PDE4D在筛选治疗动脉粥样硬化的药物中的用途

摘要

本发明提供了PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的用途，用作鉴定可用于治疗动脉粥样硬化，优选周围动脉闭塞病(PAOD)，或者治疗再狭窄的化合物的新靶标。

说明书

技术领域

PDE4D磷酸二酯酶以一个家族的形式存在，此家族包含四种酶，即PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D。PDE4同工酶特异性地降解cAMP，是诸如抗抑郁药(例如咯利普兰)这类药剂的共同靶标。在PDE4D同种型中，已知几种拼接形式。其中长型同种型已知有6种，命名为PDE4D3、PDE4D4、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D7和PDE4D8。它们都有LR1和UCR1位点以及定位于这些位点C末端的结构域，但是有不同的N末端结构域。同种型PDE4D5由Bolger等公开(Characterization of five differentproteins produced by alternatively spliced mRNAs from the humancAMP-specific phosphodiesterase PDE4D gene，Biochem.J.(1997)，328，539-548)。同种型PDE4D7最近在W002/074992公开。PDE4D基因座曾经与中风联系起来(W002/074992)。然而，到目前为止还没有迹象表明PDE4D涉及动脉粥样硬化或者再狭窄。

本发明鉴定PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7为鉴定治疗动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或再狭窄的化合物的一种新靶标。

本发明鉴定PDE4为鉴定可用于治疗动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或再狭窄的化合物的一种新靶标。如图7、8所示，PDE4抑制剂cilomilast提高了PAOD大鼠模型的行走能力。在一个优选的实施方案中，新靶标为PDE4D，在一个更加优选的实施方案中，新靶标为PDE4D5(Seq ID No.4以及其他物种的同系物)或者PDE4D7(Seq ID No.1-3以及其他物种的同系物)。在极优的实施方案中，新靶标为PDE4D7。如图1和4所示，PDE4D5，尤其是PDE4D7在气囊损伤大鼠颈动脉的中膜和内膜中上调。

因此，本发明提供了PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的新用途，用于鉴定抑制动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或者再狭窄的化合物。最优选使用PDE4D7。

本发明还提供了鉴定和获得治疗动脉粥样硬化的化合物的新方法，所述方法包含测量PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7，最优选PDE4D7的磷酸二酯酶活性的激活或抑制，以及通过该方法鉴定的化合物。极优选地，所述化合物为PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7，尤其是PDE4D7的抑制剂。测量磷酸二酯酶活性的方法为本领域所众所周知。实施例中描述了一个用于这种测定的非限制性实例。用于治疗动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或者再狭窄的化合物的鉴定，可以包括施用预期抑制PDE4，优选PDE4D，更优选于PDE4D5或者PDE4D7，最优选于PDE4D7的化合物于诱导了动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病)或者再狭窄的动物，如大鼠气囊损伤模型，或者，像另一个非限制实施例那样，用喂养Western Type食物或标准固型食物的敲除ApoE的小鼠作为对照(例如Nakashima等，ApoE-deficient mice developlesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree，Arterioscler.Thromb.(1994)Jan；14(1)：133-40中描述的)或者用月桂酸模型(Kawamura等，1985，Arzneimittelforschung 35/7A：1154-1156)作为对照。所述动物优选非人类动物。因此，本发明还提供了鉴定和获取治疗动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或者再狭窄的化合物的方法，该方法包括对诱导动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病)或者再狭窄的动物施用预期为PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的激活剂或抑制剂的化合物，以及测量与施用安慰剂或载体的动物相比，它们的动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病)或者再狭窄的程度。极优选地，所述化合物为PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7，尤其是PDE4D7的抑制剂。

用于鉴定PDE4D的激活剂或抑制剂的方法可以包括使用核心PDE4D构建体(Seq ID No.5)，该核心构建体是具有所有PDE4D的长同种型共有氨基酸序列的PDE4D。图5显示，咯利普兰对核心PDE4D活性的抑制。

如本文中所用的，术语“PDE4的激活剂或抑制剂”，“PDE4D的激活剂或抑制剂”、“PDE4D5或PDE4D7的激活剂或抑制剂”是指激活或抑制PDE4、PDE4D、PDE4D5和/或PDE4D7的细胞功能的化合物，既可以直接作用于PDE4、PDE4D、PDE4D5和/或PDE4D7磷酸二酯酶，也可以间接调节PDE4、PDE4D、PDE4D5和/或PDE4D7的功能，例如通过改变其亚细胞靶向。

本发明还涉及通过上文中描述的任何一种方法所鉴定的化合物。

此外，本发明涉及包含通过本描述的方法所鉴定的PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的磷酸二酯酶活性激活剂或抑制剂的药物组合物以及可药用载体。极优选地，该药物组合物包含PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7磷酸二酯酶活性抑制剂。

短语“可药用”在此处是指在健全的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织相接触，并且没有过多毒性、刺激、变态反应或者其它问题或并发症，具有合理的利益/风险比例的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文中所用的，“可药用盐”是指已鉴定试剂的衍生物，其中亲本试剂通过制造其酸或碱盐而被修饰。药物可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基的无机或有机酸盐(如胺)，酸性残基(如羧酸)的碱性或有机盐。可药用盐包括，例如从无机或有机酸形成的亲本化合物的常规非毒性盐或季铵盐。例如，这种常规的非毒性盐包括那些源自于无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)的盐，以及由有机酸(如乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰苯甲酸、反丁烯二酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙基磺酸等)制备的盐。

本发明中可药用盐可以通过常规化学方法从含有碱或酸部分的亲本试剂合成。这些盐通常可以由这些化合物的自由酸或碱形式，按化学计量的量与适当的位于水或有机溶剂或者两者混合物中的碱或酸反应制备；通常优选非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、乙腈。恰当的盐的列表可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，1985，p.1418，在此引用其公开内容作为参考。

可以修饰本发明方法鉴定的试剂，以达到如下目的：(i)改变反应位点及活性谱，和/或(ii)提高效能，和/或(iii)降低毒性(提高治疗指数)，和/或(iv)降低副作用，和/或(v)改变反应的起始及药效持续时间，和/或(vi)改变动力学参数(吸收、分配、代谢和排泄)，和/或(vii)改变物理化学参数(溶解度、吸湿性、颜色、味道、气味、稳定性、状态)，和/或(viii)提高全身性特异性，器官/组织特异性，和/或(ix)优化应用形式和路径，通过如下方法达到上述目的：(i)羧基的酯化，或(ii)羟基与碳酸的酯化，或(iii)羟基与如磷酸、焦磷酸、硫酸、半琥珀酸的酯化作用，或(iv)形成可药用盐，或(v)形成可药用复合物，或(vi)合成药理学上的活性聚合体，或(vii)引入亲水部分，或(viii)在芳香基(aromates)或侧链上引入/交换取代基，改变取代模式，或(ix)通过引入等构或生物等构部分进行修饰，或(x)合成同系化合物，或(xi)引入分支侧链，或(xii)烷基取代基向环状类似物的转变，或(xiii)羟基向缩酮、缩醛的衍生，或(xiv)酰胺、苯基氨基甲酸盐的N-乙酰化，或(xv)合成Mannich碱、亚胺，或(xvi)酮或醛向Schiff’s碱、肟、缩醛、缩酮、烯醇酯、唑烷、thiozolidines或者它们的组合物的转化；和(b)用可药用载体或载体/稀释剂和所述修饰的产物配制具有香味或者味道的组合物或产品。

可以利用任何常规载体材料。该载体材料可以是适合肠内、经皮或肠胃外投药的有机或无机材料。合适的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、植物油、聚亚烷基二醇、凡士林等。此外，药物制品可能包含其它的药物活性剂。可以依照实践中公认的制药配方加入像调味剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液等额外的添加剂。

在一个实施方案中，本发明的方法包括施用治疗上有效量的反义寡核苷酸，它的序列能够特异性的结合编码PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的基因组DNA或mRNA分子的任何序列，以阻止PDE4mRNA，优选PDE4D mRNA，更优选PDE4D5或者PDE4D7mRNA，最优选PDE4D7mRNA的转录或翻译。“反义”意思是组合物中包含与某一特定核酸序列的“有义”链互补的核酸序列。一旦引入到细胞中，该互补核苷酸就会与细胞产生的内源序列相结合形成双链，阻断转录或翻译。例如，见Agrawal，S.辑(1996)《Antisense Therapeutics》，HumanaPress Inc.，Totawa NJ；Alama等(1997)Pharmacol.Res.36：171-178；Crooke，S.T.(1997)Adv.Pharmacol.40：1-49；以及Lavrosky等(1997)Biochem.Mol.Med.62(1)：11-22。反义序列可以是包括DNA、RNA的任何核酸材料或者任意核酸模拟物或类似物。例如，见Rossi等(1991)Antisense Res.Dev.1：285-288；Pardridge等(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.92：5592-5596；Nielsen和Haaima(1997)Chem.Soc.Rev.96：73-78；以及Lee等(1998)Biochemistry 37：900-1010。可以通过多种途径实现反义序列的递送，如通过用重组体载体进行细胞内递送。

通常优选具有大约15-25个碱基的反义寡核苷酸，因为它们易于合成并且能够产生所需的抑制效应。反义寡核苷酸的分子类似物也可用于此目的，并且具有额外的优点，如在药物中具有稳定性、分配或者有限毒性方面的优势。另外，化学反应基团，如铁偶联的乙二胺四乙酸(EDTA-Fe)，可以附着到反义寡核苷酸上，从而引起RNA在杂交位点处的裂解。反义方法在抑制基因体外翻译方面的上述这些以及其它用途为本领域所公知。例如，见Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem.172：289.

对PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7，最优选PDE4D7的抑制，也可通过RNA干扰来实现。作为一个非限制性实例，可以通过GB 2372995所公开的方法获得RNA干扰，用于抑制细胞或组织中靶基因的表达，该方法包括用如下两种病毒颗粒感染所述的细胞或组织：(a)包含代表有义RNA链的单链核糖核酸(ss RNA)的病毒颗粒，(b)包含代表反义RNA链的单链核糖核酸(ss RNA)的病毒颗粒，其中，有义和反义RNA链包含与所述靶基因的部分同源的核酸序列。

大鼠颈动脉气囊损伤是一个在动脉增生事件的研究中被充分接受的技术。它最初用于分析动脉粥样硬化的平滑肌细胞增生组分，但是最近也用作血管成形术后再狭窄的模型。在股动脉和颈动脉中对损伤的SMC反应是类似的。因为在技术上更加容易，在试验上重复性更好，该模型被应用于颈动脉。它一定会成为股动脉中的动脉粥样硬化——周围动脉闭塞病(PAOD)标志模型。如表1所示，在此模型中PDE4的抑制剂咯利普兰抑制新血管内膜的形成。

因此，本发明还提供了治疗动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或者再狭窄的方法，包含对患有动脉粥样硬化(优选周围动脉闭塞病(PAOD))或者再狭窄的受治疗者施用PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的激活剂或抑制剂。在极优选的实施方案中施用了PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7，最优选PDE4D7的抑制剂。因此，本发明涉及PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7的激活剂或抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化、再狭窄或优选周围动脉闭塞病的药物中的用途。在极优选的实施方案中使用了PDE4，优选PDE4D，更优选PDE4D5或者PDE4D7，最优选PDE4D7的抑制剂。

本发明提供基本如前所述，尤其是参考前述实施例的化合物、方法、用途和组合物。

附图简述：

图1：

(a)上方显示导管损伤颈动脉样本。用经过亲和纯化的抗-PDE4D7的兔多克隆抗体明确检测到大约80kDa的蛋白质。在未损伤的右颈动脉((a)下方)和取自未经处理动物的对照颈动脉(b)中都没有检测到PDE4D7，表明气囊导管损伤强列诱导PDE4D7的表达。

图2：

A：人与鼠PDE4D5N-末端的交叉反应：人与鼠PDE4D5具有98.85％的同一性。

B：PDE4亚家族A、B、C和D之间的UCR1、UCR2和催化结构域的比较，显示UCRs与催化结构域几乎同样高度保守。

图3：

人-大鼠-小鼠PDE4D7的交叉反应：

Q8CG05：小鼠PDE4D7(Seq ID No.1)；Q8CH04：大鼠PDE4D7(Seq ID No.2)；Q8IVD2：人PDE4D7(Seq ID No.3)

人-大鼠：96.8％

大鼠-小鼠：98.8％

图4：

气囊损伤大鼠颈动脉中PDE4D5和PDE4D7的表达

泳道1、2、3：气囊损伤后3天，气囊损伤的中膜和内膜、左颈动脉

泳道4、5、6：3天后，中膜，右颈动脉(未损伤的，对照)

泳道7：气囊损伤后14天，气囊损伤的中膜和内膜、左颈动脉

泳道8：14天后，未损伤的对照右颈动脉

泳道9、10：气囊损伤后7天，气囊损伤的中膜和内膜、左颈动脉

泳道11、12：14天后，未损伤的右颈动

图5：

咯利普兰的抑制作用。PDE4D核心构建体(DC)的磷酸二酯酶活性可以被咯利普兰抑制。咯利普兰抑制DC磷酸二酯酶活性的IC50(抑制酶活性50％的药物浓度)是0.34+/-0.06μM。

图6：

月桂酸模型中PDE4抑制剂Cilomilast对行走能力的影响：根据在踏车上的行走能力选择动物并将它们匹配为4组。用PDE3抑制剂Cilostazol作为阳性对照。

图7：

月桂酸模型中PDE4抑制剂对行走能力的影响：每隔一周测量一次最大行走距离。

图8：

月桂酸大鼠模型中PDE4抑制剂对行走能力影响的个体结果。

图9：

月桂酸大鼠模型中PDE4抑制剂对体重的影响。

图10：

月桂酸大鼠模型中PDE4抑制剂的副作用：异常粪便/腹泻。

图11：

月桂酸实验的PK分析：经口给药后PDE4抑制剂的血浆水平。

实施例

PDE4D5和PDE4D7在损伤的大鼠颈动脉中的表达

动物手术

从BRLCH-Fullinsdorf获得雌性(300-400g)Wistar Kyoto大鼠(RoRo)。用5mg/kg甲苄噻嗪(Rhompun，Bayer，FRG)和50mg/kg盐酸氯胺酮(Ketasol 100，Graeub，CH)腹膜内注射麻醉大鼠。在颈动脉杈暴露出左颈动脉，插入2F栓子切除术导管(Edwards laboratories，USA)。通过颈总动脉三次牵拉膨胀的气囊。颈外动脉永久结扎后封闭伤口，以可自由获取商品固型饲料和水成对饲养大鼠。

组织收获

损伤六周后，重新麻醉并且通过静脉注射过量的麻醉剂杀死动物。打开体腔后，用冷PBS通过放置在主动脉弓的导管对大鼠进行灌流，以冲去血液。用钟表匠镊子从动脉去除外膜组织。纵向打开颈动脉，通过滑动镊子去除任何残余的内皮。此时颈动脉只由平滑肌细胞组织组成。此时用液氮急剧冷冻颈动脉，合并后储存于-80℃。

实验组

合并为四个实验组：

1. 11个充气6周后的气囊损伤颈动脉

2. 11个对侧未受损的颈动脉

3. 12个未经处理大鼠的左颈动脉

4. 12个未经处理大鼠对侧的右颈动脉

抗体

基于人PDE4D7的特异序列(H₂N-CADLKSESENIQRPTS-CONH₂)制备抗体。用与柱子结合的合成肽通过亲和层析纯化该抗体。用人PDE4D3、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D7、PDE4D8的重组制品物作为样品通过免疫印迹检测该抗体的特异性。在这些实验中抗体特异性的检测hPDE4D7。人、大鼠或小鼠PDE4D7的高度保守性(如图3所示)暗示着该抗体具有与大鼠或小鼠交叉反应的能力。

通过类似方法基于特异序列H₂N-CEKSKTARKSVSPKLSP-CONH₂制备和表征抗PDE4D5肽抗体。人与大鼠PDE4D5的N-末端部分的高度一致性(如图2所示)再一次暗示着该抗体的交叉反应能力。

双向电泳样品的制备

冻存的颈动脉用液氮冷却并在研钵中研磨成粉末。然后置于样品溶液(7M尿素、2M硫脲、50mM Tris、2％(质量/体积，w/v)CHAPS(2-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸盐，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany、0.4％(w/v)二硫赤藓醇、0.5％(v/v)两性电解质(Resolytes 3.5-10，BDH，Poole，England))中进行匀浆，室温放置15分钟。匀浆液于100,000×g，4℃离心1小时，收集上清。用BioRad蛋白质测定法估计蛋白质浓度。

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳

固相pH梯度胶条(11cm，pH4-7，Amersham Biosciences，LittleChalfont，England)重新在7M尿素，2M硫脲，CHAPS，0.4％(w/v)二硫赤藓醇，0.5％(v/v)两性电解质泡涨6小时，然后放入Protean IEF单元加样杯(BioRad，Hercules，CA)中。含等量蛋白质的样品加到加样杯中，按照如下程序进行等电聚焦：250伏，2小时；逐渐升至2500伏，共8小时；2500伏8小时。胶条通过如下连续两步孵育进行平衡：首先在6M尿素、50mMTris-HCl，pH7.5、30％(v/v)甘油、2％(w/v)SDS、30mM二硫赤藓醇中孵育15分钟，然后在6M尿素、50mM Tris-HCl、pH7.5，30％(v/v)甘油、2％(w/v)SDS，136mM硫代乙酰胺中孵育15分钟。平衡过的胶条加入到标准4-15％凝胶的IEF槽中。按照凝胶制造商推荐的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸纤维素膜印迹(BioRad)。加入分子量标记物(Magic Marker，Invitrogen)用于估算分子量。

免疫印迹

印迹用溶于TBS的5％脱脂奶粉封闭，4℃摇床过夜。洗涤之后，加入100ng/ml溶于TBS+0.1％(v/v)Tween 20的经亲和纯化的抗PDE4D7抗体，印迹在室温被振荡孵育90分钟。洗涤印迹之后，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体(1/50000稀释，BioRad)，室温再次孵育印迹90分钟。洗涤之后，使用Super Signal West Femto底物(PIERCE，Rockford，IL)进行显影，暴露于胶片5-10分钟。

PDE4抑制剂咯利普兰对气囊导管损伤的大鼠颈动脉新内膜形成的抑制

药物施用

在PEG400中制备适当浓度(25mg或2.5mg/ml)的咯利普兰，加入微型渗透泵(2002 Alzet)中，对每只大鼠施用恒定剂量以0.8或8mg/kg/d的恒定剂量分别向每只大鼠递送。微泵在气囊导管损伤手术时置于已麻醉大鼠的颈部皮下。微泵通过sylastic导管连接颈静脉，以确保在整个14天的实验期内恒定的静脉内灌注。

在实验末期用LCMSMS测定血浆水平。

气囊导管损伤(参见上文的动物手术部分)后的结果

如表一所示，静脉内施用0.8或8mg/kg/day的咯利普兰显著抑制气囊导管损伤大鼠颈动脉新内膜形成。为了确证此结果，在独立的实验中对一套新的大鼠重复施用了更高剂量的药物(实验2)。由于使用的是PEG 400而非水，缓慢的泵流速使得在实验结束后仍然有初始体积20％的药物残留在泵内。因此，实验末期测定的血浆水平反映了稳态曝露(exposure)。值得注意的是，血浆水平良好的处于咯利普兰对PDE4酶的抑制剂常数Ki预期范围内。

  实验  (数量)  咯利普兰剂量  (mg/kg/d)  新血管内皮的抑制  (％安慰剂结果)  血浆水平  (nM)  p  n  2002-33  2002-33  2003-2  8  0.8  8  48  33  37  570±70  70±24  420±150  ＞0.05  ＞0.05  ＞0.05  10  10  9

表1显示了咯利普兰介导的抑制新血管内膜形成效力的数据概要，该数据是在塑料嵌入交叉部分通过组织形态测量术在包埋塑料的横切面上测量的(每个颈动脉两个)。

重组体PDE4D5和PDE4D7同种型的表达

PDE4D同种型5和7以及核心构建体的克隆

核心构建体：

通过在FDV序列之前引入2个额外氨基酸(K和L)的具有1个HindIII克隆位点的5′寡核苷酸(gatgaattcaagctttttgatgtggacaatggcaca)进行PCR，生成编码对所有的PDE4D同种型3-8所共用的从羧基末端的FDV氨基酸序列到LF1拼接位点的核心片断的cDNA。在3′末端用一组引物产生天然序列(gtgatatctcattatcacgtgtcaggagaacgatcatctatgaca)或者额外编码6个组氨酸残基的序列(gtgatatctcattatcaatgggatggtgatggtgcgtgtcaggagaacgatcatctatgac)，以便能够迅速纯化重组蛋白。此编码核心构建体的cDNA以EcoRI-EcoRV片断克隆到表达载体pENTR^TMla(GIBCO/BRL)。

同种型(核心构建体除外)：

通过用具有用于定向克隆的EcoRI和HindIII末端限制酶位点的合成寡核苷酸产生编码同种型特异性N-末端的DNA片断。这些同种型特异性DNA片断通过HindIII位点与核心构建体序列融合，引入2个额外的氨基酸残基(K和L)。在表达前，通过DNA测序来确证该克隆的完整性。

PDE4D同种型以及核心构建体在昆虫细胞中的表达

cDNA克隆到用于在昆虫细胞中表达的pFASTBAC1载体(LifeTechnologies.Inc)中，该克隆产物通过测序确证。在重组到杆状病毒基因组后，纯化的病毒DNA转化入昆虫细胞。Sf9细胞于27℃培养在具有5％(v/v)胎牛血清的TC100培养基(Bio Whittaker)中。生成病毒库存，测定浓度为产生具有1.5×10⁹pfu/ml滴度的病毒储库。为了大规模生产同种型，以1的感染复数(MOI)感染1-24升Sf9细胞的发酵液。

在一个实施例中，6×His标签PDE4D多肽DC、D5和D7在培养于1升摇瓶中的Sf9细胞中生成，细胞于无血清的SF1培养基中培养。在重组杆状病毒感染3天后收获感染的细胞。

在另一个实施例中，PDE4D核心构建体DC在24升的气举式(Airlifter)发酵灌中产生，发酵灌中加入15升培养基(不加血清的SF1)、0.15升脂类和9升Sf9细胞。在整个发酵过程中，细胞培养于pH6.2，27.0+/-0.2℃和30.0+/-0.5％pO₂的条件下。细胞生长3天。感染的细胞数量为2.3×10⁶细胞/毫升。细胞用450毫升重组杆状病毒感染。感染68小时后收获细胞，细胞沉淀和浓缩的上清保存于-80℃，直到进一步处理。

6×His标签PDE4D同种型的纯化

过量表达各同种型的来自1升培养液的Sf9细胞，在冰上悬浮于50ml50mM HEPES pH7.8、300mM NaCl、10mM咪唑、1mM DTT，补加蛋白酶抑制剂(一个蛋白酶抑制剂混合物片剂“完整的，不含EDTA”；Roche)。用50ml Dounce匀浆器破裂细胞，匀浆混合物于70,000g，4℃离心1小时(Kontron TFT 45.94转头，30,000rpm)。上清通过孔径1.2pm的滤器(Minisart；Sartorius，Germany)过滤，然后上样到6毫升Ni-NTA琼脂糖柱上，流速为2ml/min。用50mM HEPES，pH7.8、300mM NaCl、10mM咪唑平衡后，用含于同一缓冲液的30ml10-230mM线性梯度的咪唑洗脱蛋白质。合并考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析的含有PDE4D同种型的级分，冻存于-80℃。对于每种不同的PDE4D同种型制品要使用新的Ni-NTA琼脂糖材料，防止同种型之间交叉污染。

6×His标签PDE4D同种型的特异活性

通过SDS-PAGE估计Ni-NTA琼脂糖纯化的同种型制品的相对浓度。上样等体积的同种型制品于梯度凝胶(4-12％ NuPage；Invitrogen)上。电泳后，考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶通过视频映像系统成像。用(Macintosh计算机)和不受版权限制的软件″NIH Image″，版本1.61(美国National Institutes of Health开发，可通过如下网址获取http：//rsb.info.nih.gov/nih-image/)整合PDE4D条带的光密度。软件返回的每个PDE4D条带的整合随机单元反映了原始库中PDE4D的相对浓度。PDE4D和微管蛋白条带的身份通过独立的SDS-PAGE、切取相应条带、胰蛋白酶裂解、用MALDI-MS鉴定胰蛋白酶消化的肽段来证实。

用商用放射磷酸二酯酶测定法(cAMP-依赖的磷酸二酸酶[3H]测定法；Amersham Pharmacia Biotech)测定等体积的稀释10⁶倍的纯化同种型的活性，按制造商的说明操作。获得的随机活性单元反映了原始库中PDE4D的相对活性。

用相对浓度值除相对活性值计算得到PDE4D同种型的相对特异活性。通过大小排阻层析(SEC)定性研究聚集

将50μl Ni-NTA琼脂糖纯化的同种型制品注入Superose 12大小排阻柱(PC3.2/30型；Amersham Pharmacia Biotech)，用50mM Tris-HCl，pH7.7、100mM NaCl、0.5mM MgCl₂在4℃进行平衡，流速为0.1ml/min。记录278nm层析图。从洗脱体积开始，以50μl的级分收集洗脱液。

磷酸二酯酶活性的测定与抑制

用IMAP FP-测定法来测定磷酸二酯酶活性。用HEFPPhosphodiesterase Assay Kit(Molecμlar Devices)测定核心构建体以及PDE4D 3、5或7的磷酸二酯酶活性。2μl PDE4D 5或7或PDE4D核心构建体，2μl cAMP(终浓度40nM)以及1μl检测底物或载体在摇床上孵育45分钟。加入12μl试剂盒(具有1∶320稀释的珠子)提供的BindingSolution，反应混合物在摇床上孵育2小时。通过Packard BioScience Fusiona-FP HT，用Polarizer 535作发射光滤光器，Fluorescein 485/20作激发滤光片，测量样品荧光偏振。用咯利普兰作为抑制剂来测定PDE4D核心构建体磷酸二酯酶活性的抑制，PDE4D核心构建体的使用浓度为30ng/ml。PAOD的大鼠月桂酸模型(Kawamura等，1985，Arzneimittelforschung35/7A：1154-1156)

大鼠动脉注射75μg溶于10μl纯乙醇的月桂酸。用组织粘合剂封闭邻近股动脉的注射位点。伤口愈合，允许动物痊愈。如图6所示，在注射月桂酸之前训练大鼠在踏车上行走。通过所示的管饲法施用药物。此处理引起导致PAOD的小血管炎症。强制大鼠在踏车上以25m/min的速度和4.5％的坡度练习，直到它们疲劳。疲劳定义为直到5次小的电刺激累加施用于大鼠才能使之重新在踏车上奔跑所需要的时间。

PDE4的抑制剂Cilomilast与PDE3抑制剂Cilostazol进行比较。Cilostazol用于治疗PAOD，因此作为阳性对照。Cilomilast显示出与Cilostazol同等的效力(图7)。

此实验显示，PDE4的抑制剂可以提高PAOD大鼠模型的行走距离。

                              序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>PDE4D在动脉粥样硬化或再狭窄中

<130>Case 21729

<160>4

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>747

<212>PET

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠PDE4D7

<222>(1)..(747)

<223>

<400>1

Met Glu Arg Asn Thr Cys Asp Val Leu Ser Arg Ser Lys Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Glu Glu Thr Leu His Ser Cys Asn Asp Glu Glu Asp Pro Phe Arg Gly

            20                  25                  30

Met Glu Pro Tyr Leu Val Arg Arg Leu Ser Ser Arg Ser Ile Gln Leu

        35                  40                  45

Pro Pro Leu Ala Phe Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asp Leu Arg Ser Glu

    50                  55                  60

Ser Glu Asn Ile Pro Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Lys Ile Leu Pro

65                  70                  75                  80

Leu Ile Ala Val Thr Ser Ala Asp Ser Thr Gly Phe Asp Val Asp Asn

                85                  90                  95

Gly Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu

        115                 120                 125

Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser

    130                 135                 140

Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu

145                 150                 155                 160

Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg

                165                 170                 175

Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys

            180                 l85                 190

Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr

        195                 200                 205

Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp

    210                 215                 220

Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser

225                 230                 235                 240

Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr

                245                 250                 255

His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Tyr Ile

            260                 265                 270

Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro

        275                 280                 285

Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser

    290                 295                 300

Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Cys Ile

305                 310                 315                 320

Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

                325                 330                 335

Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu

            340                 345                 350

Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln

        355                 360                 365

Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile

    370                 375                 380

Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr

385                 390                 395                 400

His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu

                405                 410                 415

Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu

            420                 425                 430

Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val

        435                 440                 445

Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr

    450                 455                 460

Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys

465                 470                 475                 480

Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys

                485                 490                 495

Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Ala Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr

            500                 505                 510

Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val

        515                 520                 525

Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr

    530                 535                 540

Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu

545                 550                 555                 560

Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg

                565                 570                 575

Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly

            580                 585                 590

Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys

        595                 600                 605

Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr

    610                 615                 620

Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu

625                 630                 635                 640

Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser

                645                 650                 655

Pro Ala Pro Asp Asp Gln Glu Asp Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys

            660                 665                 670

Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu

        675                 680                 685

Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser

    690                 695                 700

Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp

705                 710                 715                 720

Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Ala Glu Glu Glu Ser Gln Pro Gln

                725                 730                 735

Thr Gly Val Ala Asp Asp Cys Cys Pro Asp Thr

            740                 745

<210>2

<211>747

<212>PRT

<213>大鼠

<220>

<221>大鼠PDE4D7

<222>(1)..(747)

<223>

<400>2

Met Glu Arg Asp Thr Cys Asp Val Leu Ser Arg Ser Lys Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Glu Glu Thr Leu His Ser Cys Asn Glu Glu Glu Asp Pro Phe Arg Gly

            20                  25                  30

Met Glu Pro Tyr Leu Val Arg Arg Leu Ser Ser Arg Ser Ile Gln Leu

        35                  40                  45

Pro Pro Leu Ala Phe Arg Gln Leu Glu Gln Ala Asp Leu Arg Ser Glu

    50                  55                  60

Ser Glu Asn Ile Pro Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Lys Ile Leu Pro

65                  70                  75                  80

Leu Ile Ala Val Thr Ser Ala Asp Ser Ser Gly Phe Asp Val Asp Asn

                85                  90                  95

Gly Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu

        115                 120                 125

Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser

    130                 135                 140

Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu

145                 150                 155                 160

Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg

                165                 170                 175

Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys

            180                 185                 190

Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr

        195                 200                 205

Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp

    210                 215                 220

Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser

225                 230                 235                 240

Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr

                245                 250                 255

His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Tyr Ile

            260                 265                 270

Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro

        275                 280                 285

Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser

    290                 295                 300

Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Cys Ile

305                 310                 315                 320

Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

                325                 330                 335

Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu

            340                 345                 350

Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln

        355                 360                 365

Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile

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Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu

            420                 425                 430

Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val

        435                 440                 445

Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr

    450                 455                 460

Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys

465                 470                 475                 480

Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys

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Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr

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Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val

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Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu

545                 550                 555                 560

Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg

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Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly

            580                 585                 590

Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys

        595                 600                 605

Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr

    610                 615                 620

Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu

625                 630                 635                 640

Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser

                645                 650                 655

Pro Ala Pro Asp Asp Gln Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys

            660                 665                 670

Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Cys Glu Ser Asp Thr Glu

        675                 680                 685

Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser

    690                 695                 700

Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp

705                 710                 715                 720

Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Ala Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu

                725                 730                 735

Thr Cys Val Pro Asp Asp Cys Cys Pro Asp Thr

            740                 745

<210>3

<211>748

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>人PDE4D7

<222>(1)..(748)

<223>

<400>3

Met Lys Arg Asn Thr Cys Asp Leu Leu Ser Arg Ser Lys Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Glu Glu Thr Leu His Ser Ser Asn Glu Glu Glu Asp Pro Phe Arg Gly

            20                  25                  30

Met Glu Pro Tyr Leu Val Arg Arg Leu Ser Cys Arg Asn Ile Gln Leu

        35                  40                  45

Pro Pro Leu Ala Phe Arg Gln Leu Glu Gln Ala Asp Leu Lys Ser Glu

    50                  55                  60

 Ser Glu Asn Ile Gln Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Lys Ile Leu Pro

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                85                  90                  95

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            100                 105                 110

Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu

        115                 120                 125

Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser

    130                 135                 140

Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu

145                 150                 155                 160

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Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys

            180                 185                 190

Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr

        195                 200                 205

Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp

    210                 215                 220

Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser

225                 230                 235                 240

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His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile

            260                 265                 270

Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro

        275                 280                 285

Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser

    290                 295                 300

Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile

305                 310                 315                 320

Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

                325                 330                 335

Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu

            340                 345                 350

Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln

        355                 360                 365

Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile

    370                 375                 380

Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr

385                 390                 395                 400

His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu

                405                 410                 415

Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu

            420                 425                 430

Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val

        435                 440                 445

Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr

     450                 455                 460

Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys

465                 470                 475                 480

Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys

                485                 490                 495

Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr

            500                 505                 510

Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val

        515                 520                 525

Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr

    530                 535                 540

Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu

545                 550                 555                 560

Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg

                565                 570                 575

Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly

            580                 585                 590

Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys

        595                 600                 605

Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr

    610                 615                 620

Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu

625                 630                 635                 640

Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser

                645                 650                 655

Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys

            660                 665                 670

Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu

        675                 680                 685

Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser

    690                 695                 700

Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp

705                 710                 715                 720

Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro

                725                 730                 735

Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

            740                 745

<210>4

<211>747

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>人PDE4D5

<222>(1)..(747)

<223>

<400>4

Met Ala Gln Gln Thr Ser Pro Asp Thr Leu Thr Val Pro Glu Val Asp

1               5                   10                  15

Asn Pro His Cys Pro Asn Pro Trp Leu Asn Glu Asp Leu Val Lys Ser

            20                 25                 30

Leu Arg Glu Asn Leu Leu Gln His Glu Lys Ser Lys Thr Ala Arg Lys

        35                 40                 45

Ser Val Ser Pro Lys Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Arg Asn Ser Pro

    50                 55                 60

Arg Leu Leu Arg Arg Met Leu Leu Ser Ser Asn Ile Pro Lys Gln Arg

65                  70                  75                  80

Arg Phe Thr Val Ala His Thr Cys Lys Leu Phe Asp Val Asp Asn Gly

                85                  90                  95

Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp Pro Met Thr Ser Pro Gly Ser

            100                 105                 110

Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val His Ser Gln Arg Arg Glu Ser

        115                 120                 125

Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Lys Ser Met

    130                 135                 140

Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp Ile His Gly Asp Asp Leu Ile

145                 150                 155                 160

Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Arg Thr Val Arg Asn

                165                 170                 175

Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln Asp Arg Ala Pro Ser Lys Arg

            180                 185                 190

Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile Asn Lys Ala Thr Ile Thr Glu

        195                 200                 205

Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp

    210                 215                 220

Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln Thr Arg His Ser Val Ser Glu

225                 230                 235                 240

Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His

                245                 250                 255

Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser

            260                 265                 270

Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr

        275                 280                 285

Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly

    290                 295                 300

Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro

305                 310                 315                 320

Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu

            340                 345                 350

Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile Met His Thr Ile Phe Gln Glu

        355                 360                 365

Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr

    370                 375                 380

Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr His Ala Asp Val Ala Tyr His

385                 390                 395                 400

Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val Gln Ser Thr His Val Leu Leu

                405                 410                 415

Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala

            420                 425                 430

Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser

        435                 440                 445

Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn

    450                 455                 460

Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu

465                 470                 475                 480

Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln

                485                 490                 495

Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp

            500                 505                 510

Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu

        515                 520                 525

Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser

    530                 535                 540

Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser

545                 550                 555                 560

Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile

                565                 570                 575

Met Glu Glu Phe Phe Ara Gln Gly Asp Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met

            580                 585                 590

Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser

        595                 600                 605

Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp

    610                 615                 620

Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu

625                 630                 635                 640

Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro

                645                 650                 655

Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe

            660                 665                 670

Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys

        675                 680                 685

Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys

    690                 695                 700

Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu

705                 710                 715                 720

Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu

                725                 730                 735

Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro Asp Thr

            740                 745

<210>5

<211>664

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>核心PDE4D

<222>(1)..(664)

<223>

<400>5

Met Phe Asp Val Asp Asn Gly Thr Ser Ala Gly Arg Ser Pro Leu Asp

1               5                   10                  15

Pro Met Thr Ser Pro Gly Ser Gly Leu Ile Leu Gln Ala Asn Phe Val

            20                  25                  30

His Ser Gln Arg Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Arg Ser Asp Ser Asp Tyr

        35                  40                  45

Asp Leu Ser Pro Lys Ser Met Ser Arg Asn Ser Ser Ile Ala Ser Asp

    50                  55                  60

Ile His Gly Asp Asp Leu Ile Val Thr Pro Phe Ala Gln Val Leu Ala

65                  70                  75                  80

Ser Leu Arg Thr Val Arg Asn Asn Phe Ala Ala Leu Thr Asn Leu Gln

                85                  90                  95

Asp Arg Ala Pro Ser Lys Arg Ser Pro Met Cys Asn Gln Pro Ser Ile

            100                 105                 110

Asn Lys Ala Thr Ile Thr Glu Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Glu

        115                 120                 125

Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Leu Gln

    130                 135                 140

Thr Arg His Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met

145                 150                 155                 160

Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn

                165                 170                 175

Gln Val Ser Glu Phe Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln His Glu

            180                 185                 190

Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Arg

        195                 200                 205

Pro Met Ser Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser

    210                 215                 220

Leu Thr Asn Ser Ser Ile Pro Arg Phe Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu

225                 230                 235                 240

Asp Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Val Asn Lys Trp Gly Leu His

                245                 250                 255

Val Phe Arg Ile Ala Glu Leu Ser Gly Asn Arg Pro Leu Thr Val Ile

            260                 265                 270

Met His Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile

        275                 280                 285

Pro Val Asp Thr Leu Ile Thr Tyr Leu Met Thr Leu Glu Asp His Tyr

    290                 295                 300

His Ala Asp Val Ala Tyr His Asn Asn Ile His Ala Ala Asp Val Val

305                 310                 315                 320

Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Glu Ala Val Phe

                325                 330                 335

Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ser Ala Ile His Asp

            340                 345                 350

Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser

        355                 360                 365

Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Ser Ser Val Leu Glu Asn His His

    370                 375                 380

Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu Asn Cys Asp Ile Phe

385                 390                 395                 400

Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Ser Leu Arg Lys Met Val Ile

                405                 410                 415

Asp Ile Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Asn Leu Leu Ala

            420                 425                 430

Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val

        435                 440                 445

Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Ser Asp Arg Ile Gln Val Leu Gln Asn Met

    450                 455                 460

Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Pro Leu Gln Leu Tyr

465                 470                 475                 480

Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp

                485                 490                 495

Arg Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His

            500                 505                 510

Asn Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val

        515                 520                 525

His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val His Pro Asp Ala Gln

    530                 535                 540

Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Glu Trp Tyr Gln Ser Thr

545                 550                 555                 560

Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Ala Pro Asp Asp Pro Glu Glu Gly Arg

                565                 570                 575

Gln Gly Gln Thr Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Asp

            580                 585                 590

Gly Glu Ser Asp Thr Glu Lys Asp Ser Gly Ser Gln Val Glu Glu Asp

        595                 600                 605

Thr Ser Cys Ser Asp Ser Lys Thr Leu Cys Thr Gln Asp Ser Glu Ser

    610                 615                 620

Thr Glu Ile Pro Leu Asp Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Val Gly Glu

625                 630                 635                 640

Glu Glu Glu Ser Gln Pro Glu Ala Cys Val Ile Asp Asp Arg Ser Pro

                645                 650                 655

Asp Thr His His His His His His

            660

<210>6

<211>87

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>人PDE4D5N-末端结构域

<222>(1)..(87)

<223>

<400>6

Met Ala Gln Gln Thr Ser Pro Asp Thr Leu Thr Val Pro Glu Val Asp

1               5                   10                  15

Asn Pro His Cys Pro Asn Pro Trp Leu Asn Glu Asp Leu Val Lys Ser

            20                  25                  30

Leu Arg Glu Asn Leu Leu Gln His Glu Lys Ser Lys Thr Ala Arg Lys

        35                  40                  45

Ser Val Ser Pro Lys Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Arg Asn Ser Pro

    50                  55                  60

Arg Leu Leu Arg Arg Met Leu Leu Ser Ser Asn Ile Pro Lys Gln Arg

65                  70                  75                  80

Arg Phe Thr Val Ala His Thr

                85

<210>7

<211>88

<212>PRT

<213>大鼠

<220>

<221>大鼠PDE4D5N-末端结构域

<222>(1)..(88)

<223>

<400>7

Met Ala Gln Gln Thr Thr Ser Pro Asp Thr Leu Thr Val Pro Glu Val

1               5                   10                  15

Asp Asn Pro His Val Pro Asn Pro Trp Leu Asn Glu Asp Leu Val Lys

            20                  25                  30

Ser Leu Arg Glu Asn Leu Leu Gln His Glu Lys Ser Lys Thr Ala Arg

        35                  40                  45

Lys Ser Val Ser Pro Lys Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Arg Asn Ser

    50                  55                  60

Pro Arg Leu Leu Arg Arg Met Leu Leu Ser Ser Asn Ile Pro Lys Gln

65                  70                  75                  80

Arg Arg Phe Thr Val Ala His Thr

                85