±    1.668^d  58.35±    0.926^d，g，e  56.69±    1.474^d，g，b  22.888±    2.059^h  22. O759±    2.267^h  23.585±    2.284  23.279±    2.910  23.759±    1.923  23.288±    1.920  24.920±    1.623^a  24.867±    2.536  24.665±    3.069  24.949±    2.221^a  24.991±    2.338^a  25.460±    3.265^a  2.020±    0.0417  2.015±    0.0181  2.005±    0.0324  2.000±    0.0284  2.010±    0.0179  2.010±    0.0344  2.022±    0.0271  2.075±    0.0258  2.005±    0.0258  2.014±    0.0347  2.005±    0.0270  2.015±0.016   1.603±    0.00371  1.605±    0.00669  1.599±    0.00733  1.604±    0.00268  1.602±    0.00560  1.602±    0.00315  1.602±    0.00385  1.605±    0.00405  1.605±    0.00498  1.599±    0.00487  1.600±    0.00492  1.605±    0.00537  37.643±    1.787^e，h  38.614±    1.486g，e  35.643±2.756^a   36.371±    1.910^a，e  36.229±    1.467^d，e  35.857±    2.337^d，e  32.771±2.050^d   31.057±    0.996^d，h  31.486±1.285^d   31.429±1.837^d   30.514±    1.301^d，h  31.529±1.676^d 

a)与卵巢切除组比，P＜0.05；b)与雌二醇组比，P＜0.05；c)与雌酮组比，P＜0.05；d)与卵巢切除组比，P＜0.01；e)与雌二醇组比，P＜0.01；f)与雌酮组比，P＜0.01；g)与假手术组比，P＜0.01；h)与假手术组比，P＜0.05；n＝12

表10还表明，模型对照组小鼠骨钙含量显著低于假手术组。雌二醇、雌酮、化合物67、32、33、34、40、41和42治疗组小鼠骨钙含量非常显著高于模型对照组，P＜0.01-0.05，其余组和模型对照组没有显著差异。与假手术组相比模型对照组、雌酮、化合物9、18、27、67、68和69组小鼠的骨钙含量非常显著性低(P＜0.01)。除化合物32治疗组小鼠的骨钙含量非常显著性低于雌二醇组(P＜0.05)外，其它化合物与雌二醇相当。雌二醇治疗组小鼠的骨钙含量与假手术组相当。

化合物32、40、41和42治疗组小鼠的骨磷含量显著性高于模型对照组(P＜0.05)。模型对照组小鼠的骨磷含量非常显著性低于假手术组。除雌酮和化合物8治疗组小鼠的骨磷含量显著性低于假手术组(P＜0.05)外，其它化合物治疗组与假手术组相当。该结果从另一个角度反映了表发明化合物的抗骨质疏松作用。

本发明化合物口服给药活性

每天灌胃给予本发明的化合物32、33、34、40、41、42以及雌二醇1次(剂量为0.1103μmol/Kg)，连续治疗4周，测定的子宫重量、股骨干重、灰重、骨矿含量、骨长和骨灰重/骨长列入表11-13。

   表11.口服给药后的子宫重量

  组别  子宫重(g)  卵巢切除组  假手术组  雌二醇  32  33  34  40  41  42  0.0390±0.0249  0.0915±0.0301  0.0401±0.0184  0.0367±0.0130  0.0507±0.0319  0.0382±0.0108  0.0432±0.0236  0.0407±0.0196  0.0475±0.0305

                n＝12

表11说明，在本发明使用的口服剂量下化合物32、33、34、40、41、42以及雌二醇都未引起子宫增生副作用。

表12.口服给药后的股骨干重、灰重、骨矿含量、骨长和骨灰重/骨长

  组别  股骨干重  (g)  股骨灰重(g)  BMC  骨长(cm)  骨灰重/骨长  (g/cm)  卵巢切除   雌二醇   32   0.0585±    0.00394  0.0631±    0.00654  0.0688±    0.00642^b  0.0178±    0.00217  0.0222±    0.00423^a  0.0293±    0.00454^b，c  0.304±    0.0272  0.352±    0.0419  0.431±    0.0745^a  1.597±    0.0390  1.622±    0.0447  1.654±    0.0550^b  0.0112±    0.00148  0.0137±    0.00251  0.0177±    0.00309^b，c  33   34   40   41   42   0.0674±    0.00532^b  0.0627±    0.00477  0.0636±    0.00567^a  0.0684±    0.00468^b  0.0571±    0.00715  0.0330±    0.00581^b，d  0.0300±    0.00467^b，c  0.0304±    0.00618^b，c  0.0337±    0.00746^b，d  0.0287±    0.00389^b，c  0.491±    0.0835^b，d  0.481±    0.0774^b，c  0.478±    0.0678^b，c  0.493±    0.0564^b，d  0.503±    0.0521^b，d  1.645±    0.0470^b  1.638±    0.0420^a  1.635±    0.0362^a  1.614±    0.0329  1.626±    0.0296  0.0201±    0.00327^b，d  0.0183±    0.00274^b，d  0.0186±    0.00224^b，d  0.0209±    0.00271^b，d  0.0177±    0.00200^b，c

a)与卵巢切除组比，P＜0.05；b)与卵巢切除组比，P＜0.01；c)与雌酮组比，P＜0.05；d)与雌二醇组比，P＜0.01，n＝12

       表13.口服给药后骨钙、骨磷和碱性磷酸酶

  组别  骨钙(％)  骨磷(％)  ALP  卵巢切除组  雌二醇  32  33  34  40  41  42  39.545±2.551  41.587±2.006^a  44.421±2.014^b  51.423±1.325^b，d  46.678±2.143^b，c  46.479±1.165^b，c  48.365±2.034^b，d  49.357±1.258^b，d  22.951±1.960  23.331±2.154  25.347±2.236^b，d  26.874±1.654^b，d  24.665±3.069^a，c  24.774±2.548^a，c  23.639±2.431^a  24.103±1.897^a  40.086±2.884  36.547±1.879^a  38.435±2.643  33.154±1.784^b，c  36.557±2.031^a  35.209±2.036^a  34.235±1.438^b  33.752±2.586^b，c

a)与卵巢切除组比，P＜0.05；b)与卵巢切除组比，P＜0.01；c)与雌酮组比，P＜0.05；

d)与雌二醇组比，P＜0.01，n＝12

表12和13说明，在本发明使用的口服剂量下化合物32、33、34、40、41、42仍然显示明显的抗骨质疏松作用，雌二醇不显示明显的抗骨质疏松作用。本发明的化合物32、33、34、40、41和42显示的口服抗骨质疏松作用使本发明的化合物具有明确的应用前景。