一种松口蘑人工菌塘的诱导方法

摘要

本发明涉及一种松口蘑人工菌塘的诱导方法，其特征在于：a)容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；b)在经70％酒精表面消毒的工作台上，用70％酒精和0.05－1.0％次氯酸钠溶液先后对容器以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液5－20分钟，用量为5－20ml消毒液/100ml容器；c)将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥30－40分钟；d)容器干燥后，将含水量为20％(v/v)、添加了事先用无水乙醇(1.4％，v无水乙醇/v干土)混溶过橄榄油—油浓度为0.5－2.0％(油v/干土v)并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在20－30℃黑暗条件下进行诱导培养。本发明成功地进行了松口蘑人工菌塘的诱导，它具有方法简便，适合非实验室操作；成本低廉，适合在松口蘑产区进行实际推广应用，以增加该食用菌的产量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种松口蘑人工菌塘的诱导方法，尤其是一种适合非实验室操作的实验方法。

背景技术

松口蘑[Tricholoma matsutake(S.Ito.et.Imai)Sing.]—世界上最名贵的菌根型食用菌之一，是国家二级保护植物。在我国主要分布于东北地区的吉林、黑龙江，西南地区的云南、四川，其它如山西、安徽、台湾、西藏等省区也有零星分布。国外主要分布于日本、朝鲜、俄罗斯等国。松口蘑是一种富含蛋白质、多种维生素和大量糖类的美味食品，世界上以日本人最喜欢食用松口蘑，近年来由于环境的恶化和需求量的扩大，日本本土产量已远远不能满足其国内市场的需要，因此每年都大量从外国进口。松口蘑出口已成为其产地的一个重要产业，经济效益相当可观。

关于松口蘑的人工栽培研究已经进行了一个世纪之久，但是迄今为止，除了形成几个子实体原基(Ogawa&Hamada，1975)外，尚没有栽培成功的例子见诸报端。近年来，关于无菌条件下松口蘑人工菌根苗诱导成功的报导有很多(Yamada et al.，1999a；Guerin-Laguette et al.，2000a；Vaario et al.，2000)，这种人工菌根苗可以进行野外栽培，然而，尽管大多数菌根真菌在侵染宿主植物根部后都能够进行扩展生长(Read，1991；Guerin-Laguette et al.，2000b；Wu et al.，2001)，可松口蘑菌丝体即便是其在宿主植物根内形成哈蒂氏网后仍很难进一步生长，移栽后的菌根苗会出现菌丝退化现象，并且菌根也仅能存活4个月左右(Yamada et al.，2001)。这种有限生长的外延菌丝根本无法形成天然条件下松口蘑子实体形成的关键场所—菌塘，因而也就无法继续进行子实体的诱导实验。

菌塘是由密生的白色或灰白色菌丝体与植物根系及土壤颗粒相互交错纽结而成的团状结构(Ogawa，1975a；Hosford et al.，1997；Yamada et al.，1999b)，松口蘑整个生活史及其子实体的产生都是在菌塘上完成的(弓明钦等，2002)。Ogawa(1975a)在观察野外松口蘑菌塘的扩展生长时发现，为了维持菌落的进一步生长发育，与宿主植物相连的菌丝体需要有一个临界生物量。由此可见，人工菌根苗形成后菌丝体在基质中能否顺利生长扩展形成可以满足子实体发生的菌塘，对于松口蘑人工栽培的成功与否是十分关键的问题。

日本东京大学的研究人员对于快速诱导松口蘑人工菌根及工人菌塘的形成作了很深入的研究(Ogawa et al.，1974，1975b；Guerin-Laguette et al.，2001)，他们已报道在无菌土壤或人工基质条件下，将松口蘑菌液接种于发芽1个月的赤松苗木上3～4个星期后，赤松的侧根上就能形成很典型的哈蒂氏网，诱导出人工菌根。他们这一快速人工菌根诱导技术还获得了日本国专利(铃木和夫等，1999)。同时，他们还发现，界面活性剂及植物油对于松口蘑菌丝体的生长具有促进作用(Vaario et al.，2002；Guerin-Laguette et al.，2003)，这一发现对于松口蘑人工菌塘的诱导有着很大的意义。然而，这些诱导方法都存在着一定的缺陷—如Yamada(1999b)和Guerin(2003)等都是对诱导用容器使用了高压灭菌法进行消毒，由于大容量的塑料容器或比较廉价的塑料器皿大都不耐高温，用γ-射线消毒是一种解决问题的办法(寺村智，2000)，但费用高，一般实验室或实验站不可能有这样的设施。所以这些诱导法虽然在理论上可行，但实际操作上却存在很大难度。

发明内容

本发明的目的在于克服了上述技术中存在的不足之处，提出一种在以橄榄油为主要添加物的土壤中诱导菌丝体生长且适合非实验室操作的松口蘑人工菌塘的诱导方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

a)容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；

b)在经70％酒精表面消毒的工作台上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸钠溶液先后对容器内壁以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液5-20分钟，用量为5-20ml消毒液/100ml容器；

c)将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥30-40分钟；

d)容器干燥后，将含水量为20％(v/v)、添加了事先用无水乙醇(1.4％，v无水乙醇/v干土)混溶过橄榄油—油浓度为0.5-2.0％(油v/干土v)并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在20-30℃黑暗条件下进行诱导培养。

所述的培养土包含自然土与人工基质混合物。

所述的人工基质包含蛭石和珍珠岩。

根据权利要求1所述的一种松口蘑菌塘的诱导方法，其特征在于，所述的培养土含有0.5％-2.0％橄榄油，优选为1％。

所述的培养土是在高压灭菌锅中温度为121度、时间持续40-60分钟的条件下进行消毒。

本发明的优点是：

1)成功的进行了松口蘑人工菌塘的诱导

2)方法简便，适合非实验室操作

3)成本低廉，适合在松口蘑产区进行实际推广应用，以增加该食用菌的产量

4)添加物为自然食用物质，适合应用于松口蘑人工子实体诱导的研究

具体实施方式

下面对本发明的实施例做进一步详细描述：

a)容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；

b)在经70％酒精表面消毒的工作台上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸钠溶液先后对容器以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液5-20分钟，用量为5-20ml消毒液/100ml容器；

c)将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥30-40分钟；

d)容器干燥后，将含水量为20％(v/v)、添加了事先用无水乙醇(1.4％，无水乙醇v/v干土)混溶过橄榄油—油浓度为0.5-2.0％(油v/干土v)并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在20-30℃黑暗条件下进行诱导培养。

所述的培养土包含自然土与人工基质混合物。

所述的人工基质包含蛭石和珍珠岩。

所述的培养土是在高压灭菌锅中温度为121度、时间持续40-60分钟的条件下进行消毒。

1)容器消毒

将试管(Φ3.5mm×L17mm)先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干。在经70％酒精表面消毒的超净工作台上，首先用70％酒精喷洒内壁并放置5分钟后，晾30分钟，然后再分别用0.05-1.0％次氯酸钠溶液喷洒内壁并放置5分钟，同样晾30分钟。两次操作中消毒液用量为5ml/100ml容器。

2)检测消毒液浓度对种子发芽的影响

将上述方法消毒的试管作为培养容器，在每个试管中倒入经高压灭菌的含葡萄糖5g/l的琼脂(1.0g/l)培养基30ml，每个浓度四个重复。首先观察五周试管内的污染情况，然后在试管中接入种子进行发芽实验，每个管中接入消毒后的赤松种子2粒，分别观察其污染率以及种子的发芽旅。

从表1中可以看出，次氯酸钠溶液浓度为零时，一周后四个管中有三个产生了污染，两周后所有试管全部污染；而当溶液浓度为0.05-1.0％时，所有试管到第五周末都没有产生污染，且到第八周结束时，发芽率分别为：1.0％--50％；0.5％-62.5％；0.1％-72.5％；0.05％-87.5％。

                      表1次氯酸钠溶液消毒试管观察记录表

  浓度(％)  一周  两周  三周  五周  八周  发芽率(％)  0.0  0.05  0.1  0.5  1.0  ---  ----  ----  ----  ----  -+++  ----  ----  ----  ----  ++++  ----  ----  ----  ----  ++++  ----  ----  ----  ----   ----  ----  ----  ----   87.5  72.5  62.5  50

“----”四个试管都无污染；“-+++”三个有污染，一个没有；“++++”四个都有污染当次氯酸钠溶液浓度为0.05％时，赤松种子的发芽率为87.5％，这个数值非常接近于高压灭菌时的发芽率(90％，实验数据)，但当溶液浓度为1.0％时发芽率仅为50％。由此可见，当次氯酸钠溶液浓度为0.05％时，种子的发芽率几乎没有受到影响，且发芽用容器的消毒效果也达到了最佳。

3)松口蘑菌丝体生长的诱导

取培养土若干(60℃，24小时)，加入蒸馏水—使土壤含水量为20％(v/v)、及事先用无水乙醇(1.4％，v无水乙醇/v干土)混溶过的橄榄油—使土壤中油的含量分别达到0％，0.5％，1.0％，2.0％(油v/干土v)等四个浓度梯度。搅拌均匀后，121℃高压灭菌40分钟。超净工作台中量取灭菌后的混合培养土10ml直接倒入1)所述方法消毒后的直径6cm的玻璃培养皿中，同时接入直径8mm的两个圆形菌块，供试菌株为W2，F2和A，每种处理四个重复，用保鲜膜封缠3圈，封好后进行暗培养(23±2℃)。两个月后测定菌丝体麦角固醇含量。

菌块接入土壤中三天后即可观察到菌丝的生长。一个月后，每个培养皿中都以两个菌块为中心形成了两个圆形菌落，对照与油/土培养条件下都是如此，所不同的是，对照培养土中的菌丝生长稀疏，而添加橄榄油的培养土中菌丝生长致密。两个月后收集菌丝体时发现，油/土培养基质中的菌丝与土壤紧密结合在一起，两个菌块都形成了两个圆形团状物，生长状况极其酷似野外的松口蘑菌塘。另外，麦角固醇含量测定结果也显示(见表2)，油/土混合培养基质中的菌丝体生物量明显高于对照。且随着橄榄油浓度的增加，麦角固醇含量呈正相关。所以，当土壤中添加橄榄油浓度为0.5-2.0％时，对松口蘑菌丝体的生长都有良好的促进作用，且浓度越高促进作用越强。

表2不同橄榄油浓度的培养土中菌种的麦角固醇含量(μg/g干土)

    浓度(％)    W2    A    F2    0.0    0.5    1.0    2.0    0.700    1.214    1.823    3.596    0.910    1.406    3.031    4.315    1.585    2.688    3.766    5.897

注：数据来源于四个重复的平均值

4)检测不同浓度橄榄油的油/土混合基质对赤松苗生长的影响

橄榄油/土壤混合培养基质设置0％，0.5％，1.0％，2.0％，(油v/干土v)四个浓度梯度。将无菌赤松苗移入消毒后并装有经灭菌的各混合基质的玻璃管(Φ3.5mm×L17mm)中，每种处理四个重复，用塑料薄膜将管口封好后，放入组培室培养架上，光照强度2000lux，温度24±3℃，光照12h/天，四周后记录赤松苗生长情况并称量其地上部与地下部干重。

赤松苗在土壤中培养两周后，橄榄油浓度为0.0-1.0％的试管中幼苗均长势良好，而浓度为2.0％的则部分苗的叶尖有些变黄。到第四周结束时，0％浓度的四棵苗长势良好；0.5％的四棵苗中两株叶尖部分发黄，其余长势良好；1.0％浓度的苗生长情况同0.5％的相类似；而2.0％浓度的四棵苗则叶尖全部发黄，且部分苗的茎也变黄。另如表3所示，当添加橄榄油的浓度为2.0％时，赤松苗地上部和地下部的干重值比其它几种情况下的都低，且差异显著。另外两个浓度条件下，苗的地上部和地下部干重值与不加油的基质相比不存在显著性差异。所以，尽管当土壤中橄榄油添加浓度为2.0％与0.5％和1.0％相比松口蘑菌丝体生长量最大，但是这个浓度却对赤松苗的生长有负面影响，而浓度为0.5％和1.0％时，赤松苗的生长与0.0％相比却没有受到影响。

表3在不同浓度的橄榄油/土壤混合基质中生长四周后的赤松苗干重记录表

  浓度  地上部(mg)  地下部(mg)  0.0％  38.2  8.65    0.5％    32.15    8.65    1.0％    30.57    9.63    2.0％    21.0    5.2

注：数据来源于四个重复的平均值

5)通过松口蘑人工菌根苗的诱导验证人工菌塘的功能

取消毒后的长方形塑料培养平板(145mm×100mm×18mm)若干，向其中加入用3)方法配制并诱导1％浓度的橄榄油/土壤混合基质与松口蘑菌丝体的混合物60ml(约占平板容量的1/2)，并将组织培养一个月的无菌赤松苗移入，用保鲜膜封好，再用锡泊纸将生长有菌丝体的土壤部分包严，以防光线影响菌根合成，使培养平板呈75度角斜放于组培室培养架上，培养条件为2000lux光照强度，24±3℃，12h光照/天。

在油/土混合基质中生长三个月的菌丝体进一步蔓延覆盖了整个土壤表面，并与土壤紧密扭结在一起形成了团块状结构。接入的赤松苗两个月后依然长势良好，Olympus显微镜下观察发现，苗的某些侧根上没有根毛，顔色呈暗棕色，且有疏松的菌丝连接于其上，表明有菌根形成。