抗单纯疱疹病毒－2感染的多表位DNA疫苗及其制备方法

摘要

本发明属医药和基因工程技术领域，具体为一种抗单纯疱疹病毒－2的多表位DNA疫苗及其制备方法。本发明的DNA疫苗是将HSV－2的gB、gC、gD和即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域加间隔序列串连到真核表达载体pcDNA3.1，获得HV－pcDNA3.1。该DNA疫苗可以用于预防和治疗HSV－2感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。该疫苗的特点是特异性高、保护性好，制备方法简单。

说明书

技术领域

本发明属医药和基因工程技术领域，具体涉及一种新的抗HSV-2多表位DNA疫苗及应用

背景技术

单纯疱疹病毒(HSV)感染是人类比较常见的感染性疾病.。HSV-1主要引起唇疱疹、龈口炎、脑炎、角膜结膜炎等非生殖器感染，而HSV-2引起生殖器感染。大多数生殖器疱疹由HSV-2引起，可呈慢性复发过程，目前尚未有根治的良药。该病在全球的流行情况十分明显，已占性病的10％左右，由HSV-2感染造成的公共卫生问题促使人们研制可预防和控制感染的疫苗。有研究表明，DNA疫苗与常规的灭活苗、减毒苗、亚单位疫苗相比，DNA疫苗不仅可诱导产生特异性免疫球蛋白，且可同时激发机体的细胞免疫反应(尤其是CTL免疫)，对病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病预防更为有效。DNA疫苗另一个突出优点是免疫原的单一性。只有编码所需抗原的基因被导入细胞得到表达，载体本身没有免疫原性。而重组活载体疫苗除目的基因的表达外，其本身还具有庞大而复杂的免疫原蛋白。DNA疫苗不仅可用于预防，而且可用于治疗。

本发明从HSV入侵和繁殖的机理及整个生命周期过程角度出发，将HSV-2糖蛋白D、B、C基因(gD免疫原性较强、gB和gC与相应的受体结合能稳定病毒在细胞表面的吸附)和即刻早期蛋白ICP27基因(该基因能启动病毒DNA进入细胞后转录和表达)作为靶基因串连起来插入到pCDNA3.1，首次构建了HSV-2新型多表位DNA疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗及其制备方法。

本发明的技术路线为，首先培养扩增HSV-2病毒，并抽提其基因组DNA，同时用生物信息学方法根据糖蛋白的免疫原性分析，选取所需的抗原表位，设计相应引物，然后用PCR方法分段扩增所需的目的基因，最后把六段基因连接起来先克隆到pGEM-T载体上，再酶切装入pcDNA3.1，得到抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗(HV-pcDNA3.1质粒)。

本发明提出的有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗，其组成如下：将HSV-2病毒胞膜糖蛋白的强免疫原gD、gB、gC和参与病毒复制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域，以主要保护性抗原gD为中心，选定6段抗原基因加间隔序列AAY串连到真核表达载体pcDNA3.1，得到HV-pcDNA3.1质粒；其中6段抗原基因为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽。

本发明提出的抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制备方法，具体步骤如下：

1.设计引物：根据靶抗原免疫原性分析，以人HSV-2全病毒基因组DNA为(SEQ ID NO.7)模板，设计6对引物(含酶切位点)，分别用于扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段，引物序列见表1所列：

                  表1.DNA疫苗引物序列表

  表位名                       引物序列  ICP27  ICP27-F：5’CAGGAATTCGAAATGGACCCTATCATCGGAACG 3’(EcoRI)  ICP27-R：5’CTACTCTTCAGGCAGCCGTCTCGCCGGCCCCAAC 3’(EarI)  gD2  PgD2-F：5’CAGCTCTTCTGCCTACAGCGAGGATAACCTGGGATT 3’(EarI)  PgD2-R：5’GTCCTCTTCGCGTTGTGTGATCTCCGTCCAGTC 3’(EarI)  gD3  PgD3-F：5’CCACTCTTCAACGCTTTATCCCCGAAAACCA 3’(EarI)  PgD3-R：5’CTACTCTTCTGGCAGCGTGCGGCGCGACGTCCT 3’(EarI)  gB4  PgB4-F：5’TACCTCTTCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTC 3’(EarI)  PgB4-R：5’CTACTCTTCTAAGCGGCCTGGTCTTCGTACCGAAAG 3’  (EarI)  gC5  PgC5-F：5’TAGCTCTTCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGG 3’(EarI)  PgC5-R：5’GCACTCTTCTGGCAGCGTGTATCTGGGCCGGATCG 3’(EarI)  gD6  PgD6-F：5’CCACTCTTCAGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAG 3’(EarI)  PgD6-R：5’CGAGGTACCAATCATCACTCCGATGGGGCATGTAGGA 3’  (KpnI)

2.抗原靶基因的分段克隆回收：取HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。这6段抗原基因分别为：ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽(SEQ ID NO.1)，gD上第1～77(SEQ ID NO.2)、第146～179(SEQ IDNO.3)、第223～306(SEQ ID NO.4)氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606(SEQ ID NO.5)氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282(SEQ ID NO.6)氨基酸的一段抗原肽；

取PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带，把得到的目的基因片段割胶回收、定量；

3.将六段PCR产物的酶切和连接：将纯化得到的各段HSV抗原片段分别用EarI酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它们按照下述顺序连接(见图1所示)：

ICP27上的377～459，gD上的146～179，gD上的223～306，gB上的529～606，gC上的247～282；gD上的1～77，得到完整的抗原表位，用于连接的间隔序列为AAY；

4.将串联后的目的基因构建质粒：将上述得到的完整抗原表位和真核表达载体pcDNA3.1同时双酶切，然后连接起来，构成所需的DNA疫苗：HV-pcDNA3.1。

由本发明制备获得的DNA疫苗，经过对小鼠免疫试验，结果表明该疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。然后进行免疫小鼠毒性攻击试验：测定其戚率指标，表明该疫苗免疫的有效性，而且具有特异性高、杀伤力强的优点。

附图说明

图1为多表位DNA复合疫苗抗原示意图。

图2为克隆抗原片断的路线图示。

具体实施方式

下面进一步描述本发明的实施方式。

1.引物设计：参照【图1】设计6对引物，以人HSV-2全病毒基因组DNA为模板，设计引物(含酶切位点)分别扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段。引物序列参见【表1】：

2.抗原靶基因的分段克隆回收：取2ul HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。条件如下：

50μl PCR扩增反应体系：ddH₂O            9.5μl

                       10×Buffer         5.0μl

                       4×dNTP(10mM)      1.0μl

                       Primer F(10μM)    1.0μl

                       Primer R(10μM)    1.0μl

                       Template           2.0μl 

                       Taqplus(5U/μl)    0.5μl

PCR扩增反应条件：

取2μl PCR扩增产物，2.0％琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带。把得到的目的基因片段割胶回收、定量。

3.六段PCR产物的酶切和连接：纯化得到的各段HSV抗原片段分别用Ear I酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它们按照顺序先后联接。参照【图1】

Ear I酶切条件：

   2ul Buffer；

   1ul EarI；

   10ul纯化的PCR片段；

   7.5ul ddH₂O；

   反应Mix于37℃保温3h。

T4 ligase顺序连接各段酶切产物，4℃连接过夜，连接分别如下：

(1)2ul 10×T4 ligase buffer

   1ul T4 ligase

   8.5ul ICP1+8.5ul D2

(2)2ul 10×T4 ligase buffer

   1ul T4 ligase

   8.5ul D3+8.5ul B4

(3)2ul 10×T4 ligase buffer

   1ul T4 ligase

   8.5ul C5+8.5ul D6

把3段联接产物用1.5％琼脂糖电泳观察结果。切下3段连接片段，(1)号联接产物中目的条带为377bp(A)，(2)号联接产物中目的条带为503bp(B)，(3)号联接产物中目的条带为376bp(II)。回收这些目的片段。

用T4 ligase联接回收的A和B片段，4℃连接过夜，Mix如下：

2ul 10×T4 ligase buffer

1ul T4 ligase

8.5ul A+8.5ul B

把A和B的连接产物用1.5％琼脂糖电泳观察结果。切下600～1000bp条带对应的位置，回收DNA，进行用PCR扩增。

50μl PCR扩增反应体系：ddH₂O                  39.5μl

                       10×Buffer               5.0μl

                       4×dNTP(10mM)            1.0μl

                       Primer ICP-F(10μM)      1.0μl

                       Primer B4-R(10μM)       1.0μl

                       Template                 2.0μl

                Taqplus(5U/μl)            0.5μl

PCR扩增反应条件：

取100μl PCR扩增产物，2.0％琼脂糖凝胶电泳切下880bp条带(I)，回收目的片段，再用EarI酶切片段I，条件同前。

T4 ligase连接片段I酶切产物和回收的片段II，4℃连接过夜，Mix如下：

2ul 10×T4 ligase buffer

1ul T4 ligase

8.5ul I+8.5ul II

连接产物用1.4％琼脂糖电泳，切下1100～1300bp条带(HV)，回收目的片段。PCR检验回收的HV片段是否有6段基因的连接产物：

50μl PCR扩增反应体系：ddH₂O                    39.5μl

                       10×Buffer                 5.0μl

                       4×dNTP(10mM)              1.0μl

                       Primer ICP-F(10μM)        1.0μl

                       Primer D6-R(10μM)         1.0μl

                       Template                   1.0μl

                       Taqplus(5U/μl)            0.5μl

PCR扩增反应条件：

共有6段抗原肽表位，分别为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～284氨基酸的一段抗原肽。其中不同类型糖蛋白之间用间隔序列(AAY)连接起来，以提高免疫活性并防止N端被破坏，起保护作用。

4.HV连接片段的克隆测序：将上述回收的HV片段连接到pGEM-T载体中，16℃连接过夜：

1ul Progema T4 ligase

1ul pGEMT-vector

5ul 2×Progema T4 ligase Buffer

3ul HV纯化液

HV-pGEMT-vector连接产物，转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子鉴定。分别对阳性转化子和pcDNA3.1空载体用EcoRI和KpnI双酶切，EcoRI单切质粒，37℃保温3h：

3.0ul Buffer H

2.0ul EcoRI

20.0ul质粒

5.0ul ddH₂O

纯化得到的EcoRI酶切质粒再用KpnI酶切37℃，3h：

3.0ul Buffer 1

0.3ul 100×BSA

2.0ul KpnI

24.7ul质粒

对于HV-pGEMT-vector双酶切产物切胶1200bp条带；pcDNA3.1空质粒双酶切产物则切胶约5.4kb的条带，分别对其回收定量。HV片段联入pcDNA3.1载体，16℃过夜：

1ul 10×T4 ligase buffer

1ul T4 ligase

1ul双切pcDNA3.1回收片段

3ul HV双切回收片段

HV，pcDNA3.1连接产物转化入DH5α感受态细胞，挑选阳性重组子，得HV-pcDNA3.1，并测序验证。

5.免疫小鼠：C57/BL6雌性6周龄小鼠10只，随机分为2组(空载体pcDNA3.1阴性组和HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1实验组)，每组5只。方法是初次免疫为10ug质粒和1ug脂质体融合转染C57/BL6小鼠单个核细胞于皮下注射；14天后二次免疫为100ug质粒和10ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中；再过14天后加强免疫一次50ug质粒和5ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中。再过14天后检测。

6.通过以下方法进行HSV-2多表位DNA疫苗的免疫原性鉴定：

(1)特异性IgG抗体ELISA结果  血清稀释400倍时的OD值阴性组为0.113±0.035；实验组为0.288±0.091，效价约为500。

(2)杀伤性T细胞毒分析结果  用LDH法测定CTL杀伤率(％)，当效靶比为50∶1时，阴性组为8.301±2.906；实验组为47.913±15.086。

(3)细胞因子检测结果  ELISA测得血清中mIL2和mIFN-γ的含量(ng/L)，阴性组mIL2为685.21±104.20，mIFN-γ为547.71±189.33；实验组mIL2为1421.16±220.98，mIFN-γ为1956.19±219.60。

(4)T细胞抗原特异性增殖反应测定结果  MTT法测得的小鼠脾T淋巴细胞刺激指数(SI)，阴性组为0.709±0.035；实验组为2.751±0.259。

结论：HSV-2多表位DNA疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

7.具体应用：

根据一系列小鼠免疫指标的测定结果，表明该DNA疫苗构建设计是成功的。然后直接进行HSV-2多表位DNA疫苗免疫小鼠病毒攻击实验，通过测定存活率指标，观察小鼠预防HSV感染的动物试验效果，进一步反应了该疫苗的有效性。

临床应用：小鼠攻毒实验成功后，经临床I、II、III期实验，可作为抗HSV-2病毒的新型DNA疫苗，用于预防和治疗感染HSV-2的疾病，如生殖器疱疹、宫颈癌、新生儿疱疹等疾病。

                              序列表

SEQ ID NO.1：

DPIIGTAAAVLENLATRLRPFLQCYLKARGLCGLDDLCSRRRLSDIKDIASFVLVILARLANRVERGVSE

IDYTTVGVGAGET

SEQ ID NO.2：

AKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRS

VLLHAPSE

SEQ ID NO.3：

SEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQ

SEQ ID NO.4：

RFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPP

NWHIPSIQDVAPH

SEQ ID NO.5：

QNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAPDNVIVQNSMRVSSRPGTCYS

RPLVSFRYEDQ

SEQ ID NO.6：

EGQPFKATCTAATYYPGNRAEFVWFEDGRRVFDPAQ

SEQ ID NO.7

ATGGACCCTATCATCGGAACGGCGGCCGCCGTGCTGGAAAACCTCGCCACGCGCCTGCGCCCCTT

TCTGCAGTGCTACCTGAAGGCCCGAGGCCTGTGCGGGCTGGACGACCTGTGCTCGCGGCGACGCC

TGTCGGACATTAAGGATATTGCCTCCTTTGTGTTGGTCATCCTGGCCCGCCTCGCCAACCGCGTCGA

GCGCGGCGTGTCGGAGATCGACTACACGACCGTGGGGGTTGGGGCCGGCGAGACGGCCGCTTAC

AGCGAGGATAACCTGGGATTCCTGATGCACGCCCCCGCCTTCGAGACCGCGGGTACGTACCTGCG

GCTAGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATCACACAACGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACCG

TCGCCCTATACAGCTTAAA AATCGCCGGGTGGCACGGCCCCAAGCCCCCGTACACCAGCACCCTG

CTGCCGCCGGAGCTGTCCGACACCACCAACGCCACGCAACCCGAACTCGTTCCGGAAGACCCCG

AGGACTCGGCCCTCTTAGAGGATCCCGCCGGGACGGTGTCTTCGCAGATCCCCCCAAACTGGCAC

ATCCCGTCGATCCAGGACGTCGCGCCGCACGCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTCTCTGGAA

CGAGGCCCGCAAGCTCAACCCCAACGCCATCGCCTCCGCCACCGTCGGCCGGCGGGTGAGCGCG

CGCATGCTCGGAGACGTCATGGCCGTCTCCACGTGCGTGCCCGTCGCCCCGGACAACGTGATCGT

GCAGAACTCGATGCGCGTCAGCTCGCGGCCGGGGACGTGCTACAGCCGCCCCCTGGTCAGCTTTC

GGTACGAAGACCAGGCCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGGCGACGTGCACGGCCGCCACCTAC

TACCCGGGCAACCGCGCGGAGTTCGTCTGGTTCGAGGACGGTCGCCGGGTATTCGATCCGGCCCA

GGCTGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAGACCCCTCGCTTAAGATGGCCGATCCCAATCGATTTCG

CGGGAAGAACCTTCCGGTTTTGGACCAGCTGACCGACCCCCCCGGGGTGAAGCGTGTTTACCACA

TTCAGCCGAGCCTGGAGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCATCCCGATCACTGTGTACTACGCAGTGC

TGGAACGTGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTACATGCCCCATCGGAGTGATGA