五味子在制备抗肿瘤药物及肿瘤多药耐药逆转剂中的应用

摘要

本发明提供了五味子在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明所指的五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.。通常是采用五味子的提取物来制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物。五味子应用于制备治疗肿瘤药物，具有临床应用前景，五味子可有效逆转肿瘤的多药耐药性，五味子提取物作用于P－糖蛋白、MRP1和MXR；另外。五味子对人体正常细胞具有较低的毒性，但对肿瘤细胞有毒性，因此，五味子也具有很好的制备治疗肿瘤药物和临床肿瘤化疗的应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及中草药五味子在制备治疗肿瘤药物中的明确应用，尤其是五味子在制备抗肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物中的应用。

(二)背景技术

肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一，肿瘤化疗是治疗肿瘤的一种主要手段。然而肿瘤化疗会因肿瘤细胞获得抗药性而失败。

肿瘤细胞产生多药耐药的原因有多种，其中最主要的是肿瘤细胞表达ATP结合的转运蛋白[ATP binding cassette(ABC)transporters]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，多药耐药相关蛋白1(multidrug resistant associatedprotein 1，MRP1)和乳癌抗药蛋白(breast cancer resistance protein BCRP，也被称为MXR或ABCG2)，是目前公认的几个导致肿瘤多药耐药的主要蛋白质。这些蛋白质均为跨膜蛋白质，他们的作用相当于药泵，可将进入肿瘤细胞内的药物排出细胞外，使得细胞内的药物浓度很低，肿瘤细胞因此可逃避抗肿瘤药的攻击。(Gottesman MM，Fojo T & Bates SE.Nature Review/cancer.2：48-58，2002)。

目前在临床上使用的抗癌药如阿霉素、丝裂霉素、表阿霉素、柔红霉素、长春新碱、高三尖杉酯、米脱蒽醌等药都逃脱不了肿瘤抗药性的命运，因为这些药物均为P-糖蛋白、或MRP1或BCRP的底物。因此，当肿瘤细胞内P-糖蛋白、或MRP1或BCRP高表达后，肿瘤细胞获得的抗药性并不仅仅对某一种抗癌药，而是对多种抗癌药。要使高表达P-糖蛋白、或MRP1或BCRP的肿瘤细胞重新获得对抗癌药的敏感性，最有效的方法就是抑制这些蛋白质的功能，使其不能发挥‘药泵’的功能。因此，研制抑制这些蛋白质功能的药物对肿瘤的化疗有重要的意义。目前，临床上有很多种抗癌药，但没有一种是针对P-糖蛋白、或MRP1或BCRP的药物。因此，研制出这样一种药物刻不容缓。

近年研制的与Pgp相互作用的是MDR逆转剂。苯烷胺类衍生物钙拮抗剂维拉帕米是最早发现并具有较强逆转P-糖蛋白介导的MDR活性的苯烷胺类衍生物。其对血管、心肌的钙拮抗活性与其MDR逆转作用无关，而与心血管系统副作用有关，其副作用严重妨碍临床应用。

五味子，木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.或木兰科植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实，五味子在《神农本草经》中被列为上品，具有收敛、固涩、益气生津、补肾宁心的作用，是中医常用的滋补强壮药，具有多种药理作用，但未见其有明确抗肿瘤的报道，尤其未见其有抗肿瘤多药耐药的报道。

(三)发明内容

本发明的目的是为了提供一种可作为抗肿瘤细胞多药耐药性逆转剂的药物。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

五味子应用于制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物。通常是采用五味子的提取物来制备逆转肿瘤细胞多药耐药性药物。五味子提取物可采用药物可接受的有机溶剂用回流法、渗漉法提取得到，或是超临界提取等多种方法得到。

通常用非质子极性有机溶剂以回流法提取：以乙醇为提取剂为例，将五味子果实粉碎成粗粉，浸泡于4倍量50％～100％乙醇回流温度提2～3次，每次2～12小时，过滤，收集并合并滤液，减压回收乙醇，浓缩滤液得浸膏。同样也可用热浸的方法，要求浸渍的时间相对长一些，每次6～24小时。以上的乙醇也可用甲醇、丙醇等各种醇代替；也可用其他有机溶剂如乙酸乙酯、乙醚等酯类或醚类溶剂代替。

以渗漉法得到五味子提取物也是常用的方法：取五味子粉末用6倍量95％乙醇渗漉提取，渗漉速度3～4ml/min慢速渗漉，回收乙醇沥出液，减压回收乙醇，浓缩得稠膏。同样甲醇、丙醇、乙酸乙酯、醚类溶剂或非质子极性溶剂等也可用作渗漉提取剂。

此外还可用超临界提取法：将五味子细粗粉于25MPa、45℃下用超临界CO₂提取2h，得褐色稠液。

五味子在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物中的应用，所述的逆转剂药物逆转由P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)导致的肿瘤细胞的多药耐药。进一步，所述的逆转剂药物逆转由多药耐药相关蛋白(multidrug resistantassociated protein，MRP1)导致的肿瘤细胞的多药耐药。更进一步所述的逆转剂药物逆转由乳癌抗药蛋白(breast cancer resistant protein，BCRP，也称为MXR或ABCG2)的肿瘤细胞的多药耐药。

所述的逆转剂药物还可含有对五味子作为肿瘤细胞多药耐药性逆转剂敏感的抗肿瘤药物，及药物赋形剂或载体。即所述的含有五味子的逆转剂药物同时加入对五味子作为肿瘤细胞多药耐药性逆转剂敏感的抗肿瘤药物及药物赋形剂，相当于用于治疗多药耐药肿瘤患者时，给予一个剂量的抗肿瘤药物的同时再给一个剂量的五味子提取物。

所述的抗肿瘤药物为下列之一或其任意比例的混合：

①P-糖蛋白的底物  ②MRP1的底物  ③BCRP的底物。

具体的，所述的抗肿瘤药物为下列之一或其两种或两种以上以任意比例的混合：

Doxorubicin阿霉素；Actinomycin放线菌素；Altreatamine；Bleomycin博来霉素；Busulphan白消安；Capecitabine卡培他滨；Carboplatin卡铂；Carmustine卡莫司汀；Chlorambucil苯丁酸氮芥；Cisplatin顺铂；cyclophosphamide环磷酰胺；cytarbine阿糖胞苷；dacarabazine，daunorubicin柔红霉素；epirubicin表阿霉素；etoposide依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；fludarbine氟阿糖腺苷酸；fluorouracil氟尿嘧啶；gemcitabine吉西他滨；herceptin赫赛汀；hydroxyurea羟基脲；idarubicin伊达比星；ifosfamide异环磷酰胺；irinotecan依立替康；lomustine洛莫司汀；环己亚硝脲；melphalan美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；mercaptopurine巯基嘌呤；methotrexate氨甲蝶呤；mitomycin丝裂霉素；mitozantrone米托蒽醌；二羟基蒽酮；oxaliplatin奥沙利铂；procarbazine丙卡巴肼；甲(基)苄肼；rituxan美罗华；steroids类固醇；streptozocin链佐星；链脲霉素；taxol紫杉醇，taxotere泰索帝；tamozolomide，thioguanine硫鸟嘌呤；thiotepa噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；tomudex雷替曲塞(raltitrexed)；topotecan拓扑替康；treosulfan曲奥舒凡；uracil-tegufur尿嘧啶；vinblastine长春碱；长春花碱；vindesine长春地辛；vinorelbine长春瑞宾。

所述的逆转剂药物可制成下列之一的剂型：①注射液  ②片剂  ③胶囊剂  ④颗粒剂  ⑤汤剂。

所述的逆转剂药物还可以含有其他逆转剂，或与其他逆转剂药物共同使用，也可含有其他中药组合物。

本发明还提示五味子具有明确的抗肿瘤作用，五味子可应用于制备治疗肿瘤的药物，或者是五味子提取物应用于制备治疗肿瘤药物。

本发明所述的五味子在制备治疗肿瘤药物中的应用的有益效果如下：(1)具有临床应用前景，五味子可有效逆转肿瘤的多药耐药性，五味子提取物作用于P-糖蛋白、MRP1和MXR；(2)五味子对人体正常细胞具有较低的毒性，但对肿瘤细胞有毒性，因此，五味子也具有很好的制备治疗肿瘤药物和临床肿瘤化疗的应用前景。

(四)附图说明

图1为P-糖蛋白在多药耐药细胞中的表达百分比。

图2为P-糖蛋白在多药耐药细胞中的表达量。

图3为MRP1在多药耐药细胞中的表达百分比。

图4为MRP1在多药耐药细胞中的表达量。

图5为五味子乙醇提取物增加P-gp高表达多药耐药肿瘤细胞内的柔红霉素积聚。

图6为五味子甲醇提取物增加P-gp高表达多药耐药肿瘤细胞内的柔红霉素积聚。

图7为五味子乙醇提取物增加MRP1高表达多药耐药肿瘤细胞内的柔红霉素积聚。

图8为五味子乙醇提取物对多药耐药肿瘤细胞抗药性逆转的量效关系。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述：

实施例1：五味子的提取

回流法：

(a)称取五味子15000g作为原料；

(b)将五味子果实粉碎成粗粉，浸泡于4倍量90％乙醇中12小时。这里所要求乙醇的浓度在50％～100％都可以，通常选70％～90％的乙醇作为提取剂，浸泡时间可以在6～24小时。

(c)将步骤(b)中的五味子乙醇浸泡液在回流温度提取3小时，过滤，收集滤液；

(d)将步骤(c)中的滤渣加入3倍量90％乙醇，在回流温度提取2小时，过滤并收集滤液；

(e)将步骤(d)中的滤渣加入3倍量90％乙醇，回流温度提取2小时，过滤并收集滤液；

(f)合并(c)(d)(e)收集到的滤液，减压回收乙醇至无乙醇味，浓缩得比重为1.23g/ml的浸膏，备用。

以上的乙醇也可用甲醇、丙醇等各种醇代替；也可用其他有机溶剂如乙酸乙酯、醚类溶剂等代替。

实施例2：五味子的提取

渗漉法：取5000g五味子粉末用6倍量95％乙醇渗漉，渗漉速度15ml/min。回收乙醇沥出液，减压回收乙醇至无乙醇味，浓缩得比重为1.15g/ml的浸膏，备用。以上的乙醇也可用甲醇、丙醇等各种醇代替；也可用其他有机溶剂如乙酸乙酯、醚类溶剂等代替。

实施例3：五味子的提取

超临界提取：将五味子样品1000g粉碎成粗粉(过40目筛)，置1L超临界CO₂萃取釜中，调节压力：25MPa，温度：45℃，流量：30kg/h，提取时间：2h。收集得到褐色萃取物。

实施例4：五味子片剂的制备

(1)称取实施例1所得五味子浸膏110g，乳糖500g，淀粉75g；

(2)将步骤(1)中的五味子浸膏、乳糖、淀粉混合均匀，喷加75％乙醇制成湿粒，用20目筛整粒，得到的湿粒在50℃条件下鼓风干燥；

(3)干燥后的颗粒经压片机压制成型。

实施例5：五味子胶囊的制备

称取实施例2所得五味子浸膏300g，加入0.5倍量的聚乙二醇，过25目筛制成颗粒，50℃～60℃鼓风干燥，用40目筛整粒装胶囊。这里聚乙二醇也可用甘油明胶代替。

实施例6：五味子冲剂的制备

(A)称取1000g五味子粗粉，加4倍量75％乙醇，浸泡过夜；

(B)将五味子粗粉与浸泡的乙醇放入回流装置，回流反应3小时，过滤，滤渣备用，滤液减压回收乙醇至无乙醇味，得到褐色乙醇提取物；

(C)将步骤(B)中的滤渣加入8倍量水煎煮3小时，过滤得黄色煎液，滤渣备用；

(D)步骤(C)所得滤渣加入6倍量水煎煮2小时，过滤得黄色煎液；

(E)合并(C)(D)步骤所得黄色煎液，浓缩成比重为1.05g/ml的浸膏；

(F)在步骤(E)的浸膏中加入适量糊精混合均匀，用喷雾干燥法制粒。

(G)将步骤(B)的乙醇提取物均匀地喷洒在步骤(F)制得的颗粒中，干燥，得棕色五味子冲剂。

实施例7：五味子汤剂的制备

(A)称取1000g五味子粗粉，加4倍量95％乙醇，浸泡过夜；

(B)将(A)放入回流装置，回流3小时，过滤，滤渣备用，滤液减压回收乙醇，得到褐色乙醇提取物；

(C)将步骤(B)所得滤渣中加入8倍量水，煎煮3小时，过滤得黄色煎液，滤渣备用；

(D)步骤(C)所得滤渣加入6倍量水，煎煮2小时，过滤得黄色煎液；

(E)合并(C)(D)步骤所得煎液，浓缩至1000ml；

(F)将步骤(E)所得浓缩液加入步骤(B)中的乙醇提取物，混匀即制成五味子汤剂。

实施例8：五味子针剂的制备

称取实施例1所得500g五味子浸膏，加入3倍量的新鲜注射用水，冷藏40小时，吸取上清液，上清液浓缩至500ml，再在滤液中加入500ml的新鲜注射用水，用20％NaOH调节PH值至6.7，冷藏40小时，吸取上清液，上清液加2％活性炭煮沸15分钟，过滤，冷藏24小时，用10％NaOH调节PH值至6.7，煮沸灭菌30分钟，冷藏24小时，吸取上清液过滤，调节PH值至6.7，加水新鲜注射用水至6000ml，膜过滤，，罐封、灭菌、包装。

实施例9：多药耐药细胞的P-糖蛋白(P-gp)和MRP1的检测。

(1)实验材料：

细胞株：K562/adr、MCF7/adr和KBV200多药耐药细胞株为Pgp蛋白高表达的细胞。K562/adr由浙江大学肿瘤研究所诱导建系，MCF-7/adr和KBV200多药耐药细胞株购自中国医学科学院血液研究所。HL60/adr为MRP1高表达的多药耐药肿瘤细胞株，购自中国医学科学院血液研究所。

试剂：P-gp的单克隆荧光标记抗体为美国BD公司R-PE-17F9。MRP1单克隆荧光抗体购自美国Santa Cruz公司。

仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，流式细胞仪(FACS Calibur，美国Becton-Dickinson公司)。

(2)实验方法：

细胞P-gp和MRP1表达测定：

取对数生长期各株细胞，收集细胞制成1×10⁶/ml的悬液，加入P-gp或MRP1单抗(1∶400)，4℃避光反应45min，PBS洗三次，用PBS垂悬后，流式细胞仪检测细胞荧光强度。

(3)实验结果：

图1为K562/ADR，MCF7/adr，KBV200的P-gp(P-glycoprotein)的表达与其亲本药敏细胞K562，MCF-7和KBV200的比较。K562/adr细胞中有98％的细胞表达P-gp，而K562细胞只有1％的细胞有P-gp的表达；MCF7/adr细胞中有96％的细胞表达P-gp，而MCF-7细胞只有3％的细胞有P-gp的表达；KBV200细胞中有92％的细胞表达P-gp，而KB细胞只有1％的细胞有P-gp的表达。图2为K562/ADR，MCF7/adr，KBV200的P-gp(P-glycoprotein)的表达量与其亲本药敏细胞K562，MCF-7和KBV200的比较。K562/adr、MCF7/adr KBV200细胞P-gp的表达量分别为其药敏亲本细胞K562、MCF-7和KB细胞的24.4，25.3和24.2倍。

图3为HL60/adr的MRP1的表达与其亲本药敏细胞HL60的比较。HL60细胞中有97％的细胞表达MRP1，而HL60细胞只有1％的细胞有MRP1的表达；

图4为HL60/adr的MRP1的表达量与其亲本药敏细胞HL60的比较。HL60/adr细胞MRP1的表达量为其药敏亲本细胞HL60细胞的23.4倍。

(4)结论：

K562/ADR，MCF7/adr，KBV200为P-gp高表达的多药耐药细胞株。即：P-gp为这些细胞多药耐药的主要原因。HL60/adr为MRP1高表达的多药耐药细胞株，即：MRP1为这些细胞多药耐药的主要原因。

实施例10：五味子乙醇或甲醇提取物的抗肿瘤作用

(1)实验材料：

细胞株：人白血病细胞株K562、HL60，人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MCF7，人大肠癌细胞SW480，来源于美国ATCC公司。培养在含有10％小牛血清的RPMI1640细胞培养液中。

试剂：按实施例2方法所得五味子的乙醇和甲醇提取物分别溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液。RPMI-1640培养基和小牛血清为美国Gibco产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品。

仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，FCM。

(2)实验方法：

细胞培养：

细胞株：人白血病细胞株K562、HL60，人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MCF7，人大肠癌细胞SW480培养在含有10％小牛血清的RPMI1640细胞培养液中。

MTT检验：

取对数生长期细胞，细胞分别接种于96孔培养板，10000个细胞/100ul/孔。在37℃、5％CO₂条件下培养过夜后，加不同浓度的五味子乙醇提取物100ul，调零孔和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔，培养72h后，每孔加5mg/ml MTT 20ul(调零组除外)，再培养4h，去培养液，加DMSO 100ul/孔，待结晶Formazan完全溶解后，用酶联免疫仪再波长570nm处调零组调零后读取吸光度(A)值。取4孔A值的均数按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC₅₀)，每实验重复三次。

五味子甲醇提取物MTT检验步骤同上。

(3)实验结果：

实验数据如表1

表1.五味子乙醇提取物对各种人肿瘤细胞的杀伤活性

  细胞株  IC₅₀(μg/ml)  K562  85  HL60  56  HepG2  87  MCF7  67  SW480  92

结论：从表1中可发现，五味子乙醇提取物可有效杀死多种肿瘤细胞。

表2.五味子甲醇提取物对各种人肿瘤细胞的杀伤活性

  细胞株  IC₅₀(μg/ml)  K562  78  HL60  63  HepG2  62  MCF7  84  SW480  75

结论：从表2中可发现，五味子甲醇提取物也可有效杀伤多种肿瘤细胞。五味子乙醇提取物和甲醇提取物对肿瘤细胞的杀伤作用相似。

实施例11：五味子乙醇提取物对人的正常细胞的毒性作用

(1)实验材料：

材料：人的正常外周血单核细胞、人骨髓间充质细胞、人肝细胞、人成纤维细胞培养于含有15％小牛血清的RPMI1640培养液中。

仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，FCM，高效液相色谱仪。

试剂：实施例2所得五味子的乙醇提取物溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液。RPMI-1640培养基和小牛血清为美国Gibco产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品。

仪器：培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，FCM。

(2)实验方法：

细胞株：以上细胞培养在含有10％小牛血清的RPMI1640细胞培养液中。细胞接种于96孔细胞培养板内，每孔20000个细胞，分组加入五味子乙醇提取物。放置于CO₂培养箱中培养，48小时后做MTT实验。

(3)实验结果：

五味子乙醇提取物对4种正常人细胞的毒性数据见表3。数据表明：五味子乙醇提取物在能杀死肿瘤细胞的药效浓度范围内，对正常细胞无毒性。

表3五味子乙醇提取物对正常细胞的杀伤活性

  细胞  IC₅₀(μg/ml)  人外周血单核细胞  ＞400  人肝细胞  ＞400  人成纤维细胞  ＞400  人骨髓间充质细胞  ＞400

实施例12：五味子乙醇提取物对小鼠的毒性作用

动物：ICR小鼠购自上海实验动物中心。

试剂：实施例2所得五味子乙醇提取物

实验方法：7只小鼠，每只小鼠灌胃五味子乙醇提取物(剂量：4g/kg体重)。

观察两周。

实验结果：7只小鼠未出现不良反应，说明五味子乙醇提取物的毒性非常低。

实施例13：五味子乙醇或甲醇提取物对多药耐药细胞株细胞内柔红霉素的积聚

(1)实验材料：

细胞株：K562/adr、MCF7/adr、KBV200多药耐药细胞株以Pgp蛋白高表达为主要耐药机制。

试剂：按实施例2方法所得五味子乙醇和甲醇提取物，分别溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基；柔红霉素。

仪器：培养瓶，培养板，FCM。

(2)实验方法：

FACS法分析细胞内DNR积聚：K562/adr、MCF7/adr、KBV200细胞培养于无药物的新鲜培养液中。实验分为2组，对照组和逆转组。对照组加入新鲜培养液，逆转组加入浓度分别为50μg/ml的五味子乙醇提取物，孵育1h后加入柔红霉素DNR，浓度分别为2μg/ml，37℃温育90分钟后用FCM分析药物在细胞内的积聚。

五味子甲醇提取物实验步骤如上。

(3)实验结果：

图5说明五味子乙醇提取物可增加柔红霉素在MDR细胞K562/Adr、MCF7/adr和KBV200细胞中的积聚。

图6说明五味子甲醇提取物可增加柔红霉素在MDR细胞K562/adr、MCF7/adr和KBV200细胞中的积聚。

结论：五味子乙醇或甲醇提取物可抑制P-糖蛋白的功能，恢复MDR肿瘤细胞内的药物积聚(图5，图6)。

实施例14：五味子乙醇或甲醇提取物抑制MRP1

(1)实验材料：

细胞株：HL60/adr多药耐药细胞株以MRP1蛋白高表达为主要耐药机制。

试剂：按实施例2方法所得五味子甲醇或乙醇提取物，分别溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基；柔红霉素。

仪器：培养瓶，培养板，FCM。

(2)实验方法：

FACS法分析细胞内柔红霉素积聚：HL60/adr细胞培养于无药物的新鲜培养液中。实验分为2组，对照组和逆转组。对照组加入新鲜培养液，逆转组加入浓度分别为50μg/ml的五味子乙醇提取物，孵育1h后加入柔红霉素DNR，浓度分别为2μg/ml，37℃温育90分钟后用FCM分析药物在细胞内的积聚。五味子甲醇提取物试验方法如上。

(3)实验结果：

图7说明五味子乙醇提取物可增加柔红霉素在MDR细胞HL60/adr细胞中的积聚。

(五味子乙醇提取物的相关图有吗？这只是一个提取物，为一浸膏。)结论：五味子乙醇或甲醇提取物可抑制MRP1的功能，恢复MDR肿瘤细胞内的药物积聚(图7)。

实施例15：五味子乙醇提取物对P-gp介导的肿瘤多药耐药性的量效关系细胞：K562/adr多药耐药细胞株以Pgp蛋白高表达为主要耐药机制。

试剂：实施例1所得五味子乙醇提取物，溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基；柔红霉素。

实验方法：

细胞接种到96孔细胞培养板，每孔8000个细胞，培养过夜后，加入不同浓度五味子乙醇提取物和不同浓度的抗癌药(紫杉醇、阿霉素或长春新碱等)，继续培养72小时后，做MTT实验。细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC₅₀)，每实验重复三次。五味子乙醇提取物对MDR细胞的抗药逆转倍数为IC50(加五味子乙醇提取物)除以IC50(不加五味子乙醇提取物)。

实验结果：

五味子乙醇提取物在浓度为12.5μg/ml至50μg/ml范围内，对多药耐药的逆转呈剂量依赖性，再增加五味子乙醇提取物浓度，对多药耐药的逆转效应不再增加，参见图8。

实施例16：五味子乙醇或甲醇提取物对P-gp介导的肿瘤多药耐药性的逆转

细胞：K562/adr、MCF7/adr、KBV200多药耐药细胞株以Pgp蛋白高表达为主要耐药机制。

试剂：按实施例1方法所得五味子乙醇提取物和甲醇提取物，分别溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基；柔红霉素。

仪器：培养瓶，培养板，FCM。

实验方法：

细胞接种到96孔细胞培养板，每孔8000个细胞，培养过夜后，加入五味子乙醇提取物和抗癌药(紫杉醇、阿霉素或长春新碱等)，继续培养72小时后，做MTT实验。细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC₅₀)，每实验重复三次。五味子乙醇提取物对MDR细胞的抗药逆转倍数为IC50(加五味子乙醇或甲醇提取物)除以IC50(不加五味子乙醇或甲醇提取物)。

实验结果：

五味子乙醇提取物可逆转多药耐药肿瘤细胞的抗药性。结果见表4、表5、表6、表7、表8。

表4：五味子乙醇提取物(50μg/ml)对K562/ADR耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子乙醇提取物  加五味子乙醇提取物  柔红霉素  1.61  0.15  10.7  紫杉醇  1.1  0.41  2.7  长春新碱  0.87  0.11  7.9

表5：五味子甲醇提取物(50μg/ml)对K562/ADR耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子甲醇提取物  加五味子甲醇提取物  柔红霉素  1.61  0.20  8.1  紫杉醇  1.1  0.35  3.1  长春新碱  0.87  0.14  5.0

表6：五味子乙醇提取物(50μg/ml)对KBV200的耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子乙醇提取物  加五味子乙醇提取物  柔红霉素  0.2  0.02  10  长春新碱  0.42  0.031  13.5

表7：五味子乙醇提取物(50μg/ml)对MCF7/adr耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆转  倍数  不加五味子乙醇提取物  加五味子乙醇提取物  柔红霉素  0.32  0.031  10.3  紫杉醇  0.73  0.25  2.9  长春新碱  0.49  0.21  2.3

表8：五味子甲醇提取物(50μg/ml)对MCF7/adr耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆转  倍数  不加五味子甲醇提取物  加五味子甲醇提取物  柔红霉素  0.32  0.027  11.9  紫杉醇  0.73  0.19  3.8  长春新碱  0.49  0.23  1.8

结论：五味子乙醇或甲醇提取物可抑制P-gp介导的肿瘤多药耐药性。

实施例17：五味子乙醇提取物或甲醇提取物逆转MRP1介导的肿瘤多药耐药性

细胞：HL60/adr多药耐药细胞株以MRP1蛋白高表达为主要耐药机制。

试剂：按实施例2方法所得五味子乙醇或甲醇提取物，分别溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基。

仪器：培养瓶，培养板，FCM。

实验方法：

细胞接种到96孔细胞培养板，每孔8000个细胞，培养过夜后，加入五味子乙醇提取物和抗癌药(紫杉醇、阿霉素或长春新碱等)，继续培养72小时后，做MTT实验。细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC₅₀)，每实验重复三次。五味子乙醇提取物对MDR细胞的抗药逆转倍数为IC50(加五味子乙醇或甲醇提取物)除以IC50(不加五味子乙醇或甲醇提取物)。

五味子甲醇提取物实验方法同上。

实验结果：

五味子乙醇提取物或甲醇提取物可逆转多药耐药肿瘤细胞HL60/adr的抗药性。结果见表9和表10。

表9.五味子乙醇提取物(50μg/ml)对HL60/adr的耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子乙醇提取物  加五味子乙醇提取物  柔红霉素  0.50  0.01  50  紫杉醇  0.001  0.0001  10  长春新碱  0.050  0.001  50

表10.五味子甲醇提取物(50μg/ml)对HL60/adr的耐药逆转

  药物  IC₅₀  抗药性逆  不加五味子甲醇提取物  加五味子甲醇提取物  转倍数  柔红霉素  0.50  0.013  38  紫杉醇  0.001  0.0001  10  长春新碱  0.050  0.0015  33

结论：五味子乙醇或甲醇提取物可抑制MRP1功能，逆转MRP1介导的肿瘤多药耐药性。

实施例18：五味子乙醇提取物逆转BCRP(MXR)介导的肿瘤多药耐药性

细胞：黑色素瘤细胞株8226/MX20多药耐药细胞株以BCRP蛋白高表达为主要耐药机制。该细胞株由Minderman等建立(Minderman H，Brooks TA，O’Loughlin KL，et al：Cancer Chemother Pharmacol，53：363-3692004)。

试剂：实施例2所得五味子乙醇提取物，溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基。

仪器：培养瓶，培养板，FCM。

实验方法：

细胞接种到96孔细胞培养板，每孔8000个细胞，培养过夜后，加入五味子乙醇提取物和抗癌药(米脱蒽醌、柔红霉素)，继续培养72小时后，做MTT实验。细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC₅₀)，每实验重复三次。五味子乙醇提取物对MDR细胞的抗药逆转倍数为IC50(加五味子乙醇提取物)除以IC50(不加五味子乙醇提取物)。

实验结果：五味子乙醇提取物可逆转多药耐药肿瘤细胞HL60/adr的抗药性。结果见表11。

表11：五味子乙醇提取物(50μg/ml)对8226/MX20的耐药逆转

  药物                     IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子乙醇提取物  加五味子乙醇提取物  柔红霉素  0.42  0.041  10  米脱蒽醌  0.23  0.035  6.7

结论：五味子乙醇提取物(50μg/ml)可逆转BCRP(MXR)介导的多药耐药性。

实施例13至18说明五味子的提取物可有效抑制P-gp，MRP1和BCRP，这三个‘药泵’可使肿瘤细胞产生对多种抗癌药的抗性(详见Gottesman MM etal：Nature Medicine，2：48-58，2001；Krishna R etal：European Journal ofPharmaceutical Science 11：265-283，2000)。在MDR逆转药物的研究中，公认只要确定MDR逆转药物作用的靶点，并能逆转MDR细胞对典型抗癌药的抗药性，就可认为该药物可逆转MDR肿瘤对其他药物的抗药性(Teodori Eetal：Il Parmaco 57：385-415，2002；Seelig A et al：European Journal ofPharmaceutical Sceinces 12：31-40，2000；United States Patent Serial No003215；United States Patent Serial No 714506；United States Patent Serial No354443)。在实施例中我们证实了五味子提取物的作用靶点(P-gp，MRP1和BCRP)，并明确五味子提取物可有效逆转MDR肿瘤细胞对的典型药物的抗药性逆转，因此推论五味子提取物也可逆转MDR肿瘤对其他抗肿瘤药物的抗药性。

综上所述：五味子提取物可高效杀死多种肿瘤细胞，因此可制成抗肿瘤药物；五味子提取物还可有效逆转由P-gp、MRP1、BCRP等介导的肿瘤多药耐药性，因此，五味子提取物可制成逆转肿瘤多药耐药性的药物，并且具有明确的靶点。

实施例19：五味子超临界提取物逆转BCRP(MXR)介导的肿瘤多药耐药性

细胞：K562/adr，MCF7/adr，HL60/adr，8226/MX20

试剂：实施例3所得五味子超临界提取物，溶于DMSO，配成100mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基。

仪器：培养瓶，培养板，FCM。

实验方法：

细胞接种到96孔细胞培养板，每孔8000个细胞，培养过夜后，加入五味子超临界提取物和抗癌药，继续培养72小时后，做MTT实验。细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC₅₀)，每实验重复三次。五味子超临界提取物对MDR细胞的抗药逆转倍数为IC50(五味子超临界提取物)除以IC50(五味子超临界提取物)。

实验结果：五味子超临界提取物可逆转由Pgp、MRP1、和MXR介导的肿瘤多药耐药性。

表12：五味子超临界提取物(50μg/ml)对K562/ADR耐药逆转

  药物                       IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子超临界提取物  加五味子超临界提取物  柔红霉素  1.61  0.11  14.6  紫杉醇  1.1  0.32  3.4  长春新碱  0.87  0.15  5.8

结论：五味子超临界提取物可逆转由Pgp介导的肿瘤多药耐药性

表13：五味子超临界提取物(50μg/ml)对MCF7/ADR耐药逆转

  药物                       IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子超临界提取物  加五味子超临界提取物  柔红霉素  0.32  0.021  15.2  紫杉醇  0.73  0.13  5.6  长春新碱  0.49  0.15  3.3

结论：五味子超临界提取物可抑制P-gp介导的肿瘤多药耐药性。

表14.五味子超临界提取物(50μg/ml)对HL60/adr的耐药逆转

  药物                       IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子超临界提取物  加五味子超临界提取物  柔红霉素  0.50  0.021  24  紫杉醇  0.001  ＜0.0001  ＞10  长春新碱  0.050  0.0022  23

结论：五味子超临界提取物提取物可抑制MRP1功能，逆转MRP1介导的肿瘤多药耐药性。

表15：五味子超临界提取物(50μg/ml)对8226/MX20的耐药逆转

  药物                       IC₅₀  抗药性逆  转倍数  不加五味子超临界提取物  加五味子超临界提取物  柔红霉素  0.42  0.032  13.1  米脱蒽醌  0.23  0.042  5.5

结论：五味子超临界提取物可逆转BCRP(MXR)介导的多药耐药性。

综上所述，五味子提取物可有效逆转肿瘤的多药耐药性，其安全性好，因此具有较大的临床应用前景。