一种辣椒游离小孢子细胞团培养方法

摘要

本发明公开了一种辣椒游离小孢子细胞团培养方法。该方法先对花药进行预培养，然后进行小孢子的游离培养。本发明在辣椒的游离小孢子培养体系上另辟蹊径，通过游离培养经预培养后的花药中的小孢子细胞及细胞团，获得了胚状体及其植株，显微镜检提供了胚状体的单细胞、单倍体发育途径的细胞学证据。该技术体系的建立，不仅是辣椒单倍体育种技术上的突破，而且该游离小孢子培养胚状体诱导体系还可能成为进行植物细胞分化、发育研究的良好实验体系。

说明书

技术领域

本发明涉及一种辣椒游离小孢子细胞团培养方法。

背景技术

目前，由于植物具有的杂种优势，使目前的作物育种侧重在杂交育种上。这一方面可以利用杂种的生长优势形成高产，另一方面由于杂种的复杂遗传背景，使其不宜留种使用，从而能保护杂种研制者的利益。在杂交育种中，所用父母本材料的遗传背景必须是纯合的，经配种后才能得到性状一致的杂种。而要得到遗传背景纯合的亲本材料，在许多作物中都必须通过人工辅助自交授粉，经5-8年时间才能达到相对纯合。这种传统的杂交育种手段非常费时、费力。植物的雄性生殖细胞——花粉，由于经减数分裂后只带有一套母体的染色体，是单倍性细胞，通过花药或未成熟花粉(小孢子)培养可以获得单倍体植株，进而通过染色体加倍成为双单倍体材料，这样可以达到该植株遗传背景的完全纯合状态。这一方面可以克服杂合状态时，显性基因对隐性基因的屏蔽作用，有利于隐性突变或基因重组性状的表达，另一方面可以直接获得纯合材料，从而作为亲本材料应用于杂交育种。通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需要1-2年时间，能大大加速育种进程，提高育种效率。因此国际上对作物的单倍体育种研究非常重视，已在小麦、大麦、油菜、白菜等许多作物上建立了良好的单倍体育种技术体系。

辣椒(Capsicum annuum L.)的杂种优势明显，目前杂交育种成为主要的育种手段。辣椒的花药培养已经有很多研究，最早成功于1973年王玉英及George等人的工作(Wang Y Y，Sun C S，Wang C C，et al.The induction of the pollenplantlets of triticale and Capsicum annuum from anther culture.Sci.Sinica，1973，16：147-151；George L，Narayanswamy S.Haploid Capsicum throughexperimental androgenensis.Protoplasma，1973，78：467-470)。之后1981年Dumas等对花药培养体系进行了较大的改进，提高了出胚率(Dumas de Vaulx，R.，D.Chambonnet，E.Pochard.Culture in vitro d’anthères de piment(Capsicum annuumL.)：Amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents genotypes par destraitements à+35C.Agronomie，1981，1：859-864)。在此基础上又有许多相关试验(Morrison R A，Koning R E，Evans D A.Anther culture of an interspecifichybrid of Capsicum.J.Plant Physiol.，1986，126：1-9；Kell K，Andersen S B，Effectsof donor plant temperature，photoperiod，and age on anther culture response ofCapsicum annuum L.Euphytica，1993，67：105-109；MitykóJ，Andrasfalvy A，Csillery G，Fári M，Anther-culture response in different genotypes and F1 hybridsof pepper(Capsicum annuum L).Plant Breeding，1995，114：78-80；王立浩，张宝玺，郭家珍，等.辣椒花药培养中若干影响因素的研究.园艺学报，2004，31(2)：199-204.)。1997年Ramon等建立了固液相双层培养体系，简化了培养操作并进一步提高了出胚率(Ramon Dolcet-sanjuan，Elisabet Claveria，Agustin Huerta.Androgenesis in Capsicum annuum L-Effects of carbohydrate and carbon dioxideenrichment.J.Amer.Soc.Hort.Sci，1997，122(4)：468-475)。但是所有这些都是在花药培养上的研究成果。

完整花药连同其内部的未成熟花粉粒(小孢子)一起进行体外培养，称作花药培养。由于花药壁细胞是二倍体细胞，因此通过花药培养获得的再生植株有可能来自单倍性的花粉粒，也可能来自药壁的二倍体细胞，这样会造成再生植株的混杂，大大影响该方法的育种应用。将未成熟花粉粒(小孢子)自花药中分离出来，单独培养，称为游离小孢子培养。由于游离小孢子的单细胞性、单倍性以及大群体特性，使得它在雄性生殖的研究及应用上，具有比花药培养更多的优点：如可以完全避免花药壁二倍体细胞的干扰，获得大量完全真实的单倍体或双单倍体植株，有利于育种应用；此外，单细胞培养系统可以用于基因导入，基因表达，雄核发育的调控研究，细胞的分裂、分化和发育等理论研究。人们一直很关注该技术的建立，但是辣椒的游离小孢子培养系统却一直没有成功报道。说明可能由于辣椒小孢子的特异性，需要一个非常规的培养技术体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种辣椒(Capsicum annuum L.)游离小孢子细胞团培养方法。

为实现上述目的，本发明采取以下方案：先对花药进行预培养，然后进行小孢子的游离培养。

具体地说，该方法采用以下步骤：

(1)花药预培养：摘取小孢子处于单核后期的花蕾，剥去花萼部分。以70％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振荡灭菌10分钟。无菌水清洗4次，剥取花药接种于PAC培养基上，之后给以35℃或32℃高温暗处理8天，转入26℃暗培养。

(2)游离小孢子及其细胞团培养：将在固体培养基上预培养15天后的无菌花药转接入盛有2ml PMC液体培养基的培养皿(φ6cm)中，每皿12个花药，用镊子轻夹花药，释放出小孢子及其细胞团，然后将花药壁等碎片夹出。干净的小孢子悬浮液于26℃暗培养，4周后即可获得小孢子胚状体。

可用以下方法进行鉴定：

(1)植株诱导：将具胚状体的培养皿自暗室中移至光照条件下，二周后，将鱼雷期及子叶期的胚状体转接入植株诱导培养基PPI中，2000Lux，16小时光照，25℃下培养，诱导植株形成。

(2)倍性鉴定：取各瓶苗中龄叶片约150mg，在2ml LB01(Dolezel et al.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.Biol.Plant.，1989.31：113-120)细胞裂解液中用锋利刀片切碎后，经50μm尼龙膜过滤，滤液收集在BD流式细胞仪上样管中。1000rpm离心5分钟后，倒去上清液，沉淀中加入200μl浓度为50μg/ml的PI(propidium iodide)核染色剂，避光冷藏20分钟后，采用流式细胞仪测定植株的倍性水平。激发光波长488nm。对照材料为二倍体的供体母株叶片。

本发明的优点是：本发明在辣椒的游离小孢子培养体系上另辟蹊径，通过游离培养经预培养后的花药中的小孢子细胞及细胞团，获得了胚状体及其植株，显微镜检提供了胚状体的单细胞、单倍体发育途径的细胞学证据。该技术体系的建立，不仅是辣椒单倍体育种技术上的突破，而且该游离小孢子培养胚状体诱导体系还可能成为进行植物细胞分化、发育研究的良好实验体系。

附图说明

图1为35℃下预培养5-8天后花药中的小孢子：DAPI荧光染色揭示发育中小孢子的细胞核发生对称分裂，未发育小孢子细胞核消失。

图2为悬浮培养中的游离小孢子细胞团。

图3为细胞团分化出子叶端及胚根端。

图4为形成胚状体的TTC活力染色。

图5为游离小孢子细胞团培养形成的处于不同发育时期的胚状体。

图6为自胚状体形成的完整植株。

具体实施方式

1材料与方法

辣椒(包括甜椒、辣椒品种，Capsicum annuum L)供体母株生长于具防虫网的塑料大棚内，试验在5月至9月下旬间进行。

花药培养：摘取小孢子处于单核后期的花蕾，剥去花萼部分。以70％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振荡灭菌10分钟。无菌水清洗4次，剥取花药接种于固体培养基PAC(表1，参照CP培养基(Dumas，1981)，有改动)上，之后给以35℃或32℃高温暗处理8天，转入26℃暗培养。

游离小孢子及其细胞团培养：自预培养15天后的花药中采用直接挤压法游离小孢子及其细胞团，培养于液体培养基PMC(表1，参照CP培养基，有改动)中，每皿(φ6cm)2ml，12个花药，26℃暗培养，4周后调查胚状体形成情况。

在花药培养及游离细胞培养过程中，采用FDA检查细胞的活力(Heslop HJ，Heslop H Y.Evalution of pollen viability by enzymatically-induced fluorescence：Intracellular hydrolysis  of fluorescein diacetate.Stain Technol，1970，45：115-120)。DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞核的分裂情况(Colemen AW，Goff L J.Application of fluorochrome to pollen biology I.Mithramycin and4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)as vital stain and for quantification ofnuclear DNA.Stain Technol，1985，60：145-154)。对形成的胚状体采用0.5％氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察胚状体活力情况(国际种子检验协会，国际种子检验规程，颜启傅等译，技术标准出版社，1976，P24-26，31-32)。

植株诱导：将具胚状体的培养皿自暗室中移至光照条件下，二周后，将鱼雷期及子叶期的胚状体转接入植株诱导培养基PPI(表1，参照NT培养基)中，2000Lux，16小时光照，25℃下培养，诱导植株形成。

倍性鉴定：取各瓶苗中龄叶片约150mg，采用流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)测定植株的倍性水平。核染色剂为碘化丙啶(propidium iodide)，浓度50μg/ml，激发光波长488nm。对照材料为二倍体的供体母株叶片。DNA数据获取软件为CellQuest，倍性分析软件为ModFit。

表1  辣椒小孢子植株诱导所用培养基

  组成   成分   花药预培养  (PAC)  游离小孢子培  养(PMC)  植株诱导  (PPI)  大量  (mg/l)    O       铁盐  (mg/l)  微量  (mg/l)        有机  (mg/l)          激素  (mg/l)  糖(g/l)  活性炭  (g/l)  琼脂  (g/l)  pH  (NH₄)₂SO₄  NH₄NO₃  KNO₃  Ca(NO₃)₂.4H₂   CaCl₂.2H₂O  MgSO₄.7H₂O  KH₂PO₄  NaH₂PO₄.H₂O  KCl  FeSO₄.7H₂O  EDTA.Na₂  KI  CoCl₂.6H₂O  H₃BO₃  Na₂MoO₄.2H₂O  MnSO₄.H₂O  MnSO₄.4H₂O  CuSO₄.5H₂O  ZnSO₄，7H₂O  肌醇  烟酸  吡哆醇  硫胺素  泛酸钙  叶酸  生物素  维生素B12  谷氨酰胺  甘氨酸  kinetine  2.4-D        34  1238  2150  50   313  412  142  38  7  13.9  18.65  0.695  0.016  3.15  0.188  22.13   0.016  3.625  50.3  0.7  5.5  0.6  0.5   0.005  0.03   0.1  0.01  0.01  30  1.5   8   5.9  34  1238  2150  50   313  412  142  38  7  13.9  18.65  0.695  0.016  3.15  0.188  22.13   0.016  3.625  50.3  0.7  5.5  0.6  0.5   0.005  0.03   0.1  0.1   30      5.8   825  950    220  1233  680    27.8  37.3  0.83  0.03  6.2  0.25   22.3  0.025  8.6  100  5  0.5  0.5   0.5  0.05    2  0.1   30    10   5.9

2结果与分析

2.1胚状体发育的细胞学证据

实验镜检了自花药预培养开始至游离细胞的培养，胚状体形成的全部发育过程。

35℃高温处理5天后，自花药中游离小孢子。FDA检查显示，约25％的小孢子仍具有较好的活力，这些小孢子细胞膨大饱满并成圆形，而其它细胞不发出绿色荧光，失去活力，细胞仍然保持刚游离时具明显萌发沟的状态。DAPI检查显示，膨大细胞内，细胞核发生了均等分裂(图1)，而一直培养在26℃下的对照材料小孢子细胞核基本为非对称分裂，形成在染色深浅，大小上有差异的营养细胞及生殖细胞核。

35℃培养10天时，小孢子细胞核已经发生了2-多次分裂，发育极不同步；细胞壁形成或未形成，从而形成了多核细胞或多细胞团。细胞壁的形成有在一次核分裂后随即产生并导致细胞分裂的，也有在核分裂多次后才形成细胞壁，产生细胞分裂的，甚至在一个细胞内有12个左右的细胞核而尚没有发生细胞分裂的。观察也可见，发生了分裂的细胞已经脱出了花粉壁，而没有分裂的细胞尽管已经有多核，仍尚处于花粉壁中，在后期发生了细胞分裂，形成细胞团后才能脱出花粉壁。

培养15天后，将小孢子及其细胞团自花药中游离出来进行液体培养。观察发现细胞的分裂仍然很不同步，有多细胞团，也有仅处于二次分裂的细胞(图2)。细胞团在液体培养基中能够继续生长分化，在游离培养10天后，可以观察到一些细胞团已经有极性形成，产生子叶和胚根的分化(图3)。游离培养25天后，自球形期胚至子叶期胚的各级胚状体逐步形成，胚状体的发育程度表现出极其不同步特性(图5)，这与早期细胞分裂的不同步性是相一致的。

在暗培养条件下，液体培养基中形成的胚状体颜色为白色或灰白色。对其采用TTC染色法进行了活力检查，可见大部分胚状体具较好活力(图4)。

2.2自胚状体的植株再生

悬浮培养获得的小孢子胚状体在转接入植株诱导培养基后，经二次继代培养(约40天)，得到了株型正常的植株(图6)。表2列出了国际上辣椒单倍体诱导技术的有关工作及其结果。可以看出我们建立的游离小孢子培养技术，不管是在出胚率还是在胚的质量(与再生植株能力密切相关)上，都比以前报道的工作有了较大的提高。

表2  辣椒(Capsicum annuum L)单倍体育种不同技术及其效果^*

  材料类  型   胚状体形  成时间  (周)  具胚花药  数/100花  药  胚数  /100花  药  再生植株  数  /100花药  作者    花药  花药  花药漂  浮  花药  花药   花药  花药  花药  花药  游离小  孢子  4-8  6  9          6    18.7    34.0      16.5  4.0    13  0.23  125   84.4  3.5    6.0  38.3   183   4.8   0.01   8.0    28.9     43   Gyulai，2000  Hwang，1998  Ramon，1997   Mityko，1995  Kristiansen，  1993  Dumas，1981  王立浩，2004  李春玲，2001  张子君，2000  本发明 

^*表中所列数值全部为该报道中最好结果的数值

辣椒的花药培养中始终存在一个胚状体发育很不同步，发育不正常，质量差，成苗率低的问题。其正常胚仅占全部胚状体的1/20-1/10，而最后的植株成苗率仅为胚状体总数的1/10-1/100^[8]。因此辣椒花药培养的限制因素不是在分裂细胞频率以及胚状体的数目上，而是在胚状体的进一步正常发育，特别是原胚的正常发育从而提高具子叶，生长点的正常胚状体的比例上。本研究自预培养15天后的花药中游离小孢子细胞及细胞团，一方面，证明了对这些发育程度不等的细胞团的培养能够获得小孢子胚状体，另一方面可能由于细胞团在悬浮培养中的营养供给及生长空间较花药中好，本研究中获得了最高为12个花药产生22个胚状体的结果，且子叶期胚的的比例约为23％，与常规花药培养比较，表现较好。

无疑，本发明中游离小孢子细胞团培养路线，对于研究培养基因素或其它因素对于小孢子细胞分裂、分化的影响，研究植物细胞的发育及形态建成，优化辣椒的雄性单性生殖技术，提高正常胚状体频率是一个很好的研究体系。

2.3再生植株的倍性鉴定

取生长良好的叶片，采用流式细胞仪进行染色体倍性分析。结果表明，在再生株中，存在着单倍体，二倍体及混倍体植株。由于胚状体发育的早期镜检显示分裂细胞团来自小孢子，因此后二者应该是在小孢子细胞团的分裂分化过程中，染色体自然加倍形成的双单倍体材料，以及可能同一细胞团中，部分细胞染色体发生了加倍，而部分细胞没有发生染色体加倍产生的混倍体材料。