哺乳动物细胞无载体固定化培养技术的建立

摘要

该论文的主要目标是建立适用于哺乳动物细胞的无载体固定化培养模式.鉴于人胚肾细胞系HEK293细胞已被广泛地用作生产基因治疗载体和重组蛋白的哺乳动物细胞,该论文研究围绕HEK293细胞的无载体固定化培养展开.细胞团中的细胞密度近似于组织中的细胞密度,存在于细胞团内的物质扩散限制可能影响细胞活力.因而,实施无载体固定化培养的基本前提是通过控制细胞团的粒径分布,提高悬浮细胞团中的细胞活力.基于此,论文研究从确定悬浮培养中HEK293细胞团的形成和HEK293细胞团的特征入手.在Bellco搅拌式细胞培养瓶中对血清浓度、Ca<'2+>浓度和流体动力强度等影响细胞团形成因素的考察和优化结果表明:培养基中的Ca<'2+>浓度对细胞团的形成以及所形成细胞团的粒径分布起着决定性的影响;流体动力强度则在很大程度上影响着细胞团的形状和粒径分布.在Ca<'2+>浓度为500-750μM、流体动力强度为搅拌速度设置在50-75r/min的悬浮培养体系中,HEK293细胞团的平均粒径分布可控制在小于250μm的范围内.采用培养基的替换操作,在生物反应器内就能完成HEK293细胞团的充分解聚、游离HEK293细胞再聚集成团的控制过程而不影响细胞的活力.这一细胞团解聚、游离细胞再聚集的控制方法为无载体固定化培养的规模放大提供了极大的便利.以比生长速率(μ)、葡萄糖比消耗率(q<,glu>)、乳酸比生成率(q<,kac>)和氨基酸利用特征考察HEK293细胞无载体固定化培养的细胞生长和代谢特征表明:Bellco搅拌式细胞培养瓶中以悬浮细胞团培养的HEK293细胞保持着其在静止贴附培养中的生长和代谢特征.扫描电镜和荧光显微镜可观察到位于细胞团表面的HEK293细胞形态由球形转变为扁平上皮细胞样的变化.在条件优化的悬浮培养中,HEK293细胞团中无细胞凋亡和/或坏死区域形成,细胞活力保持在90﹪以上.在2L搅拌罐式生物反应器以灌注式操作无载体固定化培养HEK293细胞,11d后的活细胞密度达到1.32×10<'7>cells/ml.上述结果表明,采用灌注式操作无载体固定化培养哺乳动物细胞是实现细胞高密度培养的一种可选方法.用重组腺病毒载体pAd-TH-GFP感染HEK293细胞团,表现为细胞团表面的细胞先被感染,而后感染细胞团内部的HEK293细胞的动态过程.在5L搅拌罐式生物反应器中以HEK293细胞无载体固定化的培养模式扩殖pAd-TH-GFP,pAd-TH-GFP的滴度在病毒载体感染后120h达到1-5×10<'13>GTU/ml.借鉴HEK293细胞无载体固定化培养的工艺条件,CHO细胞、BHK细胞和Vero细胞等哺乳动物细胞均可在搅拌式生物反应器中以无载体固定化的模式进行培养.这些结果在一定程度上验证了无载体固定化培养对贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞的适用性.综合上述结果表明,细胞团在搅拌式生物反应器中的悬浮培养可作为便于实施灌注操作、提高生物反应器单位体积产率的无载体固定化培养模式.哺乳动物细胞的无载体固定化培养是一种具有发展和应用潜力的动物细胞培养模式.

目录

摘要

Abstract

前言

第一章HEK293细胞在悬浮培养体系中的细胞团形成和解聚

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1不同血清浓度下HEK293细胞悬浮培养的细胞团形成

2.2 HEK293细胞在不同Ca2+浓度培养基中悬浮培养的细胞团形成

2.3 HEK293细胞在不同流体动力强度下悬浮培养的细胞团形成

2.4悬浮培养条件下HEK293细胞团的解聚和再集聚

2.5结论

3讨论

第二章HEK293细胞团在悬浮培养条件下的细胞生长和代谢

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1 HEK293细胞在搅拌式培养瓶中无载体固定化培养的细胞生长和代谢

2.2 HEK293细胞在无载体培养过程中的细胞形态和细胞凋亡

2.3 HEK293细胞无载体固定化的半连续式培养和灌注培养

2.4结论

3讨论

第三章动物细胞无载体固定化培养技术的初步应用

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1 HEK293细胞无载体固定化培养的pAd-TH-GFP扩殖动态和效果

2.2 HEK293细胞在5 L生物反应器中以无载体固定化的培养方式扩殖pAd-TH-GFP

2.3动物细胞无载体固定化培养模式的适用性

2.4结论

3 讨论

总结

参考文献

博士在读期间发表文章

致谢

大规模动物细胞培养技术的应用现状与发展趋势

一、概述

二、大规模细胞培养技术的形成和发展过程

三、大规模细胞培养技术的应用现状和发展趋势

四、结语

参考文献