哺乳动物细胞无载体固定化培养方法

摘要

本发明公开了一种哺乳动物细胞无载体固定化培养方法，包括以下步骤：(1)促使哺乳动物细胞在悬浮培养条件下形成细胞团(2)控制细胞团的平均粒径(3)利用细胞团的自然沉降和旋转过滤器截流细胞团，更换培养基或连续灌注培养基(4)使细胞团松散、解聚(5)使自细胞团解聚的游离细胞再形成细胞团，放大培养规模。本发明的优点在于：①悬浮培养体系中所形成细胞团的形状规则、大小较均一，细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内②细胞团解聚、游离细胞再集聚成团的条件温和、可控③哺乳动物细胞培养的活细胞密度≥1×10

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物细胞无载体固定化培养方法，更具体地说是利用贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中具有聚集、形成细胞团的倾向，不借助细胞固定化介质而实施哺乳动物细胞无载体固定化培养的工艺方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

动物细胞的固定化培养(animal cell immobilization culture)是指在无菌条件下将动物细胞接种于特定的支持物表面或限制在特定的液相空间，模拟机体内生理状态下的基本生存条件，使其在特定的支持物表面或限制在特定的液相空间中生长、增殖的体外培养技术。相对于动物细胞悬浮培养而言，动物细胞固定化培养的技术特征主要表现为：1.易于灌注技术的实施和优化控制细胞培养环境；2.减少或消除高灌注速率下的细胞流失；3.培养体系中的细胞生长密度高；4.单位反应器体积细胞表达产物的产率高。因而，动物细胞固定化培养能有效地实施动物细胞的高密度长期连续灌注培养，提高动物细胞表达产品的生产效率。

根据所采用细胞固定化介质材料和固定化方式的不同，动物细胞固定化培养的方法主要包括微载体培养(microcarrier culture)、巨载体培养(macrocarrier culture)、中空纤维培养(hollow fiber culture)和微囊化培养(microencapsulation)。上述动物细胞固定化培养方法中，巨载体培养需在流化床生物反应器或填充床生物反应器中进行，细胞培养规模不易放大，载体内部可能存在明显的传质限制；中空纤维培养易在反应器内形成培养基成分和代谢产物的浓度梯度，培养规模放大困难；微囊化培养的微囊制备过程繁复、规模放大困难。除此之外，以上三种动物细胞固定化培养均存在细胞采样、观察不便的弊端。

相对于其他形式的动物细胞固定化培养而言，微载体和多孔微载体培养融合细胞悬浮培养和贴壁培养的优点，便于细胞采样、观察，培养规模放大容易，是动物细胞大规模培养中的一项重要的、技术相对成熟的固定化培养技术。由于动物细胞固定化介质增加了细胞培养的成本。因此，无需借助固定化介质而直接利用生物反应器中形成的细胞团实现细胞固定化的无载体固定化培养(carrier-free immobilization culture)被看作降低动物细胞表达产品生产成本的一种技术途径。

贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中悬浮培养具有聚集、形成细胞团的倾向。利用贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中悬浮培养具有聚集、形成细胞团的倾向，通过控制细胞团的粒径分布，可以起到类似于微载体和多孔微载体固定化培养的目的，实施动物细胞的无载体固定化培养，并结合动物细胞培养过程的动态监测和优化控制，实现动物细胞的高密度长期培养及其表达产品的高效生产。与动物细胞的多孔微载体固定化培养相比，无载体固定化不仅节省了购买多孔微载体的动物细胞培养成本，还可通过对培养过程中细胞团的形成和解聚的控制使细胞培养规模的放大更易实施。此外，动物细胞无载体固定也易于监测培养过程中的细胞生长。

由于细胞团中的细胞密度近似于组织中的细胞密度，存在于细胞团内的物质扩散限制可能影响细胞活力。因而，实施无载体固定化培养的基本前提是通过控制细胞团的粒径分布，提高悬浮细胞团中的细胞活力。虽然，Tolbert等在1980年曾提出了利用贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中具有聚集、形成细胞团的倾向，将动物细胞以细胞团的形式悬浮培养的设想。但迄今为止，细胞团悬浮培养均未能解决细胞团粒径分布、细胞团的解聚和游离细胞再聚集成团的有效控制的问题。细胞团悬浮培养基本上停滞在用搅拌式细胞瓶进行分批式或半连续式操作的实验研究阶段。

发明内容

本发明提供了一种利用贴壁依赖性生长细胞在搅拌培养体系中具有聚集、形成细胞团的倾向，通过控制细胞团的形成、细胞团的粒径分布和细胞团的解聚、游离细胞的再集聚成团，起到类似于多孔微载体固定化培养的目的，实施哺乳动物细胞的无载体固定化培养的方法。

HEK293、CHO、BHK和Vero等贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞在搅拌培养体系中悬浮培养具有聚集、形成细胞团的倾向。HEK293、CHO、BHK和Vero等哺乳动物细胞在悬浮培养体系中形成细胞团的粒径分布影响着细胞培养的具体操作工艺和细胞的生长代谢。细胞团粒径过小不利于细胞截流和灌注培养的实施；细胞团粒经径过大可能造成细胞团内传质效率受限，影响细胞的生长代谢。对悬浮培养过程中细胞团的形成、粒径分布和解聚的有效控制，是本发明的技术核心，也是利用动物细胞在悬浮培养中相互聚集、形成细胞团的生长特征，实施哺乳动物细胞无载体固定化培养技术的基本前提。

本发明依次包括以下步骤：

以搅拌式细胞培养瓶和装备有内置式旋转滤器的搅拌罐式生物反应器为实施哺乳动物细胞无载体固定化培养的悬浮培养体系；

用0.25％(v/v)胰蛋白酶消化于T形组织培养瓶或转瓶中培养的HEK293、CHO、BHK和Vero等哺乳动物细胞；

用Ca²⁺浓度为500～2000μM、小牛血清浓度为1～5％(v/v)的DMEM/F12培养基(DMEM∶F12(1∶1，v/v))悬浮HEK293、CHO、BHK和Vero细胞，调整细胞浓度为2～6×10⁵cells/ml；

将细胞悬液移入搅拌式细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养。在开始培养的第1～3天，搅拌速度设置为25～50r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形的细胞团；自培养的第3～4天起，设置搅拌速度为50～100r/min，细胞团的形状在逐渐加大的流体动力作用下形成较规则的球体，细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内。

自培养的第2～3天起，每天取出将搅拌式细胞培养瓶、于洁净工作台内静置1～3分钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95％培养体积更换新鲜培养基；

自培养的第2～3天起，每天取样测量细胞团的粒径、计数细胞密度。当细胞团的平均粒径大于300μm和/或细胞密度达到4～7×10⁶cells/ml时，按80-95％培养体积更换含500～750IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的无Ca²⁺DMEM培养基，在搅拌速度设置为50～100r/min的条件下培养12～36小时，使细胞团解聚。

取5～10％(v/v)的细胞悬液接种新的搅拌式细胞培养瓶，按10～20倍细胞悬液体积加入Ca²⁺浓度为500～2000μM、小牛血清浓度为1～5％(v/v)的DMEM/F12培养基，按步骤4-6重复实施搅拌式细胞培养瓶中的哺乳动物细胞无载体固定化培养；或将细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中，按10～20倍细胞悬液体积加入Ca²⁺浓度为500～2000μM、小牛血清浓度为1～5％(v/v)的DMEM/F12培养基，培养温度设置为37℃、溶解氧浓度控制在30～50％、pH控制在7.1～7.2。搅拌速度先设置为25～50r/min，使来自细胞团解聚的游离细胞重新形成球形的细胞团，随后在50～120r/min的范围内逐步提高搅拌速度，使细胞团的平均粒径控制在小于300μm范围内。

自细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中培养的第2～3天起，每天取样测定细胞团的粒径和培养基的葡萄糖浓度、计数细胞密度，利用生物反应器中微孔径为75μm的内置式旋转过滤器截流细胞团，启动生物反应器的培养基灌注系统，根据活细胞密度和葡萄糖浓度将灌注速率调整为0.15～1.5volume/day，实施搅拌罐式生物反应器中的哺乳动物细胞无载体固定化培养。

本发明与现有技术相比具有以下优点：①哺乳动物细胞在悬浮培养体系中所形成细胞团的形状规则、大小较均一，细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内。②细胞团解聚、游离细胞再集聚成团的条件温和、可控。③按照本发明的哺乳动物细胞无载体固定化培养的工艺，哺乳动物细胞培养的活细胞密度≥1×10⁷ells/ml、细胞活力≥90％。④可节省购买多孔微载体的动物细胞培养成本。⑤便于监测培养过程中的细胞生长，细胞培养规模放大容易。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为在250ml搅拌式细胞培养瓶中实施HEK293细胞无载体固定化培养的活细胞密度和细胞团平均粒径变化。活细胞密度(▲)；细胞团平均粒径(○)。图中各点代表至少3次培养结果的平均值和标准差。

图2A和图2B分别为倒置显微镜下观察到的HEK293细胞团(图2A)和扫描电镜下观察到的HEK293细胞团(图2B)。

图3A-3C分别反映在细胞团解聚条件下12h、24h和36h的293细胞团解聚；图3D为在细胞团形成条件下，自HEK293细胞团解聚的游离细胞再集聚形成细胞团。

图4为5L搅拌罐式生物反应器中无载体固定化培养HEK293细胞的细胞生长和细胞团粒径分布。

图5A-5C分别为倒置显微镜下观察到的rCHO细胞团(图5A)、BHK细胞团(图5B)和Vero细胞团(图5C)。

具体实施方式

实施例1、HEK293细胞的无载体固定化培养

(1)HEK293细胞无载体固定化培养的种子细胞准备：

将连续传代培养的HEK293细胞(购自美国Invitrogen公司)接种于100ml的组织培养瓶中，加入10ml含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，置37℃培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，待细胞形成致密细胞层后，用0.25％(w/v)的胰蛋白酶进行消化，作为实施HEK293细胞无载体固定化培养的种子细胞。

(2)HEK293细胞在搅拌式细胞培养瓶中的细胞团形成和细胞团粒径分布控制：

用Ca²⁺浓度为1000μM、小牛血清浓度为1％(v/v)的DMEM/F12培养基悬浮HEK293细胞，调整细胞悬液浓度为2～4×10⁵cells/ml，按100～500ml/瓶接种工作体积为100～500ml的搅拌式细胞培养瓶，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养。

在培养的第1～3天搅拌速度设置为25～50r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形的细胞团。自培养的第2～3天起，每天将搅拌式细胞培养瓶于洁净工作台内静置1～2分钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95％培养体积更换新鲜培养基。

在对培养物作培养基更换处理的同时，用大口吸管吸取均匀悬浮的HEK293细胞团悬液2～3ml。取其中的1ml用0.25％(w/v)胰蛋白酶消化液分散细胞团，用细胞密度和活力自动分析系统(Cedex A20，Innovatis)计数活细胞密度。用剪除尖端的移液器吸头吸取50-100μl样品加入96孔细胞培养板中，在Nikon Eclipse TE300倒置显微镜的4×平场物镜下观察细胞团并用彩色数码摄像头(Pro-150ES，Pixera)摄取图像，用Simple PCI图像分析软件(SimplePCI 5.1，Compix，Inc)中的图像处理和分析模块处理图像，测量HEK293细胞团的粒径、分析HEK293细胞团的粒径分布。

自培养的第4天起，设置搅拌速度为50～100r/min.。养8天后，HEK293的活细胞密度由接种时的3.1×10⁵cells/ml增加到的5.1×10⁶cells/ml(图1)。HEK293细胞团的形状在逐渐加大的流体动力作用下形成如图2所示的球状细胞团。HEK293细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内。

(3)HEK293细胞团的解聚：

当活细胞密度达到5×10⁶cells/ml和/或细胞团的平均粒径大于300μm时，按90％培养体积更换含500IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的无Ca²⁺DMEM培养基，设置搅拌速度为60r/min，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养12～36小时，使细胞团松散、解聚(图3A-3C)。

(4)HEK293细胞在搅拌罐式生物反应器中的无载体固定化培养：

培养于500ml搅拌式细胞培养瓶的HEK293细胞经细胞团解聚处理后，接种于工作体积为5L、装备有内置式旋转滤器的搅拌罐式生物反应器内，按10倍细胞悬液体积补充Ca²⁺浓度为1000μM、小牛血清浓度为1％(v/v)的DMEM/F12培养基至生物反应器设定的工作体积，培养温度设置为37℃、溶解氧浓度控制在30～50％、pH控制在7.1～7.2。在5L拌罐式生物反应器中培养的第1～3天搅拌速度设置为35～50r/min，使来自细胞团解聚的游离细胞相互聚集、重新形成近似于球形的细胞团；从在5L拌罐式生物反应器中培养的第4天起，根据HEK293细胞团的平均粒径变化，在50～120r/min的范围内逐步提高搅拌速度，使细胞团的平均粒径控制在小于300μm范围内。

自细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中培养的第2～3天起，每天取样按上述方法测量细胞团的粒径、计数活细胞密度；用YSI 7100型多参数生物分析系统(YSI 7100，YellowSprings Instruments)检测培养基中的葡萄糖、乳酸浓度。启动生物反应器的培养基灌注系统，利用生物反应器中微孔径为75μm的内置式旋转滤器截流细胞团，根据活细胞密度和葡萄糖浓度将灌注速率调整为0.15～1.5volume/day，实施搅拌罐式生物反应器中的HEK293细胞无载体固定化培养。

在5L拌罐式生物反应器中培养的第17天，HEK293的活细胞密度由接种时的4.2×10⁵cells/ml增加到的13.7×10⁶cells/ml，HEK293细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内，HEK293细胞的活力在整个培养过程中保持在大于90％的水平(图4)。

实施例2、CHO细胞的无载体固定化培养

将表达含KGDW插入序列的尿激酶原(KGDW-pro-UK)的CHO工程细胞系G6-1(由军事医学科学院生物工程研究所采用基因重组技术构建，简称CHO细胞)接种于1000ml的转瓶中，加入100ml含1％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，置转速为2r/min的转瓶培养装置上、37℃培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，使细胞形成致密细胞层。

培养于1000ml转瓶中的CHO细胞经0.25％(w/v)的胰蛋白酶进行消化处理后，用Ca²⁺浓度为1500μM、小牛血清浓度为1％(v/v)的DMEM/F12培养基悬浮CHO细胞，将细胞悬液注入工作体积为2L的搅拌罐式生物反应器中，细胞接种浓度为3.4×10⁵cells/ml。培养温度设置为37℃、溶解氧浓度控制在30～40％、pH控制在7.0～7.1。

在培养的第1～3天搅拌速度设置为35～50r/min，使CHO细胞相互聚集、形成近似于球形的细胞团。按前述方法计数活细胞密度、测量CHO细胞团的平均粒径；从培养的第4天起，根据CHO细胞团平均粒径的变化，在50～100r/min的范围内逐步提高搅拌速度，使细胞团的平均粒径控制在小于300μm范围内。

自细胞悬液转入搅拌罐式生物反应器中培养的第2～3天起，每天取样按上述方法检测培养基中的葡萄糖和乳酸浓度，采用溶圈法测定培养基中CHO细胞表达产物KGDW-pro-UK的浓度。同时，启动生物反应器的培养基灌注系统，利用生物反应器中微孔径为75μm的内置式旋转滤器截流细胞团，根据活细胞密度和葡萄糖浓度将灌注速率调整为0.25～1.0volume/day，实施搅拌罐式生物反应器中的CHO细胞无载体固定化培养。

培养12天后，CHO细胞的活细胞密度达到5.9×10⁶cells/ml，KGDW-pro-UK的浓度达到2984IU/ml。扫描电镜观察，CHO细胞在搅拌罐式生物反应器中形成粒径分布相对均匀、形状较规则的细胞团(图5A)。

实施例3、BHK细胞的无载体固定化培养

将连续传代培养的BHK细胞(来自美国模式培养物保藏所)接种于1000ml的转瓶中，加入100ml含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，置转速为2r/min的转瓶培养装置上、37℃培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，待细胞形成致密细胞层后，用0.25％(w/v)的胰蛋白酶进行消化、作为实施BHK细胞无载体固定化培养的种子细胞。

用Ca²⁺浓度为2000μM、小牛血清浓度为5％(v/v)的DMEM/F12培养基悬浮BHK细胞，调整细胞悬液浓度为5.2×10⁵cells/ml，按250ml/瓶接种工作体积为250ml的搅拌式细胞培养瓶，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养。

在培养的第1～2天搅拌速度设置为25～50r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形的细胞团。自培养的第2～3天起，每天将搅拌式细胞培养瓶于洁净工作台内静置1～2分钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95％培养体积更换新鲜培养基。自培养的第3天起，设置搅拌速度为50～100r/min.。

培养7天后，BHK细胞的活细胞达到的6.4×10⁶cells/ml。BHK细胞团的形状在逐渐加大的流体动力作用下形成如图5B所示的球状细胞团。BHK细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内。按90％培养体积更换含750IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的无Ca²⁺DMEM培养基，设置搅拌速度为75r/min，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养24h，使BHK细胞团松散、解聚。

取5％(v/v)的BHK细胞悬液接种新的搅拌式细胞培养瓶，按20倍细胞悬液体积加入Ca²⁺浓度为2000μM、小牛血清浓度为5％(v/v)的DMEM/F12培养基，按上述方法实施无载体固定化培养方式下的BHK细胞传代培养。

实施例4、Vero细胞的无载体固定化培养

将连续传代培养的Vero细胞(来自美国模式培养物保藏所)接种于100ml的组织培养瓶中，加入10ml含2％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，置37℃培养。根据培养基的颜色变化更换新鲜培养基，待细胞形成致密细胞层后，用0.25％(w/v)的胰蛋白酶进行消化、作为实施Vero细胞无载体固定化培养的种子细胞。

用Ca²⁺浓度为500μM、小牛血清浓度为2％(v/v)的DMEM/F12培养基悬浮Vero细胞，调整细胞悬液浓度为2.5×10⁵cells/ml，按100ml/瓶接种工作体积为100ml的搅拌式细胞培养瓶，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养。

在培养的第1～3天搅拌速度设置为30～50r/min，使细胞相互聚集、形成近似于球形的细胞团。自培养的第4天起，每天将搅拌式细胞培养瓶于洁净工作台内静置1～3分钟，使细胞团沉降于瓶底，按50-95％培养体积更换新鲜培养基。自培养的第4天起，设置搅拌速度为50～100r/min.。

培养9天后，Vero细胞的活细胞达到的4.8×10⁶cells/ml。Vero细胞团的形状在逐渐加大的流体动力作用下形成如图5B所示的球状细胞团。Vero细胞团的平均粒径控制在小于300μm的范围内。按90％培养体积更换含500IU/ml肝素、1％(v/v)小牛血清的无Ca²⁺DMEM培养基，设置搅拌速度为85r/min，37℃、5％CO₂培养条件下悬浮培养36h，使Vero细胞团松散、解聚。

取10％(v/v)的Vero细胞悬液接种新的搅拌式细胞培养瓶，按10倍细胞悬液体积加入Ca²⁺浓度为500μM、小牛血清浓度为2％(v/v)的DMEM/F12培养基，按上述方法实施无载体固定化培养方式下的Vero细胞传代培养。

本发明的特定实施例已经对本发明的内容做了详尽的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干步骤和/或参数的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。