晶状的非溶剂化1－(4－(2－哌啶基乙氧基)苯氧基)－2－(4－甲磺酰基苯基)－6－羟基萘盐酸化物

摘要

本发明涉及晶状的非溶剂化1－(4－(2－哌啶基乙氧基)苯氧基)－2－(4－甲磺酰基苯基)－6－羟基萘盐酸化物，用作选择性雌激素受体调节剂。

说明书

本申请要求于2003年2月25日提交的美国临时专利申请No.60/450,233和于2003年7月16日提交的国际(WO)专利申请PCT/IB03/03349的优先权。

发明背景

子宫平滑肌瘤/肌瘤(leiomyomata)(子宫纤维瘤疾病)是具有多个名称的临床问题，包括子宫纤维化、子宫肥大、子宫肌瘤、子宫肌层肥大、子宫纤维变性和纤维变性子宫炎。实质上，子宫纤维化是纤维样组织在子宫壁上不恰当沉积的病症。这种病症是引起妇女痛经和不孕的原因。

子宫内膜异位是伴随有严重疼痛、出血进入子宫内膜团块或腹膜腔的重度痛经疾病，通常导致不孕。所述症状的原因可能是异位的子宫内膜生长，它不恰当地响应正常激素控制并定位于不恰当的组织中。由于子宫内生长的不适当的定位，组织表现出局部炎症样响应，引起巨噬细胞浸润和导致引起疼痛响应的事件的级联。有证据显示：子宫纤维化和子宫内膜异位的原因是纤维样组织和/或子宫内膜组织对雌激素的不恰当的响应。

近十年已经出现了大量公开选择性雌激素受体调节剂(SERM)的出版物，例如美国专利US 5,484,795、5,484,798、5,510,358、5,998,401和WO96/09040。一般而言，已经发现大多数这些SERM在骨和心血管系统中具有有益的雌激素激动剂活性，并伴有在乳房中的有益的雌激素拮抗剂活性。还已经发现这些化合物中特别有用的一小类在子宫内具有雌激素拮抗剂作用。具有该SERM特性的化合物在治疗子宫纤维瘤疾病和/或子宫内膜异位中具有特别的前景。

然而，由于这些SERM化合物具有明显的卵巢刺激作用的倾向，它们在治疗尤其是绝经前妇女的子宫纤维瘤疾病和/或子宫内膜异位的临床应用已受到阻碍。因而，当前非常需要有新的在子宫内作为雌激素拮抗剂起作用且不明显刺激卵巢的SERM化合物。

发明简述

本发明涉及晶状的非溶剂化1-(4-(2-哌啶基乙氧基)苯氧基)-2-(4-甲磺酰基苯基)-6-羟基萘盐酸化物，即下式化合物：

下文称为F-III；当由铜放射源(CuKα，λ＝1.54056_)获得X射线衍射图谱时，具有下述峰：2θ为15.2±0.1，17.6±0.1，18.6±0.1和24.1±0.1°。

本发明还涉及含有F-III和药用载体的药物制剂。在另一实施方案中，本发明的药物制剂可适用于治疗子宫内膜异位和/或子宫平滑肌瘤。

本发明还涉及治疗子宫内膜异位和/或子宫平滑肌瘤的方法，该方法包括对需要其的患者施用有效量的F-III。

另外，本发明涉及F-III在治疗子宫内膜异位和/或子宫平滑肌瘤中的用途。本发明还涉及F-III在制备用于治疗子宫内膜异位和/或子宫平滑肌瘤的药物中的用途。

附图简述

图1为F-III的特征XRD图谱。

发明详述

由于F-III是非溶剂化晶形，应当理解F-III是1-(4-(2-哌啶基乙氧基)苯氧基)-2-(4-甲磺酰基苯基)-6-羟基萘盐酸化物的无水形式。

X-射线粉末衍射(XRD)被用于表征F-III。XRD是检测结晶物质中长程序的技术。X-射线粉末衍射(XRD)图谱在SIiemens D5000X-射线粉末衍射计上获得，该衍射计装配有CuKα源(λ＝1.54056_)和Kevex固态Si(Li)检测计，最小在50kv和40mA下操作。样品在2θ为4至35°扫描，2θ步长为0.02°，最大扫描速率为每步3.0秒，发散和接收狭缝为1mm，检测器狭缝为0.1mm。将合成的氟金云母(NIST675)用作内标来校准任何样品位移误差。

F-III的XRD图谱在本文中公开了特征尖峰和平坦基线，表明为高结晶性物质。在表1中给出了F-III的所有强度等于或大于最大峰的10％的峰在2θ上的角峰(angular peak)位和相应的I/I₀数据。表1中的所有数据以精确度2θ为±0.1°表示。

              表1

             F-III

  角度2θ  I/I₀(％)  角度2θ  I/I₀(％)  4.6  13.2  22.0  14.4  13.8  30.1  22.2  25.3  15.2  53.2  22.7  13.0  16.9  37.9  23.8  33.4  17.6  54.5  24.1  89.5  17.9  27.8  24.8  20.8  18.3  25.9  26.0  11.1  18.6  100.0  26.3  13.7  19.2  46.8  26.9  10.9  19.5  23.4  27.4  21.0  19.7  27.0  27.9  13.2  20.7  28.3  29.0  12.9  21.3  41.9  29.3  20.3  21.6  40.8

在结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的晶形，由于因各种因素如晶体形态学和晶癖而导致的晶体取向，衍射峰的相对强度可以有所改变。当存在优选取向的作用时，峰强度改变，但是多晶型物的特征峰位未改变。参见例如美国药典#23，美国处方集#18(第1843-1844页，1995年)。而且，在结晶学领域同样众所周知的是，对于任何给定的晶形，尖峰位可略微改变。例如，峰位可由于样品分析温度的变化、样品位移或者存在或不存在有内标而偏移。在本申请的情形中，峰位在2θ上±0.1°的变异将考虑这些潜在的变异而不妨碍本发明的结晶盐被准确地鉴别出。

¹³C交叉极化/幻角自旋(CP/MAS)NMR(固态NMR或SSNMR)也用于表征F-III。所述图谱采用Varian Unity Inova 400MHz核磁共振频谱仪在100.573MHz的碳频数(carbon frequency)下进行而获得。采集的参数如下：90°质子r.f.，脉冲宽度4.0μs，接触时间2.5ms，脉冲重复时间15s，MAS频数10kHz，谱宽50kHz，，取数时间50ms。化学位移参考通过样品置换的六甲基苯的甲基(δ＝17.3ppm)。式III的化学位移数据如下：20.7，23.8，25.3，38.4，51.2，52.4，56.8，59.8，110.8，113.3，114.6，118.0，118.3，122.3，122.9，125.4，127.2，130.0，132.0，137.9，142.2，143.1，147.3，151.3，153.8和158.0ppm。

                             制备例1

1-(2-{4-[2-(4-甲磺酰基-苯基)-6-甲氧基-萘-1-基氧基]-苯氧基}-乙基)-哌啶盐

                             酸化物

向装有回流冷凝器和氮净化通气口的3-颈烧瓶中加入6-甲氧基四氢萘酮(1.0当量)、4-溴苯基-甲基-砜(1.02～1.05当量)、乙酸钯Pd(OAc)₂(0.025当量)、[(氧基-二-2，1-亚苯基)二(二苯膦)](DPEphos配体，0.026当量)和甲苯(10～12体积)。一次加入叔丁醇钠(2.5当量)并使混合物放热至-40℃。加热至75℃至80℃。在反应完全后(如HPLC分析判断)，冷却至室温。缓慢加入12体积水，保持温度＜40℃。搅拌2至3小时。经聚丙烯垫过滤，并用水洗涤(3×2体积)。将滤饼于50℃干燥过夜，获得2-(4-甲磺酰基苯基)-6-甲氧基四氢萘酮。

混合2-(4-甲磺酰基苯基)-6-甲氧基四氢萘酮(1.0当量)、hyflo(20％/重量)和甲苯(7.5体积)，一次加入PBr₃(1.5～1.75当量)，同时于室温搅拌。加热组分至回流(～110℃)过夜。在反应完全后(根据HPLC分析判断，通常为15小时)，冷却溶液至45℃或90℃，并缓慢加入20体积四氢呋喃(THF)。在45℃或90℃搅拌30分钟，经hyflo垫趁热过滤。用2×2体积45℃或90℃的THF洗涤垫。浓缩滤液至约7体积。向剩余混合物中加入7.5体积的水，保持温度低于40℃(注意：最初加入水后放出大量热，并产生大量HBr)。冷却浆液至室温，并搅拌2至3小时。通过聚丙烯垫过滤，并用2×2体积的水洗涤。于60℃真空干燥滤饼，获得1-溴-2-(4-甲磺酰基苯基)-3，4-二氢-6-甲氧基萘。

将1-溴-2-(4-甲磺酰基苯基)-3，4-二氢-6-甲氧基萘和2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，1.8当量)在10体积乙腈和5体积THF中混合。在氮气氛围下，加热反应内容物至73-75℃。通过GC分析监测反应进程直至反应完全。可能需要额外的DDQ(0.2-0.3当量)以使反应完全。冷却组分至环境温度，并加入10体积1N氢氧化钠。搅拌约1小时并过滤。滤饼用2体积水、3×5体积的50％乙腈/水、最后用3体积甲醇冲洗。于65℃真空干燥滤饼，获得1-溴-2-(4-甲磺酰基苯基)-6-甲氧基萘。

将1-溴-2-(4-甲磺酰基苯基)-6-甲氧基萘、4-(2-哌啶基乙氧基)苯酚(2.0当量)、碳酸铯(2.0-2.1当量)和氯化铜(0.15当量)加入12体积的二甘醇二甲醚中。烧瓶排气～2分钟，然后用氮气净化。排气/氮气净化重复3次。加热组分至130℃，直至根据HPLC分析判断反应完全。反应完全后，冷却组分至接近环境温度，加入12体积氢氧化铵并搅拌约30分钟。过滤除去固体，并将固体用9体积30％MeOH/NH₄OH洗涤，在滤器支撑物上制成浆液。固体用2×9体积30％NH₄OH/MeOH洗涤，在滤器支撑物上制成浆液。用4体积甲醇洗涤。于60℃真空干燥滤饼，获得标题化合物的游离碱。将游离碱在9体积甲苯中制成浆液，并加热浆液至70-75℃。将1.1当量的氯化氢气体溶解在2体积乙醇中。将乙醇化HCl溶液加入热的甲苯浆液中。冷却溶液至环境温度并搅拌1-2小时。过滤并用少量甲苯洗涤。于65℃真空干燥滤饼，获得标题化合物。

                     实施例1

                      F-III

将1-(2-{4-[2-(4-甲磺酰基-苯基)-6-甲氧基-萘-1-基氧基]-苯氧基}-乙基)-哌啶盐酸化物与5体积1，2-二氯乙烷(DCE)混合，并冷却混合物至＜10℃。在液面下加入5当量的三氯化硼。于室温搅拌至反应完全(根据HPLC分析来判断)。将反应内容物淬灭至5.6体积3A-乙醇(用约5％甲醇变性的乙醇)中，保持内容物＜50℃。冷却至环境温度并搅拌1-3小时。过滤固体并用3A-乙醇洗涤滤饼。于65℃真空干燥滤饼。将所分离的产物溶于9.8体积3A-乙醇和1.5体积去离子水(约为该混合物的回流温度)中。使溶液回流约30分钟，然后使混合物冷却至环境温度。一旦降至环境温度，使所得浆液于室温搅拌1-2小时，然后过滤并用3A-乙醇洗涤滤饼。将滤饼溶解在回流的19体积乙腈和1.4体积去离子水中。共沸蒸馏除去水，直至除去12.1体积馏出物。使所得浆液冷却至环境温度，过滤并用乙腈洗涤滤饼，获得标题化合物。

制剂(药物组合物)

本发明的化合物优选在施用于接受患者之前配制成剂量单位形式，即配制成单独的递送载体，例如片剂或胶囊。术语“患者”包括女性和非人类雌性动物，例如成对动物(狗、猫、马等)。治疗的优选患者为女性。

本发明的药物组合物通过已知方法采用众所周知和易于获得的成分来制备。在制备本发明的制剂中，活性成分(F-III)通常与载体混合，或者用载体稀释，或者包埋在载体中，其可以是胶囊、小药囊、纸剂或其它容器的形式。当载体作为稀释剂时，它可以是作为活性成分的载体、赋性剂或介质起作用的固体，半固体或液体材料。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉末、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液或无菌包装粉末。

适宜载体、赋性剂和稀释剂的某些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂还可另外包括润滑剂、润湿剂如聚山梨酯80或月桂硫酸盐、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。可配制本发明的组合物以在施用于接受患者后提供速释、缓释或延迟释放的活性成分。

                 制剂实施例

               10mg胶囊或片剂

将约156mg填充剂(乳糖、山梨醇或右旋糖)、约20mg崩解剂(微晶纤维素或淀粉)、约4mg超崩解剂(super disintegrant)(交联聚维酮或淀粉羟乙酸钠)、约4mg粘合剂(羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素)和约10mgF-III加入制粒机中，混合以使粉末均匀分布。以均一速率将由聚维酮、羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素(足以传送约2-4％重量的干燥粉末)和润湿剂如聚山梨酯80或月桂硫酸钠(足以传送0.5和3％重量)组成的制粒水溶液喷雾至粉末上，同时混合。将形成颗粒的材料经滤网湿过筛，以分离大的团块。通过流化床加工或在对流烘箱中干燥所过滤的形成颗粒的粉末。通过共研磨机或其它适宜的装置使干燥的形成颗粒的粉末减小至均一粒径，然后将材料转移至搅拌器中。将形成颗粒的粉末与润滑剂(硬脂酸镁或硬脂酰富马酸钠，占制剂总重量的约1％)和另外的崩解剂(占外部粉末的约2-4％重量)均匀混合。将已制好的粉末填充入硬明胶胶囊中，或者将所述粉末压片(接着如下所述将片剂包薄膜衣)。按这种方法制备的胶囊或片剂的总重量为约200mg。

                    45mg胶囊或片剂

将约162mg填充剂(乳糖、山梨醇或淀粉)、约10mg崩解剂(交联聚维酮或淀粉羟乙酸钠)和约45mg F-III加入制粒机中，混合以使粉末均匀分布。以均一速率将由聚维酮(约35％重量)和聚山梨酯80(约10％重量)组成的制粒水溶液喷雾至粉末上，同时混合。将形成颗粒的材料经滤网湿过筛，以分离大的团块。通过流化床加工或在对流烘箱中干燥所过滤的形成颗粒的粉末。将干燥的形成颗粒的粉末通过共研磨机或其它适宜的装置，然后将材料转移至搅拌器中。将形成颗粒的粉末与润滑剂(硬脂酸镁；占制剂总重量的约1％)和另外的崩解剂(占外部粉末的约2％重量)均匀混合。将已制好的粉末填充入硬明胶胶囊中，或者将所述粉末压片(接着如下所述将片剂包薄膜衣)。按这种方法制备的胶囊或片剂的总重量为约230mg。

或者，为了制备片剂，将填充剂、崩解剂和F-III加入搅拌器中，并混合成均匀分布的粉末。一旦粉末均匀分布，加入润滑剂并再次混合。将混合的材料转移至压片机中制备片剂，所述片剂随后用适宜的成膜剂包衣。

生物学试验

Ishikawa细胞增殖试验：该试验测定在激动剂模型和拮抗剂模型两者中的细胞增殖(使用碱性磷酸酶读数器)，其中在激动剂模型中仅存在有本发明的化合物，在拮抗剂模型中测定本发明的化合物阻断生长的雌二醇刺激的能力。

在补充有10％胎牛血清(FBS)(V/V)(Gibco BRL)的MEM(含有Earle′s盐和L-谷氨酰胺的极限必需培养基，Gibco BRL，盖瑟斯堡，MD)中维持Ishikawa人子宫内膜肿瘤细胞。在试验前一天，将生长培养基转换成试验培养基：DMEM/F-12(3∶1)(Dulbecco′s改良的Eagle培养基：营养混合物F-12，3∶1混合物，不含酚红，Gibco BRL)，补充有5％葡聚糖包裹活性炭剥离胎牛血清(DCC-FBS)(Hyclone，Logen，UT)、L-谷氨酰胺(2mM)、MEM丙酮酸钠(1mM)、HEPES(N-[2-羟基乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸]2mM)，均来自于Gibco BRL。在孵育过夜后，Ishikawa细胞用不含Ca⁺²和Mg⁺²(Gibco BRL)的Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(1X)(D-PBS)冲洗，通过用0.25％不含酚红的胰蛋白酶/EDTA(Gibco BRL)孵育3分钟使之受胰蛋白酶消化。将细胞重新悬浮在试验培养基中并调节至250,000个细胞/mL。将在100μl培养基中的约25,000个细胞加入平底96孔微量培养板上(Costar 3596)，于37℃在5％CO₂润湿培养器中孵育24小时。第二天，制备化合物在试验培养基中的系列稀释液(在试验中6倍于终浓度)。试验在双重模型——激动剂模型和拮抗剂模型中进行。

对于激动剂模型，板接受25μl/孔的试验培养基，然后接受25μl/孔的稀释的本发明的化合物(在6倍于终浓度处)。对于拮抗剂模型，板接受25μl/孔的6nM E₂(β-雌二醇，Sigma，St.Louis，MO)，然后接受25μl/孔的稀释的本发明的化合物(在6倍于终浓度处)。于37℃在5％CO₂润湿培养器中另外孵育48小时后，从孔中吸取出培养基，并向各微量培养物中加入100μl新鲜试验培养基。制备化合物的序列稀释液，并加入上述细胞中。于37℃在5％CO₂润湿培养器中另外孵育72小时后，除去培养基淬灭试验，在Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(1X)(D-PBS)(Gibco BRL)中冲洗板两次。将该板干燥5分钟并于-70℃冷冻至少1小时。然后将板从冷冻柜中取出，并在室温下解冻。给各孔中加入100μl 1-Step^TM PNPP(Pierce化学公司，罗克福德，IL)。孵育20分钟后，在分光光度计上于405nm处读板。

数据拟合线性插值法，得出EC50值(对于激动剂模型)或IC50值(对于拮抗剂模型)。对于拮抗剂模型，计算每个化合物相对于单独的E2(1nM)的％效力。对于激动剂模型，计算每个化合物相对于对他莫昔芬响应的％作用。

在激动剂模型中，测试了F-III，它比他莫昔芬的刺激作用更弱。在拮抗剂模型中，F-III抑制高于至少70％的1nM雌二醇响应。

10-天大鼠激素(卵巢刺激)筛选：用于卵巢毒性的初期首次筛选采用10-天大鼠激素研究进行，以测定在施用GYN SERM F-III后的雌二醇和黄体生成素水平。该筛选通过经口腔管饲法对成熟(9-10周龄)F344雌性大鼠施用10天化合物来进行。在第10次剂量约2小时后，快速断头取躯干血，用于评价LH和雌二醇水平。将通过离心获得的血清移除并低于-60℃冷冻储存至分析。采用放射免疫分析(RIA)法测定LH和雌二醇的血清水平。

大鼠LH一级抗体和参考制剂(大鼠LH：RP-3)从Dr.A.E.Parlow，Director，Pituitary Hormones and Antisera Center，Harbor-UCLA医学中心，托兰斯，CA获得。对100μl样品而言，LH试验的检测上限为30ng/mL，检测下限为0.1ng/mL。

E2临床测定。DiaSorin s.r.l.，Saluggia(Vercelli)，意大利。检测上限为1000pg/mL，检测下限为5pg/mL。在上述试验中测试F-III，没有显著增加雌二醇或LH的循环水平。

实用性

作为乳房和子宫组织中的雌激素的拮抗剂，F-III可用于治疗其中雌激素已经被证实起关键作用的疾病。作为骨骼和心血管系统中的雌激素的激动剂，F-III可用于治疗其中雌激素已经被证实起有益作用的疾病。

如本文使用的术语“治疗”包括它们通常接受的含义，即缓和、改善、控制、预防、禁止、遏制、减缓、终止或逆转本文所述的病理病症或其后遗症的发展或严重程度。术语“预防”指减小本发明化合物的接受者遭受或发展任何本文所述的病理病症或其后遗症的可能性。

本发明的化合物对其有用的疾病、紊乱或病症包括但不限于(1)子宫癌和/或乳腺癌；(2)子宫内膜异位；(3)子宫平滑肌瘤/肌瘤；和(4)骨质疏松症。如本文所述的对子宫平滑肌瘤/肌瘤的治疗海可以减少相关症状如疼痛、尿频和子宫出血。

剂量

如本文使用的术语“有效量”指F-III能够治疗本文所述的疾病或其有害作用的量。

所施用的具体剂量根据每种状况下的具体情形而定。这些具体情形包括给药途径、接受者的既往医学史、所治疗的病理病症或症状、所治疗病症/症状的严重程度以及接受者的年龄和性别。接收患者的主治医师应当根据相关情形确定所施用的治疗剂量。

一般来说，F-III的最小有效日剂量超过约5mg。通常而言，最大有效日剂量不超过约350mg。确切的剂量将根据在医药领域的标准实践对接受者“剂量递增”来确定；即，最初给予较低剂量的化合物，逐渐增加剂量，直至观察到预期的治疗作用。

给药途径

F-III可以经多种途径施用，所述途径包括肌内、鼻内、阴道内、静脉内、口服、直肠、皮下、局部和透皮途径。优选的给药途径是口服途径。

组合治疗

F-III可以与其它用于治疗其中这些化合物有用的疾病或病症的药物组合使用。所述其它药物可以经常用的途径和剂量与本发明的盐同时或依次施用。当F-III与一种或多种其它药物同时使用时，优选在本发明的化合物之外还含有所述其它药物的药物单位剂型。因此，本发明的药物组合物包括含有一种或多种其它活性成分的那些。可以单独施用或在同一药物组合物中施用的与本发明的化合物组合的另一其它活性成分的一个实例包括在激素替代疗法(HRT)中使用的药物。