流感病毒哺乳动物细胞高产株的获得及其反向遗传技术平台的建立

摘要

本研究的目的是：筛选高产的甲型流感病毒母株，获得其全部8个基因片段的克隆，然后将高产毒株基因与流行毒株的HA和NA片段进行重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点。这样制备甲型流感疫苗，将是流感疫苗生产的重大变革。本研究的主要内容包括： 1、筛选MDCK细胞高产的甲型流感病毒：通过大量筛选备选病毒(该系列毒株是细胞来源的)，以较低的MOI感染MDCK细胞，获得哺乳动物细胞高产病毒，并将其高产特性稳定下来。 2、细胞高产株全基因组克隆及序列测定：通过流感病毒通用引物反转录，特异引物PCR扩增的方法，将该病毒8个基因节段全部扩增出来，并克隆入中间载体。送测序，每节段至少3个克隆。获得了全基因组cDNA序列，共计13588bp。 3、反向遗传操作双向双表达载体的构建：通过PCR反应从质粒PHH21上扩增出一段含人源RNApolymeraseⅠ启动子和鼠源RNApolymeraseⅠ终止子的序列。将上述PCR产物的酶切片段连入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中，获重组质粒。该重组质粒特点是在RNApolymeraseⅡ启动子和终止序列之间嵌合了RNApolymeraseⅠ启动子和终止子元件。 4、细胞高产株反向遗传操作8质粒系统的构建：通过酶切的方式将细胞高产株8个基因节段分别连入上述载体中，共转染293T细胞。将转染上清连续传代，空斑纯化获重配病毒。 5、利用6+2重配系统获得流行株的反向遗传重配病毒株：将流行株的表面抗原HA，NA基因克隆入上述载体，与高产株内部基因的六个质粒共转染293T细胞。将转染上清连续传代，空斑纯化获重配病毒。对病毒重配株的生物学性状进行了研究。本研究的创新点在于： 1、筛选出一甲型流感病毒MDCK细胞高产株，克隆其全部基因组8个节段，并完成全基因组的测序工作。 2、构建成功甲型流感病毒MDCK细胞高产株的反向遗传操作系统。并应用该系统获得可用于疫苗生产的重配病毒株。

目录

前言

第一部分流感病毒哺乳动物细胞高产株的获得及其基因克隆与分析

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分甲型流感病毒细胞高产株反向遗传技术平台的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 反向遗传学技术在禽流感病毒相关研究中的应用

1 禽流感病毒的起源和基因特点

2 禽流感病毒的毒力与免疫

3 流感病毒反向遗传操作技术的发展历程

4 反向遗传操作技术在禽流感相关研究中的应用

5 结束语

参考文献

致谢