使编码包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因缺失或扩增来制造目标蛋白的方法

摘要

本发明涉及通过使编码包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因发生缺失或扩增而制造目标蛋白的方法。本发明提供了采用编码E.coli的包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因来制造目标蛋白的两种方法，该方法对产生目标蛋白的作用尚未见报道。本发明的第一种方法是采用缺失ibpA和/或ibpB基因的细菌来提高目标蛋白的分泌产量和活性。本发明的第二种方法是采用ibpA和/或ibpB基因发生扩增的细菌来提高细胞质中目标蛋白的产量，此外还将目标蛋白从可溶形式转化为不溶的包涵体。

说明书

技术领域

本发明涉及使编码包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因发生缺失或扩增来制造目标蛋白的方法。更具体地，本发明涉及采用缺失ibpA和ibpB的细菌分泌产生目标蛋白的方法，或采用ibpA和/或ibpb发生扩增的细菌制造包涵体形式的目标蛋白的方法。

背景技术

随着重组DNA技术的发展，可在细菌、酵母、霉、动物、植物和昆虫细胞中大量制造医药用和工业用的蛋白，而这些蛋白质在自然条件下仅可少量获得。然而，在寄主细胞中大规模制造目标蛋白时，细胞将目标蛋白识别为应激蛋白(stress)，并因此为保护目标蛋白而产生分子伴侣。该分子伴侣人多数是热休克蛋白(HSPs)，在所有细胞中出现至少一个。

在E.coli的情况下，HSPs包括SecB、DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES、IbpA、IbpB等，并对DNA复制、RNA合成、蛋白合成、折叠和再生，以及细胞生长和分化等起到重要作用(LaRossa and Van Dyk，Mol.Microbiol.，5,529-34，1991)。E.coli的细胞质中最典型的HSPs是Dnak-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES。DnaK与变性蛋白的疏水片段相结合并被DnaJ水解，之后，DnaK被GrpE再生，同时将变性蛋白恢复至天然蛋白。变性蛋白的这种折叠可由GroEL-GroES加快。

人们为改进采用HSPs制造目标蛋白的方法已经进行了许多研究。迄今为止，已经进行的研究可被广泛地分为制造可溶形式的目标蛋白的方法，以及制造不溶包涵体形式的目标蛋白的方法。前一方法的特点是HSPs被同时表达，以提高目标蛋白的产量和活性。Goloubinoff等报道了采用GroEL和GroES来提高活性的外源二磷酸核酮糖羧化酶(核酮糖)的产量(Goloubinoff等，Nature，337，44-7，1989)。此外，Georgiou和Valax报道了GroEL和GroES，或DnaK和DnaJ在制造β-半乳糖苷酶中的应用(Georgiou和Valax，Curr.Opin.Biotechnol.，7，190-7，1996)。另外，Murby等报道了细胞自身蛋白或目标蛋白的表达和分泌所必需的DnaK蛋白能与碱性磷酸酶或融合蛋白共同表达(Burby等，Biotechnol.，appl.Biochem.，14，336-46，1991)。

然而，该系统在目标蛋白制造中存在下列几个问题：(1)由于HSPs蛋白同时过量表达，总蛋白中HSPs蛋白的比例增加至30-50％，从而相对降低了细胞最大程度地合成目标蛋白的能力。(2)由于采用了两种表达载体，因而降低了质粒的稳定性。(3)由于目标蛋白的准确折叠是由许多分子伴侣的合作完成的，因此采用一种或两种分子伴侣不可能完成这一折叠(Langer等，Nature，356，683-9，1992)。近来，为尝试解决这类问题中的一些，人们开发出采用HSPs本身具有突变体的菌株的方法。Baneyx等已报道了采用DnaK突变体使目标蛋白的产量增加2-4倍(US5,552,301)。

同时，后一方法的特点在于采用HSPs的调节子rpoH缺乏的菌株来提高目标蛋白的产量。rpoH基因(Sigma 32：δ³²)突变体菌株降低了折叠所涉及的HSPs的合成以及变性蛋白的降解，因此适用于制造易于被蛋白酶所降解的蛋白，或适用于制造不溶性包涵体形式的目标蛋白。Easton等已报道了采用rpoH菌株以20-25％的产率制造bIGF2(牛胰岛素样生长因子2)，它是一种细胞质中的包涵体(Easton等，Gene，101，291-5，1991)。而且，Obukowicz等已报道采用一种新的rpoH突变菌株提高了目标蛋白的产量(Obukowicz等，Appl.Environ.Microbiol.，58，1511-23，1992)。此外，Goldberg等已报道采用rpoH和lon突变菌株减少了目标蛋白的降解，从而提高了目标蛋白的产量(US4,758，512)。然而，该系统在制造目标蛋白的过程中对细胞生长有着致命的影响。

迄今为止，在目标蛋白的制造中还未应用过小热休克蛋白(sHSPs)。sHSPs是具有12-42kDa的小分子量的HSPs，由热或例如目标蛋白的过度生产等应激因素诱导，并对目标蛋白的变性提供保护。sHSPs存在于从真核细胞到原核细胞的所有生物体中，且自从被发现之日起直到目前，sHSPs包括人类sHSPs(HSP27，aA-和βB-晶体蛋白)，鼠科HSP25，Pisum sativum(豌豆)HSP18.1，Saccharomyces cerevisiae HSP26，Bradyrbizobium japonicumsHSPs(HSPH，HSPB，HSPC，HSPF)，Methanococcus jannaschii HSP16.5，Synechococcus vulcanus HSP16，以及Mycobacterium tuberculosis HSP16.3(Studer和Narberhaus，J.Biol.Chem.，275，37212-8，2000)。

尤其是，已报道在重组E.coli中制造目标蛋白时，作为属于sHSPs的包涵体相关蛋白ibpA和/或ibpB的基因与目标蛋白相结合(Allen等，J.Bacteriol.，174，6938-47，1992)。因此，显然属于sHSPs的ibpA和/或ibpB基因在生物体，尤其是细菌中具有应激反应而保护变性蛋白。

将目标蛋白分泌入E.coli外周胞质或培养基中的方法具有下列几个优点：(1)由于外周胞质或培养基中的蛋白含量明显低于细胞质中的含量，因此目标蛋白可被分离出，并以高纯度进行提纯(Nossal等，J.Biol.Chem.，241，3055-62，1966)。(2)由于被分泌到外周胞质或培养基中的目标蛋白与含有多数蛋白酶的细胞质是相互独立的，因此可提前防止由细胞质蛋白酶所导致的目标蛋白的降解，从而提高目标蛋白的产率(Meerman和Georgiou，Ann.N.Y.Acad.Sci.，721，292-302，1994)。(3)由于与细胞质相比，外周胞质是氧化性更强的环境，因此更容易形成二硫键而使所制造的蛋白进行正确折叠，从而明显减少包涵体的形成(Hockney，TIBTECH，12，456-63，1994)。然而，也经常存在这样的情形：末分泌目标蛋白或分泌的蛋白不具有活性。

同时有利的是，任何蛋白都以不溶的包涵体形式制造。迄今为止，进行了许多包涵体生产的研究，但尚未建立包涵体形成的准确机理，也还未发现任何一般的关联(Makrides，SC，Microbiol.Rev.，60，512-38，1996)。包涵体的形成随着寄主载体系统以及蛋白的特性、培养和表达条件的变化而有所不同，因此，只有通过在预期的系统中进行测试才能发现。

因此，本发明人在尝试采用细菌来开发增加目标蛋白产量的菌株系统方面进行了广泛的研究，从而发现采用编码E.coli的包涵体相关蛋白的ibpA和ibpB基因缺失的细菌，能增加目标蛋白的分泌产量和活性，而采用编码E.coli包涵体相关蛋白的ibpA和ibpB基因发生扩增的细菌，则提高了细胞质中目标蛋白的产量，并允许以包涵体形式制造目标蛋白。在这些要点的基础上，完成了本发明。

发明内容

因此，本发明的目的之一在于提供一种有效分泌目标蛋白而提供ibpA和ibpB基因缺失的细菌，以及分泌产生目标蛋白的方法，该方法包括对所述的细菌进行培养。

本发明的另一个目的是提供ibpA和/或ibpB基因发生扩增的细菌，以及生产不溶包涵体形式的目标蛋白的方法，该方法包括对所述的细菌进行培养。

为实现上述目标，本发明提供了ibpA和ibpB基因缺失的细菌以及分泌产生目标蛋白的方法，该方法包括对所述的细菌进行培养。

在本发明中，所述的细菌优选为E.colis，其包括编码目标蛋白的基因以及另外的信号序列。

而且，本发明提供了质粒pACTacIbpAB、pACIbpAB、pACTacIbpA或pACTacIbpB，它们用于扩增细菌中的ibpA和/或ibpb基因。

另外，本发明提供了制备ibpA和/或ibpB基因发生扩增的细菌的方法，以及生产不溶包涵体形式的目标蛋白的方法，该方法包括对所述的细菌进行培养。

更具体地，本发明提供了采用质粒pACTacIbpAB、pACIbpAB、pACTacIbpA或pACTacIbpB进行转化而使ibpA和/或ibpA基因发生扩增的细菌。

在本发明中，细菌优选为E.colis，并含有编码目标蛋白的基因。另外，使ibpA和/或ibpB基因发生扩增，以生产出不溶包涵体形式的目标蛋白(该目标蛋白曾经以可溶形式制得)。该包涵体形式的目标蛋白在细胞质中聚集。

另外，本发明提供了通过使ibpA和/或ibpB基因发生缺失或扩增，从而将目标蛋白的制备形式调节为可溶形式或不溶形式的方法。

迄今为止尚未报道过ibpA和/或ibpB基因对制备目标蛋白的影响，也从未将ibpA和/或ibpB基因用于制造目标蛋白。根据本发明，采用其中编码E.coli包涵体相关蛋白的ibpA和ibpB基因缺失的细菌，提高了目标蛋白的分泌产量和活性。而且，采用其中编码E.coli的包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因发生扩增的细菌，增加了细胞质中目标蛋白的产量，也制得了包涵体形式的目标蛋白。

在本发明中，由于可以按照需要控制包涵体的形成，根据医药和工业领域的蛋白的加工系统以及蛋白的特性，可获得下述的许多优点：(1)载体的构建和培养条件简单，可采用一种方法，如高细胞密度培养法等获得高产量的蛋白(Lee，SY，Trends Biotechnol.，14，98-105，1996)。(2)由于在培养、菌株收集和破坏后经低速离心，可将蛋白提纯至通常为80-90％的纯度，因此与第一步中可溶性蛋白分离纯度1-30％的情况相比，上述方法的蛋白分离相当容易(Jeong和Lee，Appl.Environ.Microbiol.，65，3027-32，1999)。(3)当对细胞内蛋白酶敏感的蛋白容易降解时，本发明可通过形成包涵体而保护蛋白不受蛋白酶的攻击(Kane和Hartley，Trends Biotechnol.，6，95-101，1988)。另外，由于通过实验很好地实现了对包涵体的溶解和变性处理，因此，与获得可溶形式的蛋白相比，获得包涵体形式的蛋白可能是一个好得多的制备系统(Denefle等，Gene，56，61-70，1987；Saito等，J.Biochem.，101，1281-88，1987；Gill等，BiolTechnol.，3，643-6，1985；Weir和Sparks，Biochem.J，245，85-91，1987)。

附图简要说明

图1是质粒pSKIbpABKm的基因图谱。图1中，ibpA′表示从ibpA基因前部的5′端开始的500bp片段，而ibpB′则表示从ibpB基因的3’端开始的500bp片段。

图2是质粒pACTacIbpA的基因图谱。

图3是质粒pACTacIbpB的基因图谱。

图4是质粒pACTacIbpAB的基因图谱。

图5是质粒pACIbpAB的基因图谱。

图6是质粒pTac99GFP的基因图谱。

图7是质粒p223-3IFN-γ的基因图谱。

图8是质粒pTac99IL-12p40的基因图谱。

图9的电泳图显示，诱导4小时后，用重组质粒pTrcSlPhoA转化的重组E.coli W3110中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图10的电泳图显示，用重组质粒pTrcSlPhoA转化的重组E.coli WIbpA和WIbpB中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图11的电泳图显示，诱导表达4小时后，用重组质粒pTrcSlPhoA转化的重组E.coli WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图12的电泳图显示，诱导表达4小时后，用重组质粒pTrcSOb4转化的重组E.coli W3110和WIB101中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图13的电泳图显示，用重组质粒pYKM-I₁转化的重组E.coli W3110，WIbpA，WIbpB和WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图14的电泳图显示，用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpA、pACTacIbpB和pACTacIbpAB中的每一个和重组质粒pYKM-I₁共同转化的重组E.coliW3110获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图15的电泳图显示，用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个和重组质粒pYKM-I₁共同转化的重组E.coli W3110和WIB101中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图16的电泳图显示，用重组p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个和重组质粒p223-3IFN-γ共同转化的重组E.coli W3110和WIB101中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图17的电泳图显示，用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个和重组质粒pTac99IL-12p40共同转化的重组E.coli W3110和WIB101中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图18的电泳图显示，用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个和重组质粒pTac99GFP共同转化的重组E.coli W3110和WIB101中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图19的电泳图显示，用重组质粒p184ΔCm和pACTacIbpAB中的每一个和重组质粒pTac99GFP共同转化的E.coli W3110中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图20示出了Aequorea victoia GFP的绿色荧光。

发明详述

下面将通过实施例对本发明展开描述。然而，对本领域的技术人员来说显而易见的是，本发明并不受限于这些实施例。

实施例1：构建ibpA、ibpB或ibpAB基因缺失的细菌

按照Sambrook等，Molecular Cloning，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，1989中公开的方法，分离和提纯E.coli W3110(ATTC39936)的染色体DNA。E.coli W3110在500ml Luria-Bertani介质(LB介质)中培养24小时。通过离心法收集早期对数生长期的菌株，然后悬浮于含有10mg/ml溶菌酶(Sigma Co.，USA)的50ml TE溶液中(10mM Tris，1mMEDTA；pH7.6)。菌株悬浮液在室温和缓慢搅拌的条件下培养24小时。

为了破坏菌株并除去蛋白，在培养液中加入10％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液16ml和20mg/ml蛋白酶K(Sigma Co.，USA)570μl，然后在37℃下反应1h。接下来，加入0.5M NaCl溶液14ml和溶于0.7M NaCl溶液中的10％溴化十六烷基三甲基胺(CTAB；Sigma Co.，USA)10.66ml，在65℃下反应10分钟。然后，向反应溶液中加入与反应溶液同体积的氯仿-异丙醇(24∶1)，在室温下小心混合2小时。混合后的溶液以6,000rpm的转速离心10分钟，然后将上清液转移到大口烧杯中，缓慢加入上清液两倍体积的冷乙醇，以沉淀染色体DNA。沉淀的DNA聚集在玻璃棒周围。在空气中干燥玻璃棒而除去乙醇，将染色体DNA溶解于1ml TE溶液中。向DNA溶液中加入核糖核酸酶，至最终浓度为50g/ml，然后在37℃下反应1小时。

在反应结束时加入与反应溶液等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，在室温下小心混合2小时。混合后的溶液以6,000rpm的转速离心10分钟，然后将上清液转移到大口烧杯中，向大口烧杯中缓慢加入上清液两倍体积的冷乙醇，以沉淀染色体DNA。沉淀的DNA聚集在玻璃棒周围。在空气中干燥玻璃棒而除去乙醇，最后，将提纯的E.coli W3110的染色体DNA溶解于1ml TE溶液中。

为了使ibpA、ibpB或ibpAB基因从E.coli中缺失，采用了噬菌体λ(bacteriophaseλ)的红色操纵子(Jeong和Lee，Appl.Environ.Microbiol.，68，4979-85，2002)。为通过同源重组构建突变体，用含有噬菌体λ红色操纵子的pTrcEBG转化E.coli W3110，然后加入1mM IPTG诱导E.coli W3110(被pTrcEBG转化的)中红色操纵子的表达。采用该E.coli制备具有电穿孔能力的细胞。

为通过异源重组构建突变体，采用E.coli W3110的染色体DNA作为模板。用引物(SEQ ID Nos：1和2)来扩增含启动子的500bp ibpAB基因片段，用引物(SEQ ID Nos：3和4)来扩增从ibpAB基因的3’端开始的500bp片段。将扩增的基因分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene Cloning Systems，USA)的NotI限制性内切酶和XbaI识别位点内，以及pBluescript SK(-)的EcoRI限制性内切酶和SalI识别位点内。引物(SEQ ID Nos：5和6)用于扩增卡那霉素抗性基因的600bp片段，将扩增的基因克隆到位于上述制得的质粒中部的XbaI限制性内切酶和EcoRI识别位点内，从而获得质粒pSKIbpABKm(图1)。

采用质粒pSKIbpABKm作为模板，将以引物(SEQ ID Nos：1和4)得到的PCR产物转化到如上所述构建的具有电穿孔能力的细胞中，从而使ibpA和ibpB基因发生缺失。缺失ibpA和ibpB基因的突变E.coli被称为WIB101。从WIB 101菌株中分离出一个染色体，然后通过采用引物(SEQ ID Nos：5和6)的PCR方法确认卡那霉素抗性基因插入到染色体中ibpAB基因的位置处。

而且，为制备缺失ibpA或ibpB基因的Ecoli，分别采用引物(SEQ ID Nos：7和8)以及引物(SEQ ID Nos：9和10)，通过PCR方法扩增含有从ibpA或ibpB基因的5′端开始的60bp片段和从ibpA或ibpB基因的3′端开始的60bp片段的卡那霉素抗性基因。将扩增的PCR产物转化到具有电穿孔能力的细胞中，从而使ibpA或ibpB基因发生缺失。缺失ibpA或ibpB基因的突变Ecoli分别被称为WIbpA和WIbpB。

所有PCR条件为：在95℃下初始变性5分钟；在95℃下变性50秒，30个循环，在55℃退火1分钟，在72℃延伸1分30秒；以及在72℃下最后延伸5分钟。

5′-ataagaatgcggccgccagctgtggatcaccgaaactgat-3′(SEQ ID NO：1)

5′-gctctagatgcatagactgagggggcagca-3′(SEQ ID NO：2)

5′-ggaattctttcgactgtttaagatatttcgg-3′(SFQ ID NO：3)

5′-acgcgtcgacggagaaaatccccagcactaccgg-3′(SEQ ID NO：4)

5′-gctctagagccacgttgtgtctcaaa-3′(SEQ ID NO：5)

5′-cgaattcttagaaaaactcatcgagca-3′(SEQ ID NO：6)

5′-atgcgtaactttgatttatccccgctttaccgttctgctattggatttgaccgtttgtttgccacgttgtgtctcaaaat ctc-3′(SEQ ID NO：7)

5′-tagttgatttcgatacggcgcggttttttcgcttccggaatcacgcgttcgagatcgatttagaaaaactcatcga gca-3′(SFQ ID NO：8)

5′-tgcgtaacttcgatttatccccactgatgcgtcaatggatcggttttgacaaactggccgccacgttgtgtctcaa aatctc-3′(SEQ ID NO：9)

5′-ttagctatttaacgcgggacgttcgctgatagcgatacgctgcgctgcgatgggttcaggttagaaaaactcat cgagca-3′(SEQ ID NO：10)

实施例2：引入ibpA和/或ibpB基因的重组质粒的构建

为了表达ibpA和ibpB基因，按照下列方法构建重组质粒。

采用E.coli W3110的染色体DNA作为模板，按照实施例1所述的方法以SEQ ID NO：11和12的引物、SEQ ID NO：13和14的引物以及SEQ ID NO：15和16的引物进行PCR，从而分别获得了ibpA，ibpB和ibpAB基因。将得到的ibpA、ibpB和ibpAB基因中的每一个克隆到被EcoRI和HindIII消化的质粒pTac99A内，从而分别构建质粒pTac99IbpA、pTac99IbpB和pTac99IbpAB。重组质粒pTac99A的获得方法如下：将pTrc99A (PharmaciaBiotech.，Uppsala，Sweden)的trc启动子转化成pKK223-3(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)的tac启动子。用限制性内切酶PvuII和EcoRI消化pKK223-3的tac启动子，然后将tac启动子的基因片段克隆到被相同限制性内切酶消化的pTrc99A内。

用限制性内切酶SspI消化质粒pTac99IbpA、pTac99IbpB和pTac99IbpAB中的每一个，然后克隆到用DraI和PvuII消化的质粒pACYC184(New England Biolabs，USA)中，从而分别构建质粒pACTacIbpA，pACTacIbpB和pACTacIbpAB(图2、3和4)。

为表达具有自身启动子的ibpAB基因，采用W3110的染色体DNA作为模板并采用SEQ ID NO：17和18的引物，按照实施例1的方法进行PCR，从而得到含有ibpAB启动子和基因的PCR产物。用EcoRI消化得到的基因，并克隆到被同一酶消化的pACYC184(New England Biolabs，USA)内，从而构建质粒pACIbpAB(图5)。

5′-ggaattcatgcgtaactttgatttatccc-3′(SEQ ID NO：11)

5′-cccacttttagttgatttcgatacggcgc-3′(SEQ ID NO：12)

5′-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3′(SEQ ID NO：13)

5′-cccaagcttltagctatttaacgcgggacgttcgct-3′(SEQ ID NO：14)

5′-ggaattcatgcgtaactttgatttatccc-3′(SEQ ID NO：15)

5′-cccaagcttttagctatttaacgcgggacgttcgct-3′(SEQ ID NO：16)

5′-ggaattccagctgtggatcaccgaaactg-3′(SEQ ID NO：17)

5′-ggaattcagaacgtgccgaaatatctta-3′(SEQ ID NO：18)

实施例3：引入了目标蛋白基因的重组质粒的构建

为了表达Aequorea victoria的GFP(绿色荧光蛋白)，采用质粒pGFP_uv(Stratagene Cloning Systems，USA)作为模板并采用SEQ ID NOs 19和20的引物，按照实施例1的方法进行PCR，从而获得GFP基因。用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化得到的GFP基因，并克隆到被相同的酶消化的质粒pTac99A中，从而构建质粒pTac99GFP(图6)。

为了表达INF-γ(干扰素-γ)蛋白，采用含有来自Cytokine Bank(http：//cytokine.chonbuk.ac.kr/)的人类INF-γ基因的质粒pUC18/IFN-γ作为模板并采用SEQ ID NO：21和22的引物，按照实施例1的方法进行PCR，从而获得INF-γ基因。用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化获得的INF-γ基因，并克隆到被相同酶消化的pKK223-3(Phannacia Biotech.，Uppsala，Sweden)内，从而构建质粒p223-3IFN-γ(图7)。

为表达白细胞介素12β链(IL-12p40)蛋白，采用含有来自Cytokine Bank(http：//cytokine.chonbuk.ac.kr/)的人类白细胞介素β链基因的质粒DUC18/p40作为模板并采用SEQ ID NO：19和20为引物，按照实施例1的方法进行PCR，从而获得IL-12p40基因。用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化得到的IL-12p40基因，并克隆到被相同酶消化的pTac99A内，从而构建质粒pTac99IL-12p40(图8)。

5′-ggaattcatgagtaaaggagaagacttt-3′(SEQ ID NO：19)

5′-cccaagcttttatttgatgagctcatcc-3′(SEQ ID NO：20)

5′-ggaattcatgtgttactgccaggacccatat-3′(SEQ ID NO：21)

5′-cccaagcttttactgggatgctcttcgacc-3′(SEQ ID NO：22)

实施例4：在ibpA和ibpB缺失的E.coli中分泌产生碱性磷酸酶蛋白

用现有表达碱性磷酸酶的质粒pTrcSlPhoA转化实施例1中构建的E.coliWIbpA，WIbpB，WIB101和亲本菌株W3110中的每一个(Choi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，640-5，2000)。在含有卡那霉素和氨必西林或仅含有氨必西林的板上筛选转化的每一种菌株。37℃下于LB介质中培养各个重组的E.coli菌株。当分光光度计在600nm波长处测定的光密度(O.D.)为0.7时，加入1mM IPTG(异丙基-对-硫代半乳糖苷)来诱导碱性磷酸酶蛋白的表达。诱导后4小时，从每一个培养液中各取出1ml，并将其分级为总蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白、周质蛋白和细胞质蛋白，同时，从每一个培养液中各取出0.1ml，并测定碱性磷酸酶活性。

将各个培养液分级为总蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白、周质蛋白和细胞质蛋白的方法如下：为得到总蛋白，将1ml培养液在4℃下以6,000rpm的转速离心5分钟；得到的沉淀用0.5ml TE溶液洗涤一次，然后在4℃下以6,000rpm的转速离心5分钟，获取沉淀。将该沉淀悬浮于0.2ml TE溶液中然后进行超声均质处理，从而获得总蛋白。为将总蛋白分级成为可溶性蛋白和不溶性蛋白，使总蛋白在4℃下以10,000rpm的转速离心10分钟，收集得到的上清液为可溶性蛋白，而沉淀则为不溶性包涵体。

为了分级成为周质蛋白和细胞质蛋白，将1ml培养液在4℃下以6,000rpm的转速离心5分钟，然后向得到的沉淀中加入30mM含有20％蔗糖的Tris-HCl溶液(pH8.0)0.4ml，充分混合后加入1mM EDTA，然后在室温下搅拌约10分钟。之后，将搅拌的混合物在4℃下以10,000rpm的转速离心10分钟，向得到的沉淀中加入冷的5mM MgSO4溶液0.4ml，小心混合并在冰浴中搅拌10分钟，在4℃以10,000rpm的转速离心10分钟，然后分别收集上清液和沉淀。在这种情况下，收集的上清液是周质蛋白，将沉淀悬浮于0.2ml TE缓冲溶液中，用超声波进行均质处理后收集为细胞质蛋白(Ausubel等，CurrentProtocols in MolecularBiolov，1989)。

从上述制备的含蛋白溶液的每一个中各取出200μl，与50μl SDS-PAGE样品溶液(25％甘油，2％SDS，14.4mM 2-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝，60mMTris-HCl)相混合，煮沸10分钟，然后在12％分离凝胶上进行SDS-PAGE凝胶电泳。接下来，将凝胶浸入染色溶液(40％甲醇，10％乙酸，0.25g/L考马斯亮兰R)中维持至少两小时来对凝胶进行染色，然后两次浸入脱色溶液中，每次维持至少两小时来使凝胶脱色(图9)。

图9的电泳图显示了从采用pTrcSlPhoA转化的重组E.coli W3110获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。图9中，泳道M表示分子量标准，而泳道1-5则分别表示在诱导表达后4小时从转化菌株中获得的总蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白、周质蛋白和细胞质蛋白。此外，左箭头(←)表示碱性磷酸酶蛋白。

如图9所示，E.coli W3110中的大多数碱性磷酸酶以不溶的包涵体形式存在，而对这一蛋白的N-末端序列分析表明，信号序列以未切除的形式存在且并末分泌入外周胞质。此外，将SDS-PAGE凝胶电泳的结果应用到利用比重计进行的蛋白定量分析中，结果表明碱性磷酸酶在总蛋白中的比例是约15％。

图10的电泳图是从采用重组质粒pTrcSlPhoA转化的重组E.coli WIbpA和WIbpB获得的蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。图10中，泳道M表示分子量标准，而泳道1-3则分别表示诱导表达后4小时从转化菌株WIbpA获得的总蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白。泳道4-6分别表示在诱导表达后4小时从转化菌株WIbpB获得的总蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白。另外，左箭头(←)则表示碱性磷酸酶蛋白。

如图10所示，E.coli WIbpA和WIbpB中的大多数碱性磷酸酶以不溶性包涵体形式存在，而对这一蛋白的N-末端序列分析表明，信号序列以未切除的形式存在且并未分泌入外周胞质。

图11的电泳图是从采用重组质粒pTrcSlPhoA转化的重组E.coli WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图9中，泳道M表示分子量标准，而泳道1-5则分别表示诱导表达后4小时从转化菌株中获得的总蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白、周质蛋白和细胞质蛋白。另外，左箭头(←)表示碱性磷酸酶蛋白。

如图11所示，可以发现，大部分的碱性磷酸酶是以可溶的碱性磷酸酶形式存在的，该酶在E.coli WIB101中分泌之后它的分泌信号序列已被切除，因此外周胞质中含有的可溶碱性磷酸酶的量相当高。此外，将SDS-PAGE凝胶电泳的结果应用到利用比重计进行的蛋白定量分析中，结果是，被分泌的碱性磷酸酶在总蛋白中的比例是约30％，这表明大部分碱性磷酸酶被分泌入外周胞质中。

采用以下的方法测定分泌的碱性磷酸酶的活性(Brickman 和Beckwith，RMol.Biol.，96，307-16，1975)。将上述方法得到的E.coli悬浮于50mM Tris-HCl溶液(pH7.5)1ml中，加入0.1ml氯仿，然后在37℃下反应5分钟。接下来，向混合物中加入0.4％PNPP(磷酸对-硝基苯基酯)0.1ml，并在37℃下反应5分钟。用1M K₂HPO₄溶液0.1ml停止反应，使得到的溶液以12,000rpm的转速离心5分钟后仅收集上清液。在50mM Tris-HCl溶液中稀释上清液，然后用分光光度计在420nm和550nm两个波长处测定其吸收度。按照下列方程计算碱性磷酸酶的活性(U/ml)，计算结果列入下列的表1中：

表1中，作为对照组，用质粒pJSl01ΔP转化的E.coli W3110，WIbpA，WIbpB和WIB101的培养液中的碱性磷酸酶活性是按照上述的方法测定得到的。

表1.重组E.coli菌株中碱性磷酸酶的活性

  E.coli菌株  碱性磷酸酶的活性(U/ml)  用pJS101ΔP转化的E.coli W3110  23  用pTrcSlPhoA转化的E.coli W3110  1406  用pJS101ΔP转化的E.coli WIB101  22  用pTrcSlPhoA转化的E.coli WIB101  4720  用pJS101ΔP转化的E.coli WIbpA  25  用pTrcS1PhoA转化的E.coli WIbpA  1025  用pJS101ΔP转化的E.coli WIbpB  22  用pTrcSlPhoA转化的E.coli WIbpB  1790

从上面的表1明显看出，用质粒pTrcSlPhoA转化的E.coli WIB101的碱性磷酸酶活性比用pTrcSlPhoA转化的E.coli W3110、WIbpA和WIbpB高出至少三倍，用pJS101ΔP转化的E.coli W3110、WIbpA，WIbpB和WIB101作为对照，表现出很小的或未表现出碱性磷酸酶活性。因此，考虑到碱性磷酸酶在细胞质中没有活性而只有当分泌到外周胞质时才具有活性这一事实，可以发现在用质粒转化的重组E.coli WIB101所产生的碱性磷酸酶被相继分泌入外周胞质中。

然而，在转化的重组E.coli W3110、WIbpA和WIbpB中产生的碱性磷酸酶是不溶的包涵体形式，而并未分泌入外周胞质。因此，在用质粒转化的E.coli WIB101中，碱性磷酸酶大多以不溶的形式存在，而碱性磷酸酶活性也相当高。而且，由于用质粒转化的重组E.coli WIB101的细胞浓度比重组E.coli W3110高出至少2倍，该重组E.coli WIB101的碱性磷酸酶活性比重组E.coli W3110高出至少6倍。因此，可以发现所提供的ibpA和ibpB缺失的E.coli WIB101是一种对分泌产生可溶的活性碱性磷酸酶有效的菌株。

实施例5：在所提供的ibpA和ibpB缺失的E.coli中分泌产生人类瘦素

用现有的瘦素(leptin)表达质粒pTrcSOb4(Jeong和Lee.，Biotechnol.Bioeng.，67，398-407，2000)转化实施例1中构建的E.coli WIB101和亲本菌株W3110中的每一个。按照与实施例4相同的方式对转化的菌株进行细胞培养。在采用分光光度计在600nm波长处测定的吸收度为0.7时，加入1mMIPTG来诱导瘦素蛋白的表达。诱导表达后4小时从每个培养液中各取出1ml，并将其分级成为总蛋白、可溶性蛋白和包涵体蛋白(图12)。

图12的电泳图是从采用质粒pTrcSOb4转化的重组E.coli W3110和WIB101中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图12中，泳道M表示分子量标准，泳道1-3分别表示在诱导表达后4小时从转化的E.coli W3110中获得的总蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白。泳道4-6分别表示诱导表达后4小时从转化的E.coli WIB101中获得的总蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白。此外，左箭头(←)表示分泌的人类瘦素蛋白。

如图12所示，在转化的E.coli W3110中，约50％总瘦素蛋白为不溶性包涵体形式，但在转化的E.coli WIB101中，多数瘦素蛋白的形式是可溶性蛋白。而且，转化的E.coli WIB101的细胞浓度比转化的E.coli W3110高出3倍，因此，转化的E.coli WIB101的可溶性瘦素浓度实际上比转化的E.coliW3110高出至少3倍。因此，可以发现所提供的ibpA和ibpB缺失的E.coliWIB101是对分泌产生可溶性瘦素蛋白有效的菌株。

实施例6：采用IbpA和/或IbpB表达系统在细胞质中产生人类IGF-I(胰岛素样生长因子-I)蛋白

用现有的IGF-I表达质粒pYKM-I₁(Kim和Lee，J.Biotechnol.，48，97-105，1996)转化实施例1中构建的E.coli WIB101，WIbpA和WIbpB以及亲本菌株W3110。按照与实施例4相同的方式对转化的菌株进行细胞培养。用分光光度计在600nm波长处测得的吸收度(O.D.)为0.7时，加入1mM IPTG来诱导IGF-I蛋白的表达。诱导人类IGF-I蛋白4小时后，通过离心收集培养液，然后采用与实施例4相同的方式将每个转化的培养液分级成为总蛋白(图13)。

图13的电泳图是从采用质粒pYKM-I₁转化的重组E.coli WIbpA、WIbpB和WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图l3中，泳道M表示分子量标准，泳道1表示将采用质粒pYKM-I₁转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道2表示将质粒pYKM-I₁转化的E.coli WIbpA分级成总蛋白的结果，而泳道4则表示将质粒pYKM-I₁转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果。此外，此外，左箭头(←)表示人类IGF-I蛋白。

如图l 3所示，在E.coli W3110、WIbpA和WIbpB中，人类IGF-I蛋白以几乎相同的量进行表达，但在ibpA和ibpB基因缺失的E.coli WIBl01中，细胞质中无法产生目标蛋白。因此，可以发现ibpA或ibpB蛋白是产生目标蛋白所必需的。

另外，用重组质粒pl84ΔCmp、ACTacIbpA、pACTacIbpB、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个与现有的IGF-I表达质粒pYKM-I₁共同转化实施例2构建的E.coli WIB101和亲本菌株W3110。按照上述的方法对E.coli进行细胞培养并诱导人类IGF-I的表达。

图14的电泳图是从用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpA、pACTacIbpB和pACTacIbpAB中的每一个与质粒pYKM-I₁共同转化重组E.coli W3110的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图14中，泳道M表示分子量标准，泳道1表示将用重组质粒p184ΔCm和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道2表示用重组质粒pACTacIbpAB和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道3表示将用重组质粒pACTacIbpA和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，而泳道4则表示将用重组质粒pACTacIbpB和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果。左箭头(←)表示人类IGF-I蛋白。

图15的电泳图是从用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个与质粒pYKM-I₁共同转化重组E.coli W3110和WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图15中，泳道M表示分子量标准，泳道1表示将用重组质粒p184ΔCm和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道2表示将用重组质粒p184ΔCm和pYKM-I₁共同转化的E.coli分级成总蛋白的结果，泳道3表示将用重组质粒pACTacIbpAB和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道4表示将用重组质粒pACTacIbpAB和pYKM-I₁共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道5表示将用重组质粒ACIbpAB和pYKM-I₁共同转化的E.coliW3110分级成总蛋白的结果，而泳道6则表示将用重组质粒ACIbpAB和pYKM-I₁共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果。此外，左箭头(←)表示人类IGF-I蛋白。

如图14和15所示，发现与对照组(用p184ΔCm和pYKM-I₁共同转化的E.coli W3110)相比，E.coli W3110中ibpA、ibpB或ibpAB基因与人IGF-I基因的共表达造成人IGF-I蛋白的产量增长了约2倍。另外也发现，目标蛋白不能在缺失ibpA和ibpB的E.coli WIB101的细胞质中产生。

因此，可以发现ibpA、ibpB或ibpAB基因提高了目标蛋白在细胞质中的产量。为了确认在细胞质中产生的其它目标蛋白是否可应用于本发明中，仪采用ibpAB(pACTacIbpAB和pACIbpAB)进行另外测试。

实施例7：采用ibpAB表达系统在细胞质中产生IFN-γ(干扰素-γ)

用实施例2中构建的重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpA和pACIbpAB中的每一个与实施例3中构建的人类干扰素-γ蛋白的质粒p223-3IFN-γ共同转化实施例1中构建的E.coli WIB101和亲本菌株W3110。按照实施例4相同的方式对转化的菌株进行细胞培养。在分光光度计600nm波长处测得吸收度(O.D.)为0.7时，加入1mM IPTG来诱导人类干扰素-γ蛋白的表达。诱导人类干扰素-γ蛋白4小时后，通过离心法收集培养液，然后按照实施例4的相同方式分级成总蛋白(图16)。

图16的电泳图显示了从用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个与质粒p223-3IFN-γ共同转化的E.coli W3110和WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图16中，泳道M表示分子量标准，泳道1表示将用重组质粒p184ΔCm和p223-3IFN-γ共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道2表示将用重组质粒p184ΔCm和p223-3IFN-γ共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道3表示用重组质粒pACTacIbpAB和p223-3IFN-γ共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道4表示将用重组质粒pACTacIbpAB和p223-3IFN-γ共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道5表示用重组质粒pACIbpAB和p223-3IFN-γ共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道6则表示将用重组质粒pACIbpAB和p223-3IFN-γ共同转化的E.coliWIB101分级成总蛋白的结果。此外，左箭头(←)表示人IFN-γ蛋白。

如图16所示，发现与对照组(用p184ΔCm和p223-3IFN-γ共同转化的E.coli3110相比)相比，E.coli W3110中ibpAB基因和IFN-γ基因的共表达导致了人类干扰素-γ蛋白的产量增长约2倍。而且，还发现目标蛋白不能在缺失ibpA和ibpB的E.coli WIB101的细胞质中产生。

实施例8：采用ibpAB表达系统在细胞质中产生人类白细胞介素12β链蛋白

用实施例2中构建的重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpA和pACIbpAB中的每一个与人类白细胞介素12β链的质粒pTac99IL-12p40共同转化实施例1中构建的E.coli WIB101和亲本菌株W3110。按照实施例4相同的方式对转化的菌株进行细胞培养。采用分光光度计在600nm波长处测定的吸收度(O.D.)为0.7时，加入1mM IPTG来诱导人类白细胞介素β链蛋白的表达。诱导人类白细胞介素β链蛋白4小时后，通过离心法收集培养液，然后按照实施例4的相同方式分级成总蛋白(图17)。

图17的电泳图显示了用重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个与重组质粒pTac99IL-12p40共同转化的重组E.coliW3110和WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图17中，泳道M表示分子量标准，泳道1表示将用重组质粒p184ΔCm和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道2表示将用重组质粒p184ΔCm和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道3表示用重组质粒pACTacIbpAB和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道4表示将用重组质粒pACTacIbpAB和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道5表示用重组质粒pACIbpAB和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道6则表示将用重组质粒pACIbpAB和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果。此外，左箭头(←)表示人类白细胞介素12β链蛋白。

如图17所示，发现与对照组(用p184ΔCm和pTac99IL-12p40共同转化的E.coli W3110相比)相比，E.coli W3110中ibpAB基因和白细胞介素12β链基因的共表达导致了人类白细胞介素12β链蛋白的产量增长约1.5倍。而且，还发现目标蛋白不能在缺失ibpA和ibpB的E.coli WIB101的细胞质中产生。

实施例9：采用ibpAB表达系统在细胞质中产生A.victoria GFP(绿色荧光蛋白)

用实施例2中构建的重组质粒p184ΔCm、pACTacIbpA和pACIbpAB中的每一个与实施例3中构建的A.victoria绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pTac99GFP共同转化实施例1中构建的E.coli WIB101和亲本菌株W3110。按照实施例4相同的方式对转化的菌株进行细胞培养。采用分光光度计在600nm波长处测得的吸收度(O.D.)为0.7时，加入1mM IPTG来诱导GFP的表达。诱导GFP 4小时后，通过离心法收集培养液，然后按照实施例4的相同方式分级成总蛋白，可溶性蛋白和不溶性蛋白(图18，19和20)。

图18的电泳图显示了从用重组质粒p184ΔCm，pACTacIbpAB和pACIbpAB中的每一个与质粒pTac99GFP共同转化的E.coli W3110和WIB101获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图18中，泳道M表示分子量标准，泳道1表示将用重组质粒p184ΔCm和pTac99GFP共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道2表示将用重组质粒p184ΔCm和pTac99GFP共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道3表示用重组质粒pACTacIbpAB和pTac99GFP共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道4表示将用重组质粒pACTacIbpAB和pTac99GFP共同转化的E.coli WIB101分级成总蛋白的结果，泳道5表示用重组质粒pACIbpAB和pTac99GFP共同转化的E.coli W3110分级成总蛋白的结果，泳道6则表示将用重组质粒pACIbpAB和pTac99 GFP共同转化的E.coliWIB101分级成总蛋白的结果。此外，左箭头(←)表示GFP。

如图18所示，发现与对照组(用p184ΔCm和pTac99 GFP共同转化的E.coli W3110相比)相比，E.coli W3110中ibpAB基因和GFP基因的共表达导致了GFP的产量增长约2倍。而且，还发现目标蛋白不能在缺失ibpA和ibpB的E.coli WIB101的细胞质中产生。

图19的电泳图显示了从用p184ΔCm和pACTacIbpAB中的每一个与pTac99GFP共转化的E.coli W3110中获得的蛋白的SDS-PAGE分析结果。在图19中，泳道M道表示分子量标准，泳道1-3表示将用重组质粒p184ΔCm和pTac99GFP共同转化的E.coli W3110分别分级成为总蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白的结果，而泳道4-6则表示将重组质粒pACTacIbpAB和pTac99GFP共同转化的E.coli W3110分别分级成为总蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白的结果。此外，左箭头(←)表示GFP。

如图19所示，发现E.coli W3110中ibpAB基因和GFP基因的共表达使几乎100％的可溶性目标蛋白转化为不溶性包涵体。

图20显示了A.victoria GPF的绿色荧光。在图20中，泳道1表示E.coliW3110中的绿色荧光，泳道2表示E.coli W3110(用pTac99GFP转化的)中的绿色荧光，泳道3表示E.coli WIB101(用pTac99GFP转化的)中的绿色荧光，泳道4表示E.coli W3110(用pTac99GFP和pACTacIbpAB共同转化的)中的绿色荧光。这一绿色荧光的结果与上述进行的SDS-PAGE分析结果一致。因此，本发明发现了可根据需求的有用蛋白的特性和加工系统控制包涵体的形成。

工业应用性

如上所述，本发明提供了采用编码E.coli的包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因制造目标蛋白的两种方法。本发明的第一种方法采用缺失ibpA和ibpB基因的细菌来增加目标蛋白的分泌产量和活性。这类细菌的使用可使目标蛋白被分泌/产生为活性可溶形式，而非失活的不溶性包涵体形式，因此可期望提高生物工艺的产量。本发明的第二种方法采用ibpA和/或ibpB基因扩增的细菌来提高细胞质中目标蛋白的产量并产生不溶性包涵体形式的目标蛋白。通过引入这一重组载体，可按照需求控制包涵体的形成，从而可根据有用蛋白的特性和加工系统形成包涵体，并因此可期望提高生物工艺的产量。

                           序列表

               SEQUENCE LISTING

<110>韩国科学技术院

<120>使编码包涵体相关蛋白的ibpA和/或ibpB基因缺失或扩增来制造目标蛋白的方法

<130>PCF051441C

<140>PCT/KR03/001371

<141>2003-07-10

<150>KR10-2003-15965

<151>2003-03-14

<160>22

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>1

 ataagaatgc ggccgccagc tgtggatcac cgaaactgat                           40

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

gctctagatg catagactga gggggcagca                                        30

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>3

ggaattcttt cgactgttta agatatttcg g                                      31

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

acgcgtcgac ggagaaaatc cccagcacta ccgg                                   34

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gctctagagc cacgttgtgt ctcaaa                                           26

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

cgaattctta gaaaaactca tcgagca                                          27

<210>7

<211>83

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

atgcgtaact ttgatttatc cccgctttac cgttctgcta ttggatttga ccgtttgttt      60

gccacgttgt gtctcaaaat ctc                                              83

<210>8

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

ttagttgatt tcgatacggc gcggtttttt cgcttccgga atcacgcgtt cgagatcgat      60

ttagaaaaac tcatcgagca                                                  80

<210>9

<211>83

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

atgcgtaact tcgatttatc cccactgatg cgtcaatgga tcggttttga caaactggcc      60

gccacgttgt gtctcaaaat ctc                                              83

<210>10

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

ttagctattt aacgcgggac gttcgctgat agcgatacgc tgcgctgcga tgggttcagg      60

ttagaaaaac tcatcgagca                                                  80

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>11

ggaattcatg cgtaactttg atttatccc                                        29

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>12

cccaagcttt tagttgattt cgatacggcgc                                      31

<210>13

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>13

ggaattcatg cgtaacttcg atttatccccactg                                   34

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>14

cccaagcttt tagctattta acgcgggacgttcgct                                 36

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>15

ggaattcatg cgtaactttg atttatccc                                        29

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>16

cccaagcttt tagctattta acgcgggacgttcgct                                 36

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>17

ggaattccag ctgtggatca ccgaaactg                                        29

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>18

ggaattcaga acgtgccgaa atatctta                                         28

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>19

ggaattcatg agtaaaggag aagaacttt                                        29

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>20

cccaagcttt tatttgatga gctcatcc                                         28

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>21

ggaattcatg tgttactgcc aggacccatat                                      31

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>22

cccaagcttt tactgggatg ctcttcgacc                                       30