生产对映体纯β－氨基酸衍生物的方法和对映体纯β－氨基酸衍生物

摘要

生产对应通式(I)R1－NZ－CHR2－CH

说明书

本发明涉及生产对映体纯β-氨基酸衍生物的方法，还涉及对映体纯β-氨基酸衍生物。

一些β-氨基酸及其衍生物可用于生产可用作药物产品的肽。这些β-氨基酸的具体实例包含至少一个含氮杂环。

在寻找作用原理时，需要有参与药理活性尤其是肽的药理活性的氨基酸，它们可用于生产肽或肽类似物的方法。

美国专利3,891,616描述了一些含有2-吡咯烷乙酸的生物活性肽。该酸的N-Boc衍生物通过用重氮甲烷处理天然L-脯氨酸来制备。

这种已知方法需要用对映体纯天然氨基酸作为起始物。后者使用危险试剂在可能发生外消旋作用风险的条件下进行转化。

本发明目的在于解决上述问题。

因此，本发明涉及生产对应通式(I)

           R1-NZ-CHR2-CH₂-COOR3(I)

的对映体纯β-氨基酸衍生物的方法，其中

R1和R2分别独立地表示有机残基，任选地形成环状取代基，

R3表示H或有机残基，和

Z代表H或氨基保护基，

该方法包括以下步骤：对应通式(II)

R1-NZ-CHR2-CH₂-COOR4(II)

的化合物的对映体混合物在脂肪酶存在下进行水解，其中

R1、R2和Z如通式(I)中定义，和

R4是有机残基。

已经发现根据本发明的方法可以高产率地生产高对映体纯度的β-氨基酸或其衍生物。

术语“对映体纯化合物”用于表示基本上由一种对映体组成的手性化合物。对映体过量(ee)定义为：ee(％)＝100(x₁-x₂)/(x₁+x₂)，其中x₁＞x₂；x₁和x₂分别代表混合物中对映体1或2的含量。

术语“有机残基”用于特别表示可包含杂原子特别是例如硼、硅、氮、氧、或硫原子的线型或支化烷基或亚烷基，环烷基，杂环和芳香体系。有机残基可包含双键或三键和官能团。

有机残基含有至少一个碳原子。通常含有至少2个碳原子。优选含有至少3个碳原子。更优选含有至少5个碳原子。

有机残基一般含有至多100个碳原子。通常含有至多50个碳原子。优选含有至多40个碳原子。更优选含有至多30个碳原子。

术语“烷基”用于特别表示含有1-20个碳原子，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的线型或支化烷基取代基。这些取代基的具体实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、2-己基、正庚基、正辛基和苯甲基。

术语“环烷基”用于特别表示包含至少一个含有3-10个碳原子，优选5、6或7个碳原子的饱和碳环的取代基，。这些取代基的具体实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。

术语“亚烷基”或“环亚烷基(cycloalkylene group)”用于特别表示由以上限定的烷基或环烷基衍生而来的二价基团。

有机残基包含一个或任选的多个双键时，它经常选自含有2-20个碳原子，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的烯基或环烯基。这些基团的具体实例是乙烯基、1-烯丙基、2-烯丙基、正丁-2-烯基、异丁烯基、1，3-丁二烯基、环戊烯基、环己烯基和苯乙烯基。

有机残基包含一个或任选的多个三键时，它经常选自含有2-20个碳原子，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的炔基或环炔基。这些基团的具体实例是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、正丁-2-炔基、和2-苯乙炔基。

有机残基包含一个或任选的多个芳香体系时，它经常是含有6-24个碳原子，优选6-12个碳原子的芳基。这些基团的具体实例是苯基、1-甲苯基、2-甲苯基、3-甲苯基、二甲苯基、1-萘基和2-萘基。

术语“杂环”用于特别表示含有至少一个由3、4、5、6、7或8个原子且至少其中之一是杂原子所组成的饱和或不饱和环的环状体系。杂原子通常选自B、N、O、Si、P和S。更经常选自N、O和S。

这些杂环的具体实例是氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、吗啉、1，2，3，4-四氢喹啉、1，2，3，4-四氢异喹啉、全氢喹啉、全氢异喹啉、异噁唑烷、吡唑啉、咪唑啉、噻唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡喃、四氢吡喃和二噁烷。

如上定义的有机残基可以是未取代的或由官能团取代的。术语“官能团”用于特别表示含有杂原子或由杂原子组成的取代基。杂原子经常选自B、N、O、Al、Si、P、S、Sn、As和Se和卤素。更经常选自N、O、S和P，尤其是N、O和S。

官能团通常含有1、2、3、4、5或6个原子。

关于官能团，可提及的是，例如卤素、羟基、烷氧基、巯基、氨基、硝基、羰基、酰基、任选酯化的羧基、酰胺基、脲基、氨基甲酸酯基、和上述包含羰基、磷化氢、膦酸酯或磷酸酯基、亚砜基、砜基和磺酸酯基的基团的硫醇衍生物。

本发明方法中，通式(I)或(II)化合物的取代基Z经常是氨基保护基。由此获得作为未反应底物的对映体纯β-氨基酸衍生物，在不需要其他变化的情况下其可以用作肽合成中间体。

关于可用Z表示的氨基保护基的非限制性实例，尤其要提到的是：取代或未取代的烷基或芳烷基类基团，如苯甲基、二苯甲基、二(甲氧苯基)甲基或三苯甲基；取代或未取代的酰基类基团，如甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基或邻苯二甲酰基；取代或未取代的芳烷氧羰基类基团，如苯甲氧羰基、p-氯苯甲氧羰基、p-溴苯甲氧羰基、p-硝基苯甲氧羰基、p-甲氧基苯甲氧羰基、二苯甲氧羰基、2-(p-联苯基)异丙氧羰基、2-(3，5-二甲氧苯基)异丙氧羰基、p-苯基偶氮苯甲氧羰基、三苯基膦酰基乙氧羰基或9-芴基甲氧羰基；取代或未取代的烷氧羰基类基团，如叔丁氧羰基、叔戊氧羰基、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基、烯丙氧羰基、2-甲基磺酰基乙氧羰基或2，2，2-三氯乙氧羰基；环烷氧羰基类基团，如环戊氧羰基、环己氧羰基、金刚烷氧羰基或异冰片氧羰基；和含杂原子的基团，如苯磺酰基、p-甲苯磺酰基、三甲苯磺酰基、甲氧基三甲苯磺酰基、o-硝基苯亚磺酰基(o-nitrophenylsulphenyl)或三甲基硅烷基。

在这些Z基团中，优选含有羰基的基团。特别优选酰基、芳烷氧羰基和烷氧羰基。

保护基团优选是立体位阻的。术语“立体位阻”用来特别表示含至少3个碳原子、尤其是至少4个碳原子、包括至少一个仲、叔或季碳原子的取代基。立体位阻基团经常含有至多100或甚至50个碳原子。优选选自烷氧羰基、芳氧羰基和芳烷氧羰基的保护基。最优选叔丁氧羰基(BOC)。

根据本发明的方法中，通式(I)化合物的取代基R3经常是氢原子。在这种情况下，可以用如上所限定的有机残基通过它们本身已知的方法来取代它。

根据本发明的方法中，通式(II)化合物的取代基R4经常是如上所限定的烷基或环烷基，优选甲基或乙基。

在优选方面，通式(I)和(II)化合物的取代基R1和R2形成具有NZ-CH基团的杂环。所述杂环优选含有4、5、6、7或8个原子。更优选地含有5、6或7个原子。

在该方面的变体中，杂环含有至少一个额外的杂原子，优选选自N、O和S。更优选含有选自N和O的至少一个额外杂原子的杂环。

本发明还涉及根据该方面的对映体纯β-氨基酸或对映体纯β-氨基酸衍生物。本发明也涉及肽或肽类似物，它们可以在其生产过程中用根据本发明的对映体纯β-氨基酸衍生物获得。根据本发明的对映体纯β-氨基酸衍生物的肽偶联可根据其本身已知的技术实现。

更特别优选地，将根据本发明方法用于生产具有化学式(III)的对映体纯β-氨基酸衍生物

其中，J独立地选自C、N、O和S；Z和R4如上所限定，m和n独立地具有0到4的值。优选地，m和n的值是1、2或3。

这些对映体纯β-氨基酸衍生物的具体实例选自下面的化合物

其中Z和R3如上述定义。

根据本发明的方法中，脂肪酶经常选自洋葱假单孢菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶和南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶。优选洋葱假单孢菌(Pseudomonascepacia)脂肪酶。脂肪酶可以游离形式或固定化形式使用，例如固定在载体如陶瓷上。

根据本发明的方法中，水解通常在大于或等于0℃的温度下进行。此温度经常大于或等于10℃。此温度优选大于或等于20℃。根据本发明的方法中，水解通常在小于或等于50℃的温度下进行。此温度经常小于或等于40℃。此温度优选小于或等于30℃。

根据本发明的方法中，水解过程中通常维持pH大于或等于6。pH经常大于或等于6.5。水解过程中优选维持pH约等于7。根据本发明的方法中，水解过程中通常维持pH小于或等于8。pH经常小于或等于7.5。

根据本发明的方法中，脂肪酶的用量通常大于或等于10mg/mmol式(II)化合物。此用量优选大于或等于20mg/mmol式(II)化合物。根据本发明的方法中，脂肪酶的用量通常小于或等于100mg/mmol式(II)化合物。此用量优选小于或等于50mg/mmol式(II)化合物。

本发明还涉及生产肽或肽类似物的方法，据此

(a)根据本发明的方法生产对映体纯β-氨基酸衍生物；

(b)将所得对映体纯β-氨基酸衍生物用于生产肽或肽类似物。

以下实施例用于举例说明本发明，而不是限制本发明。

始于吗啉，通过一系列相继的步骤：N-乙酰化吗啉的阳极甲氧基化(电化学合成)，在TiCl₄存在下通过与烯丙基三甲基硅烷反应而用烯丙基取代甲氧基，随后进行氧化性臭氧分解，从而得到外消旋的3-羧甲基吗啉1。

1.1合成3-乙氧甲酰甲基吗啉盐酸盐

将0.85ml乙酰氯逐滴加入到10ml冷却至0℃的乙醇中。然后加入溶于3ml乙醇中的β-氨基酸1(4mmol，1当量)溶液，混合物回流3小时。溶剂蒸发后，分离出0.83g预期产物(产率＝98％)。

                                  ¹³C NMR：

δ(CDCl₃)169,0(s，COOEt)，67,5(s，OCH₂CH)，63,5(s，O_CH₂CH₂)，61,6(s，OCH₂CH₃)，51,2(s，CHCH₂COOEt)，43,1(s，CH₂NH)，33,1(s，CHCH₂COOEt)，14,0(s，OCH₂CH₃).

                                  ¹H NMR：

δ(CDCl₃)4,18(q，³J_H-H＝7,2Hz，2H，COOCH₂CH₃)，3-84-3,15(m，7H，CH₂CH₂OCH₂CH)，3,11(dd，³J_H-H＝4,5Hz，²J_H-H＝17,1Hz，1H de CH₂CO₂Et)，2,79(dd，³J_H-H＝7,9Hz，²J_H-H＝17,1Hz，1H de CH₂CO₂Et)，1,26(t，³J_H-H＝7,2Hz，3H，COOCH₂CH₃).

红外：(KBr)3441(vNH)，2954(vNH)，1727(vCO_酯).

元素分析：

计算值：C45.83％；H7.69％；N6.68％

测量值：C42.13％；H7.17％；N6.66％

1.2合成4-叔丁氧羰基-3-乙氧甲酰甲基吗啉

将2g碳酸氢钠(24mmol，4当量)加入到含1.26g β-氨基酯2(6mmol)的10ml THF和35ml二噁烷溶液中。溶液变均匀后，加入1.75g焦碳酸叔丁基酯(8mmol，1.3当量)。加热溶液到40℃保持5小时。蒸发后，残余物用乙醚吸收。水相用15ml乙醚萃取3次。合并有机相并用硫酸镁干燥。蒸发有机相后，用硅胶柱色谱纯化残余物；洗脱剂：4/1环己烷/乙酸乙酯。分离得到1.42g对应预期产物的同体(产率＝87％)。

                                   ¹³C NMR：

δ(CDCl₃)171,3(s，COOEt)，154,5(s，NCOOt-Bu)，80,3(s，C(CH₂)₃)，68,9(s，OCH₂CH)，66,9(s，OCH₂CH₂N)，60,7(s，OCH₂CH₃)，48,1(s，NCH)，39,5(s，OCH₂CH₂N)，33,8(s，CH₂COOEt)，28,4(s，C(CH₃)₃)，14,2(s，OCH₂CH₃).

                                   ¹H NMR：

δ(CDCl₃)4,36(大，1H，NCH)，4,11(q，³J_H-H＝7,1Hz，2H，OCH₂CH₃)，3,840(m，3H，1H de OCH₂CH₂N，1H de OCH₂CH₂N，1H de OCH₂CH)，3,56(dd，³J_H-H＝2,8Hz，²J_H-H＝11,8Hz，1H，1H de OCH₂CH)，3,43(td，³J_H-H＝2,8Hz，²J_H-H＝12Hz，1H，1H de OCH₂CH₂N)，3,09(m，1H，1H de OCH₂CH₂N)，2,81(dd，³J_H-H＝8,8Hz，²J_H-H＝15Hz，1H，1H de CH₂COOEt)，2,54(dd，³J_H-H＝5,5Hz，²J_H-H＝15Hz，1H，1H deCH₂COOEt)，1,44(s，9H，C(CH₃)₃)，1,25(t，³J_H-H＝7,1Hz，3H，OCH₂CH₃).

                                   质谱：

M/Z(EI)：273(1％)((M)⁺)，217(5％)((M-C₄H₈)⁺)，200(3％)((M-CO₂CH₂CH₃)⁺)，172(24％)((M-C₅H₉O₂)⁺)，142(43％)，130(32％)，86(46％)，57(100％)((C₄H₉)⁺)，41(26％).

红外：(纯)1735(vCO_酯)，1698(vCO_{氨基甲酸酯}).

元素分析：

计算值：C57.13％；H8.48％；N5.12％

测量值：C57.06％；H8.63％；N5.04％

1.3酶促外消旋体切割外消旋的4-叔丁氧羰基-3-乙氧甲酰甲基吗啉

将100mg Amano PS(洋葱假单孢菌，Pseudomonas cepacia)酶加入到含273mg吗啉3(1mmol)的2ml THF、8ml pH7的10^-2M缓冲溶液和8ml水的溶液中。在25℃搅拌反应介质，并用自动滴定器通过加入0.1N NaOH溶液维持pH在pH7。通过加入0.1N NaOH的体积跟踪反应进度。搅拌10小时并加入5ml 0.1N NaOH后，离心反应介质以分离溶液和酶。浓缩该溶液并用乙醚萃取水相。合并有机相并用硫酸镁干燥。蒸发后得到125mg对映体纯的3b(产率＝45％)。将水相酸化到pH3再用乙醚萃取。合并有机相并用硫酸镁干燥。蒸发后，得到120mg对映体纯4-叔丁氧羰基-3-乙氧甲酰甲基吗啉3a(产率＝44％)。从己烷/二异丙基醚(8/2)混合物中重结晶该酸。

(3R)-4-叔丁氧羰基-3-羧甲基吗啉

熔点：82℃

                                  ¹³C NMR：

δ(CDCl₃)175,9(s，COOH)，154,5(s，NCOOtBu)，80,5(s，OC(CH₃)₃)，68,8(s，OCH₂CH)，66,7(s，OCH₂CH₂)，48,0(s，OCH₂CH)，39,4(s，OCH₂CH₂)，33,4(s，CH₂COOH)，28,2(s，OC(CH₃)₃).

                                  ¹H NMR：

δ(CDCl₃)175,9(s，COOH)，154,5(s，NCOOtBu)，80,5(s，OC(CH₃)₃)，68,8(s，OCH₂CH)，66,7(s，OCH₂CH₂)，48,0(s，OCH₂CH)，39,4(s，OCH₂CH₂)，33,4(s，CH₂COOH)，28,2(s，OC(CH₃)₃).

                                  质谱：

M/Z(EI)：245(7％)((M)⁺)，190(10％)，172(17％)((M-OC₄H₉)⁺)，144(3％)，172(24％)((M-C₅H₉O₂)⁺)，142(43％)，130(14％)，114(12％)，86(31％)，70(12％)，57(100％)((C₄H₉)⁺)，41(12％).

I.R.：(KBr)3700-2500(vOH_酸)，1713(vCO_酸)，1694(vCO_{氨基甲酸酯}).

(3S)-4-叔丁氧羰基-3-乙氧甲酰甲吗啉3b

通过气相色谱注射测量对映体过量(Chirasil-DEX CB柱)：

流速：氦气1ml/min

T(柱温箱)：150℃恒温

t_r＝13.8min(S)，14.5min(R)。

1.4通过合成(3S)-3-(2-苯氧乙基)吗啉盐酸盐鉴定化合物3a和3b的绝对构型

将-40℃的4.2ml DiBAl-H(4.2mmol，2当量)加入到含570mg β-氨基酯3b(2.1mmol，1当量)的20ml二乙醚溶液中。在-40℃搅拌溶液1小时，然后室温1小时。用0.5N盐酸溶液水解混合物随后用二乙醚萃取溶液。合并有机相，用硫酸镁干燥。溶剂蒸发后，用硅胶柱色谱纯化残余物；洗脱剂：环己烷/乙酸乙酯：2/3。分离到对应预期产物的390mg纯醇(产率＝80％)。

于0℃将515mg二异丙基偶氮二羧酸酯(2.55mmol，1.5当量)加入到含390mg前述醇(1.7mmol，1当量)、160mg苯酚(2.2mmol，1.3当量)和670mg三苯基膦的10ml THF溶液中。室温搅拌混合物2小时30分钟。溶剂蒸发后，用硅胶柱色谱纯化残余物，洗脱剂：环己烷/乙酸乙酯：4/1。分离得到对应预期产物的290mg纯醚(产率＝55％)。在乙酸乙酯和3M盐酸溶液的混合物中于50℃加热12小时。冻干后，分离得到145mg相应盐酸盐(产率＝63％)。

(文献.Brown，G.R.et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I1987，547-551)

化合物R的

实施例2：合成对映体纯的吡咯烷-2-乙酸衍生物

酶促切割外消旋体4

从吡咯烷开始，根据实施例1的方法可得到β-氨基酯4。将225mg PS Amano脂肪酶加入到含303mg所得β-氨基酯4(1.18mmol)的6ml水、6ml pH7的(10^-2M)缓冲溶液和2ml THF的溶液中，并用自动滴定器通过加入0.1N NaOH溶液维持pH在pH7。加入6ml 0.1N NaOH并搅拌48小时后，过滤并浓缩该溶液，然后用乙醚萃取水相。合并有机相并用硫酸镁干燥。蒸发后得到144mg酯4b(产率＝47.5％)。水相酸化到pH3并用乙醚萃取。合并有机相并用硫酸镁干燥。蒸发后，得到125mg 1-叔丁氧羰基吡咯烷-2-乙酸4a(产率＝46.5％)。从己烷中重结晶该酸。

(2R)-1-叔丁氧羰基-2-乙氧甲酰甲基吡咯烷(4b)

文献¹

(2S)-1-叔丁氧羰基-2-羧甲基吡咯烷(4a)

$>2_{$ >{}_{}^{}$}^{}$

熔点＝98℃文献¹：熔点＝99-101℃

                                    ¹³C NMR：

δ(CDCl₃)：177,0(s，COOH)，156,0(s，COOC(CH₃)₃)，79,9(s，COOC(CH₃)₃)，53,9(s，CHN)，46,3(s，CH₂CO₂H ou CH₂N)，39,1(s，CH₂CO₂H ou CH₂N)，31,2(s，CH₂CH)，28,4(s，COOCCH₃)₃)，23,5(s，CH₂CH₂N).

                                    ¹H NMR：

δ(CDCl₃)4,34(s大，1H，CH₂CH)，3,30(m，2H，CH₂N)，2,80(m，1H deCH₂CO₂H)，2,28(dd，³J_H-H＝10Hz，²J_H-H＝16Hz，1H de CH₂CO₂H)，2,00-1,76(m，4H，CH₂CH₂CH)，1,39(s，9H，OC(CH₃)₃).

                                    质谱：

M/Z(EI)：229(5％)((M)⁺)，173(24％)((M-C₄H₈)⁺)，156(26％)((M-OC₄H₉)⁺)，128(12％)((M-CO₂C₄H₉)⁺)，114(29％)，101(3％)，82(3％)，70(97％)，57(100％)((C₄H₉)⁺)，41(20％).

红外：(KBr)3700-2800(vOH_酸)，1735(vCO_酸)，1655(vCO_{氨基甲酸酯}).

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¹Cassal，J.M.；Fürst，A.；Meier，W.Helv.Chim.Acta 1976，59，1917-1924.

²Cassal，J.M.；Fürst，A.；Meier，W.Helv.Chim.Acta 1976，59，1917-1924.

通过气相色谱注射用乙酯测量对映体过量(Chirasil-DEX CB柱)：

流速：氦气1ml/min

T(柱温箱)：150℃恒温

t_r＝9.8min(R)，10.1min(S)。

实施例3：合成对映体纯的吡咯烷-2-乙酸衍生物

通过实施例1的方法得到对映体纯吡咯烷-2-乙酸4a和相应的对映体纯甲酯4c。

下表给出所得对映体过量数据

  实施例  产物  ee  产物(％)  底物  ee  底物(％)  1  3a  ＞99  3b  ＞99  2  4a  94  4b  99  3  4a  99.1  4c  99.4