一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法

摘要

本发明一种多肽随机文库，涉及生物医药领域。本发明多肽随机文库中任何一个融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和随机多肽，其中示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的羧基末端，随机多肽连接至示踪蛋白的羧基末端。本发明还提供了多肽随机文库的构建方法及从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法。本发明多肽随机文库容量达到1×106以上。本发明以增强型的绿色荧光蛋白为示踪，筛选方法简单，可以进行高通量的筛选。本发明随机文库筛选得到的细胞穿透多肽，具有广泛用途。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及多肽文库、构建方法及其应用，具体涉及用于筛选细胞穿透多肽的随机文库、构建方法及其从该文库筛选细胞穿透多肽的方法。

技术背景

细胞膜是细胞与细胞外环境间的半透性屏障，具有选择性通透作用从而使细胞保持恒定的内环境。在分子生物学研究、基因治疗和制药工业中，需要将蛋白、多肽、核苷酸、药物等大分子导入细胞内发挥作用。由于细胞膜的选择性通透作用，使上述物质很难穿过细胞膜到达细胞内作用于相应的药物作用靶位。现有的通过细胞膜向细胞内转运的技术有电穿孔、显微注射、脂质体转染和病毒载体等。但上述细胞膜转运技术存在固有的缺点。电穿孔和显微注射对操作的要求很高、不能在体内应用并且只能对有限的细胞进行操作；脂质体转染缺乏特异性且转运效率低；病毒载体具有抗原性可引起机体的免疫反应。

1988年Frankel等发现HIV-1 Tat蛋白能够直接穿过细胞膜、细胞核膜锚固于特异的基因调控区。随后研究发现，Tat蛋白中的一段长度为11个氨基酸残基的碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR负责了整个蛋白的转运。接着又发现了一些具有这种转运功能的多肽，例如果蝇触角蛋白(antennapedia protein of Drosophila)中的一段16个残基的氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。这些具有穿透细胞膜功能的短肽序列称为细胞穿透多肽(cell penetrating peptide，CPP)，而这一蛋白结构又被称为蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)或膜转导结构域(membrane translocation domain，MTD)(J Biol Chem，1995，270：14255-14258)。

CPP作为大分子物质运载载体的意义是非常巨大的。当一些大分子物质与CPP相连时可以随CPP一起进入细胞，因此CPP是分子生物学研究、基因治疗和制药工业中的重要工具。多肽、蛋白、反义寡核苷酸、肽核酸(J Biol Chem，2002，277(9)：7144-7147)、甚至小的颗粒物质都可通过与CPP相连进入细胞。一些蛋白结合结构域如SH2、SH3(Mol Cell Biol，1999，19(9)：6217-6228)、BH3(Cell Death Differ，2001，8(7)：725-733)和一些模拟DNA结合序列的多肽(Cancer Res，1998，58(16)：3654-3659)，一旦与CPP相融合就可进入细胞浆或细胞核内，使原有的蛋白—蛋白、蛋白—寡核苷酸之间的相互作用发生改变，抑制蛋白—蛋白的结合或蛋白复合物的形成，从而抑制了蛋白的功能。Polo-like激酶-1(Polo-like kinase-1，Plk-1)在细胞的有丝分裂中具有关键作用，在快速分化和一些肿瘤细胞中高度表达。若把Plk-1羧基末端的polo-box与穿透素相融合，使其进入人类肿瘤细胞，增加细胞内的含量，可明显减少多种肿瘤细胞的增殖。蛋白可以通过两种方式与CPP相连：一种是化学方法；另一种是利用重组质粒在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达。Steven将120kDa的β-半乳糖苷酶与Tat的PTD的融合肽带到小鼠的几乎所有组织中，在肝、肾、脾、心肌、肺中都有β-半乳糖苷酶的显色反应，尤其是在作用8h后，在小鼠的大脑中检测到β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)呈阳性反应。

一些生物体能够利用CPP抵抗微生物入侵从而保护自身，如buforin，一种蛙的抗菌肽，能够穿过细菌的细胞壁和细胞膜直接与细菌的DNA或RNA发生结合，从而抑制蛋白质的合成，导致细菌快速死亡而细菌的细胞膜是完整的。还有一些多肽能够在细胞膜上“打孔”，使细胞膜的完整性遭到破坏，或者是干扰膜蛋白的功能导致微生物死亡。Nekhotiaeva等发现，两种CPP-TP10和PVEC(pVEC是源自小鼠血管内皮细胞钙粘素蛋白的一段18个氨基酸残基序列的多肽，TP10是合成的一段21个氨基酸残基序列的多肽)(FASEB J.2004Feb；18(2)：394-6)。在微摩尔量下就可以抑制白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和耻垢分支杆菌的生长。

虽然并没有对所有CPP的细胞特异性进行过研究，但现有的体外实验并没有表明哪一种CPP具有明显的细胞特异性。例如，对于穿透素(Penetratin)家族成员几乎可以穿透所有的细胞类型，从成纤维细胞到神经元。由于CPP穿膜的基本机制是要和膜脂质相结合，这就提示CPP可能没有严格的细胞特异性。但是不同的细胞类型其膜脂质的组成、糖的类型和细胞外基质的特异性是不同的，因此，可以影响CPP的附着和摄入，特别是带净电荷比较多的CPP。因此，在同一组织中一些细胞就会选择性地摄入一类CPP。例如，当把穿透素注入神经系统中时，穿透素主要聚集在神经元处(Eur J Neurosci，2000，12(8)：2847-2855)。果蝇触角蛋白也被神经元选择性地摄取，这需要特定的糖类与神经细胞表面的神经细胞粘附分子(NCAM，neural cell adhesion molecule)结合(New Biol，1991，3(11)：1121-1134)。

目前CPP的研究存在如下问题：

首先，CPP的发现是分散而独立的。科学家往往在对某种蛋白进行研究时发现该蛋白具有穿透细胞膜的功能，进而发现其中某段氨基酸序列介导了该功能，然后确定其为CPP，进行细致的研究。

其次，关于CPP穿膜的机制至今还存在着广泛的争议，没有明确的结论。研究表明一些富含精氨酸的CPP其穿膜的机制与细胞表面的多糖如硫酸乙酰肝素有关。但是，并不是所有的CPP都富含精氨酸，因此，不同的CPP可能通过不同的通路或机制进入细胞(J Biol Chem，1997，272(25)：16010-16017)。即使相同的CPP由于其所带的“货物”不同，其进入细胞的机制也不同(Nat Cell Biol，204，(3)：189-196)。近来有报道，Tat和(Arg)₉的入核是由于细胞固定所造成的假象(Science.1999 Sep3；285(5433)：1569-1572)，因为标准的内化实验需要对细胞进行固定(cell fixation)，即使最温和的固定方法如多聚甲醛都可导致人为的摄入(artificial uptake)。因此，需要重新对CPP穿膜的机制进行鉴定，而且在实验的时候要避免一些造成人为摄入的因素。

最后，目前所知的CPP的一个主要特性就是相对缺少细胞特异性。在某些情况下这一点可能是有利的，但是当需要把药物靶向带入身体的特定部位或某一特定类型的细胞时，这点就成了一个主要的问题。因此，提高CPP的特异性成了未来研究的主要目标。在原有CPP的基础上构建更加复杂的复合物可以使CPP具有一定的特异性。利用噬菌体展示技术来筛选细胞特异性的CPP也是一种有前途的方法。

目前为止，尚无人建立系统的方法寻找CPP，并解决上述问题。还没有文献报道采用建立随机文库的方法对CPP进行大规模的筛选。也未见对随机文库进行筛选得到CPP的方法报道。

发明内容

本发明目的是提供一种多肽随机文库。

本发明另一目的是提供一种多肽随机文库的构建方法。

本发明另一目的是提供一种从多肽随机文库中筛选细胞穿透多肽的方法。

本发明所述多肽随机文库是表达文库。文库中任何一个克隆经过诱导表达、纯化后得到的产物为融合蛋白。该融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和随机多肽。

本发明所述的用于纯化融合蛋白的标签，是本领域常用的标签。标签常用是组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST-tag)。本发明最好用组氨酸标签(His-tag)。该标签的特征是该段序列由六个连续的组氨酸组成(H₆)。

编码组氨酸标签(His-tag)基因序列为NOVAGEN公司提供的pET-14b载体所固有，其编码序列为：CATCATCATCATCATCAC。

本发明所述的示踪蛋白，是本领域常用的示踪蛋白。本发明使用的示踪蛋白是荧光蛋白。常用的荧光蛋白有增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型的黄色荧光蛋白(EYFP)、增强型的青色荧光蛋白(ECFP)、红色荧光蛋白(RFP)。本发明使用增强型的绿色荧光蛋白。该蛋白的特点是在激发光激发后，在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光。

编码作为示踪的EGFP的基因序列由BD Biosciences公司的载体pEGFP-C2得到，其基因序列为：SEQ ID NO.1。

本发明所述的示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的氨基末端或羧基末端。本发明所述示踪蛋白最好是连接在用于纯化融合蛋白的标签的羧基末端。

本发明所述的随机多肽是一段含三十个以下(包括三十)的随机氨基酸序列。本发明所述的随机多肽连接至示踪蛋白的羧基末端。

本发明所述多肽随机文库是由相应的DNA文库(用于筛选CPP的DNA文库)翻译转化得到。本发明所述多肽随机文库转化方法是本领域常用的转化方法。例如化学转化法和电穿孔转化法，见J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆(中文第二版)》。

本发明所述的DNA文库由载体和随机的碱基序列组成，如图1所示。

本发明所述的DNA文库中的载体是由pET-14b载体构建得到。本发明所述的pET-14b载体可以由NOVAGEN公司购买得到。本发明所述的pET-14b载体如图2所示，其克隆/表达区如图3所示。

本发明所述的pET-14b载体的改构方法如下：使用聚合酶链反应技术(PCR技术)扩增目的基因片断，用亚克隆的方法给pET-14b载体引入表达产物可作为示踪的基因序列。

改造后的载体如图4所示。其克隆/表达区序列为：SEQ ID NO.2。

其中编码作为示踪的蛋白EGFP的基因序列由BD Biosciences公司的载体pEGFP-C2得到。其中编码用于纯化的His标签的基因序列为CATCATCATCATCATCAC。

本发明所述的DNA文库中的载体含有以下序列：编码用于纯化的标签的基因序列、编码作为示踪的蛋白的基因序列以及多克隆酶切位点。

本发明所述的随机碱基序列是用设计的两条分别含有随机碱基的引物对载体进行PCR扩增，以插入该载体的两个酶切位点之间(图5)。PCR技术是实验室常用技术，引入随机碱基只需在引物设计时加入随机碱基，由商业公司(如上海博亚生物技术有限公司)按设计合成引物，见J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆(中文第二版)》。

DNA文库转化至表达宿主菌后，加入甘油分装冻存，即完成表达文库的建立。

本发明筛选细胞穿透多肽随机文库的构建方法如下：首先将原核表达载体进行改造，改造后的载体除带有编码六个组氨酸的基因序列、编码氨苄霉素的基因序列外还带有编码绿色荧光蛋白的基因序列。然后用PCR的方法，设计两条分别含18个随机碱基的引物，对载体进行扩增，得到随机DNA文库。最后将该DNA文库转化感受态宿主菌，得到表达随机文库。

具体含有以下步骤：

a.对原核表达载体进行改造，在多克隆位点引入四个多克隆酶切位点。

b.引入三联终止密码子。

c.在载体中引入编码示踪蛋白的基因序列。

d.在载体中引入随机序列。

e.将上述所得的载体进行表达得到筛选细胞穿透多肽随机文库。

本发明从多肽随机文库筛选细胞穿透多肽的方法，含有以下步骤：首先将本发明所述的多肽随机文库进行诱导表达并纯化。然后将纯化蛋白加入培养细胞进行培养。最后在荧光显微镜下观察筛选，有绿色荧光在细胞中蓄积的，即可认定其所携带的多肽为细胞穿透多肽。

本发明从多肽随机文库筛选细胞穿透多肽的方法的第三步中以已知能将示踪蛋白带入细胞的多肽或蛋白作为阳性对照。本发明所述的已知能将示踪蛋白带入细胞的多肽或蛋白包括HIV-1 Tat蛋白中的一段碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR(tat)和果蝇触角蛋白中的一段16个氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。常用的是Tat，其在细胞内定位荧光图如图6。

本发明所述的培养细胞可以是各种真核细胞。最好选用贴壁培养的细胞。

本发明所述的观察指标为在荧光显微镜下肉眼可见绿色荧光在细胞的任何部位包括细胞膜、细胞浆、细胞核等聚集。观察时间为加入蛋白后5mins至24h(如5mins、15mins、30mins、60mins、2h、4h、12h、24h)。

本发明多肽随机文库容量达到1×10⁶以上。本发明以增强型的绿色荧光蛋白为示踪，筛选方法简单，可以进行高通量的筛选。本发明随机文库筛选可得到能进入细胞的多肽，具有广泛的用途。

将筛选出的CPP分别进行细胞膜穿透实验。

本发明细胞穿透多肽的细胞穿透实验方法如下：使用常规液体培养基(如DMEM、RPMI1640)将纯化得到的融合蛋白调整到一定浓度范围，将原培养基吸去后，加入培养细胞培养皿/瓶，常规实验室培养条件下孵育5mins到24h后，弃去上清，用灭菌缓冲液洗涤细胞，以除去培养液中的融合蛋白，加入适量同样缓冲液，然后于荧光显微镜下观察。

附图说明

图1显示DNA文库组成。

图2是pET-14b载体示意图。

图3是pET-14b载体克隆/表达区序列。

图4是pET-14b载体改造后(pET-14bMCStop/EGFP)示意图。

图5是随机碱基序列插入该载体示意图。

图6是Tat融合蛋白在细胞内定位荧光图。

图7是pET-14bMCS载体双酶切鉴定图。

图8是pET-14bMCS载体测序图。

图9是pET-14bMCStop载体测序图。

图10是pET-14bMCStop/EGFP载体双酶切鉴定图。

图11是随机多肽文库电泳图。

图12是随机文库构建示意图。

图13是编号为00104的融合蛋白在细胞内定位荧光图。

图14是编号为00701的融合蛋白在细胞内定位荧光图。

图15是编号为01275的融合蛋白在细胞内定位荧光图。

图16是编号01282的融合蛋白在细胞内定位荧光图。

具体实施方式

以下是本发明的实施例，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

随机文库的构建。

第一步：pET-14bMCS载体的构建。这一步是在pET-14b载体多克隆位点Nde I和Xho I之间加入四个酶切位点Apa I(GGGCCC)、Kpn I(GGTACC)、Sma I(CCCGGG)和Not I(CGGCCG)。使用PCR引入突变的方法完成载体构建，其上游引物为5′-GGGCGGCCGCTCGAGGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCG-3′；下游引物为5′-GGGGGTACCGGGCCCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAG-3′。以pET-14b质粒为模板，用Pyrobest高保真聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR反应，反应条件为：95℃ 30s；56℃ 30s；72℃ 5min。对PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。依照TaKaRa MutanBEST Kit的操作指南，将目的片段17μl，10×Blunting Kination Buffer 2μl，Blunting Kination Enzyme Mix 1μl，37℃反应10min，对反应液进行酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，无菌纯水溶解沉淀。取5μl上述溶液加入等量的连接液solution I，16℃反应1h，全量反应液化学转化DH5α感受态细菌，氨苄霉素(100μg/ml)平板筛选。挑取阳性克隆，37℃过夜摇菌，提取质粒。由于在Nde I和Xho I之间加入了Apa I(GGGCCC)、KpnI(GGTACC)、Sma I(CCCGGG)和Not I(CGGCCG)4个酶切位点，因此，可分别用Kpn I单酶切、Kpn I和载体上另一单酶点Hind III进行双酶切鉴定(图7)。初步鉴定正确的质粒进行测序，测序正确的质粒(其测序结果如图8)命名为pET-14bMCS。

原载体的多克隆酶切位点区域就变为序列SEQ ID NO.3。CATCATCATCATCATCAC是编码His-tag标签的碱基序列，CATATG是上游的Nde I酶切位点，GGGCCC是Apa I酶切位点，GGTACC是Kpn I酶切位点，CCCGGG是Sma I酶切位点，CGGCCG是Not I酶切位点，CTCGAG和GGATCC分别是下游的Xho I和BamH I酶切位点。

第二步：pET-14bMCStop载体的构建。在pET-14bMCS载体BamH I酶切位点后加入三联的终止密码TAGATAACTGA。与第一步所述方法类似，设计上游引物为5′-TAGATAACTGAGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGA-3′；下游引物为5′-GGATCCCTCGAGCGGCCGCCCGGG-3′，以pET-14bMCS为模板进行PCR反应。最终得到的质粒经测序鉴定正确，(其测序结果如图9)命名为pET-14bMCStop。

于是原载体克隆/表达区的多克隆酶切位点部位序列变为序列SEQ ID NO.4。CATCATCATCATCATCAC是编码His-tag标签的碱基序列，CATATG是上游的Nde I酶切位点，GGGCCC是Apa I酶切位点，GGTACC是Kpn I酶切位点，CCCGGG是Sma I酶切位点，CGGCCG是Not I酶切位点，CTCGAG和GGATCC分别是下游的Xho I和BamH I酶切位点，TAGATAACTGA是三联终止密码子。

第三步：pET-14bMCStop/EGFP载体的构建。在pET-14bMCStop载体中亚克隆入EGFP。对pET-14b/Tat-EGFP载体(EGFP编码基因连接于该载体Kpn I和Xho I酶切位点之间。)用Kpn I和Xho I进行双酶切，得到的EGFP片段亚克隆至相同双酶切的pET-14bMCStop载体中。挑取的阳性克隆经双酶切初步鉴定(图10)，测序进一步验证正确后，该载体命名为pET-14bMCStop/EGFP。

加入EGFP后，载体的克隆/表达区的序列见SEQ ID NO.5。

其中，CATCATCATCATCATCAC是编码His-tag标签的碱基序列，CATATG是上游的Nde I酶切位点，GGGCCC是Apa I酶切位点，GGTACC是Kpn I酶切位点，GTG TACAAG之间是编码EGFP的碱基序列，CTCGAG和GGATCC分别是下游的Xho I和BamH I酶切位点，TAGATAACTGA是三联终止密码子。

第四步：随机多肽文库的构建。在pET-14bMCStop/EGFP载体Xho I和BamH I之间加入36个随机序列。设计随机上游引物为5′-(N)₁₈GGATCCTAGATAACTGAGGCTGCTAACAAA-3′；随机下游引物为5′-(N)₁₈CTCGAGATCTGAGTCCGGCCGGACTT-3′，以pET-14bMCStop/EGFP质粒为模板，按照第一步所述方法，进行PCR反应。得到的连接反应液经乙醇沉淀后取1μl化学转化至DH5α感受态细菌中，氨苄霉素平板筛选。挑取14个克隆，摇菌，取菌液做快速PCR(95℃ 30s；50℃ 30s；72℃ 2min)，上游引物为CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG；下游引物为T₇TP(GCTAGTTATTGCTCAGCGG)。同时以pET-14bMCStop/EGFP(无随机片段插入)为模板，用相同的引物和条件进行PCR反应，产物用做对照。克隆的PCR产物与对照一起进行2％琼脂糖凝胶电泳(如图11)。

该DNA文库的克隆/表达区序列表如下：

tataccatgg gcagcagcca tcatcatcat catcacagca gcggcctggt gccgcgcggc    60

agccatatgg ggcccggtac cgtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc    120

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc    180

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg    240

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc    300

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc    360

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag    420

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac    480

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg    540

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac    600

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg    660

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag    720

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg    780

gacgagctgt acaagtccgg ccggactcag atctcgag(N)36g gatcctagat aactgaggct gctaacaaag cccga

CATCATCATCATCATCAC是编码His-tag标签的碱基序列，CATATG是上游的Nde I酶切位点，GGGCCC是Apa I酶切位点，GGTACC是Kpn I酶切位点，GTG和TACAAG之间是编码EGFP的碱基序列，CTCGAG是Xho I酶切位点，(N)₃₆代表插入的36个随机碱基，GGATCC是下游的BamH I酶切位点，TAGATAACTGA是三联终止密码子。

随机文库的构建过程见图12。

第五步：转化得到筛选细胞穿透多肽用的随机表达文库。将得到的随机DNA文库取2μl用电穿孔的方法转化到BL21(DE₃)感受态细菌，按《分子克隆(第三版)(英文)》，(J.Sambrook等编著)介绍方法操作，得到106数量级的随机表达文库，加15％甘油分装，于-80℃冻存。

实施例2

随机文库的构建。

第一步：pET-14bMCS载体的构建。其构建方法如实施例1第一步所述。

第二步：pET-14bMCStop载体的构建。其构建方法如实施例1第一步所述。

第三步：pET-14bMCStop/EGFP载体的构建。在pET-14bMCStop载体中亚克隆入EGFP。EGFP编码基因以pEGFP-C2载体为模板，用PCR技术进行扩增，并在该片断5’端加入Kpn I位点，在其3’端加入Xho I位点而得到。

第四步：随机多肽文库的构建。其构建方法如实施例1第一步所述。

第五步：转化得到筛选细胞穿透多肽用的随机表达文库。其方法如实施例1第五步所述。

实施例3

pET-14b/Tat-EGFP的构建。

第一步：pET-14b/Tat载体的构建。其构建方法如实施例1第一步所述。

第二步：pET-14b/Tat-EGFP载体的构建。在pET-14b/Tat载体中亚克隆入EGFP。EGFP编码基因以pEGFP-C2载体为模板，用PCR技术进行扩增，并在该片断5’端加入Kpn I位点，在其3’端加入Xho I位点而得到。

pET-14b/Tat-EGFP的表达及其表达蛋白His-Tat-EGFP穿透细胞膜的阳性结果检测：

用pET-14b/Tat-EGFP(Tat是已知的研究最广泛的CPP，能将融合蛋白携带进入细胞)质粒转化大肠杆菌BL21(DE₃)，氨苄霉素平板筛选，37℃过夜孵育，次晨挑取单克隆加入1.6ml LB/Amp⁺(100μg/ml)培养基中，用48孔深孔板于37℃振摇培养至OD600约为0.6，然后向菌液中加入终浓度为1mmol/LIPTG诱导蛋白表达，转移至室温继续振摇5h。振摇结束后将深孔板中菌液转移至EP管中，6,000rpm、4℃离心6mins。弃上清，细菌沉淀用170μl结合缓冲液(5nmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，160mmol/LNaH₂PO4，Ph7.9)重悬，液氮/37℃反复冻融两次，加入30μl(10mg/ml)溶菌酶(MBCHEM分装)，上下颠倒EP管数次以混匀。置于37℃水浴1h，1h后取出，以4℃，14,000g高速离心20min，上清转移至另一EP管中，加入0.5μl预先用结合缓冲液洗两遍的Ni²⁺-NTA-agarose-beads(Qiagen公司)，混匀后于室温上下颠倒慢摇1h，使蛋白将beads饱和。1h后，3,000rpm室温离心3mins，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液(20nmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，160mmol/L NaH2PO4，pH7.9)洗两遍以洗去杂蛋白，最后用15μl洗脱缓冲液(20nmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，160mmol/L NaH₂PO₄，pH7.9)洗脱蛋白。将蛋白洗脱液加入％孔培养板Hela细胞中，用含10％胎牛血清(FBS)，(美国Hyclone公司)的Dulbecco′s modified Eagle′s medium培养基(DMEM，HYCLONE公司)调整体积至50μl/孔，37℃细胞孵箱中放置3h后，吸去上清并用磷酸盐缓冲液(PBS，9.0g/L NaCl，0.15g/L Na₂HPO4·12H₂O，0.2g/LKH2PO4，pH7.2)洗两遍，补加PBS 100μl，荧光显微镜下观察结果。观察指标为荧光显微镜下肉眼可见细胞内任何部位包括细胞膜、细胞浆以及细胞核等有绿色荧光聚集，即可认定为阳性结果。实际观察到绿色荧光在细胞浆中聚集，呈颗粒状分布(如图6)。

随机文库的构建。构建方法如实施例1所述。

细胞穿透多肽的筛选。

取分装冻存的上述随机文库(孵育后约能生长100个左右单克隆)均匀地铺于氨苄霉素平板，37℃孵育14h。同时用以本实验室已经构建好的质粒pET-14b/Tat-EGFP转化大肠杆菌BL21(DE₃)，铺至氨苄霉素平板筛选，37℃孵育14h，作为本筛选方法的阳性对照。次晨挑取文库生成的单克隆若干个(如95个)，以及一个表达His-Tat-EGFP的克隆，分别加入1.6ml LB/Amp⁺(100μg/ml)培养基中，用48孔深孔板于37℃振摇培养至OD₆₀₀约为0.6，分别取出100ml菌液加甘油冻存，以备对阳性克隆序列进行鉴定，然后分别向余下的菌液中加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导蛋白表达，转移至室温继续振摇5h。振摇结束后将深孔板中菌液转移至EP管中，6,000rpm、4℃离心6mins。弃上清，细菌沉淀用170μl结合缓冲液(5nmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，160mmol/L NaH₂PO₄，pH7.9)重悬，液氮/37℃反复冻融两次，加入30μl(10mg/ml)溶菌酶(MBCHEM分装)，上下颠倒EP管数次以混匀。置于37℃水浴1h，1h后取出，以4℃，14,000g高速离心20min，上清转移至另一EP管中，加入0.5μl预先用结合缓冲液洗两遍的Ni²⁺-NTA-agarose-beads(Qiagen公司)，混匀后于室温上下颠倒慢摇1h，使蛋白将beads饱和。如某些克隆诱导表达得到的融合蛋白不能将besds完全饱和，则诱导更多体积的该细菌，重复上述过程。1h后，3,000rpm室温离心3mins，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液(20nmol/L咪唑，300mmol/LNaCl，160mmol/L NaH₂PO₄，pH7.9)洗两遍以洗去杂蛋白，最后用15μl洗脱缓冲液(20nmol/L咪唑，300mmol/L NaCl，160mmol/L NaH₂PO₄，pH7.9)洗脱蛋白。将蛋白洗脱液加入96孔培养板Hela细胞中，用含10％胎牛血清(FBS)，(美国Hyclone公司)的Dulbecco′s modified Eagle′s medium培养基(DMEM，美国Hyclone公司)调整体积至50μl/孔，37℃细胞孵箱中放置3h后，吸去上清并用磷酸盐缓冲液(PBS，9.0g/L NaCl，0.15g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/L KH₂PO₄，pH7.2)洗两遍，补加PBS 100μl，荧光显微镜下观察结果。观察指标为荧光显微镜下肉眼可见细胞内任何部位包括细胞膜、细胞浆以及细胞核等有绿色荧光聚集，即可认定为阳性结果。

其筛选出的阳性结果编号为00104。对该克隆进行测序鉴定后得到的插入随机碱基区域序列如下：SEQ ID NO.6。该序列中TACAAG是编码EGFP最后两个氨基酸的密码子，CTCGAG为Xho I酶切位点，G GAT CC为BamH I酶切位点，随后是三联终止密码子，T AGG AAA AAA GAG TGT CATGTA CAT GCCCTT TA是插入的随机碱基序列，该序列以阅读框翻译后氨基酸序列为SRKKECHVHAL。

这段多肽形成的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：表达并纯化的融合蛋白在加入细胞培养液以后3h在显微镜下观察，可见细胞中弥散的有绿色荧光，并且主要定位在细胞浆中(如图13)。

实施例4

随机文库的构建。随机文库的构建方法如实施例2所述。

筛选方法如实施3所述。

其筛选的阳性结果编号为00701。对该克隆进行测序鉴定后得到的插入随机碱基区域序列如下：SEQ ID NO.7。该序列中TACAAG是编码EGFP最后两个氨基酸的密码子，C TCGAG为Xho I酶切位点，GG ATC C为BamH I酶切位点，随后是三联终止密码子，G CAC AGG CGA AGG GAC CTG CGT TAGATT CCC CCTC是插入的随机碱基序列，该序列以阅读框翻译后氨基酸序列为RHRRRDLR。这段多肽形成的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：表达并纯化的融合蛋白在加入细胞培养液以后3h在显微镜下观察，可见细胞中弥散的有绿色荧光，并且在胞浆胞核中均匀分布(如图14)。

实施例5

随机文库的构建。随机文库的构建方法如实施例1所述。

筛选方法如实施3所述。

其筛选的阳性结果编号为01275。对该克隆进行测序鉴定后得到的插入随机碱基区域序列如下：SEQID NO.8。该序列中TACAAG是编码EGFP最后两个氨基酸的密码子，C TCGAAG为Xho I酶切位点突变插入了一个A，G GAT CC为BamH I酶切位点，随后是三联终止密码子，AAG GTA TGG AGT GCTATA CGC TGC CTT是插入的随机碱基序列，该序列以阅读框翻译后氨基酸序列为KVWSAIRCLGS。这段多肽形成的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：表达并纯化的融合蛋白在加入细胞培养液以后3h在显微镜下观察，可见细胞膜上有绿色荧光颗粒聚集(如图15)。

实施例6

随机文库的构建。随机文库的构建方法如实施例1所述。

筛选方法如实施3所述。

其筛选的阳性结果编号为01282。对该克隆进行测序鉴定后得到的插入随机碱基区域序列如下：SEQ ID NO.9。该序列中TACAAG是编码EGFP最后两个氨基酸的密码子，C TCGAG为Xho I酶切位点，GGAT CC为BamH I酶切位点，随后是三联终止密码子，G CAC GTG AAG GGT TGC ATC TTG GAACAT ATC C是插入的随机碱基序列，该序列以阅读框翻译后氨基酸序列为RHVKGCILEHIRILDN。这段多肽形成的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：表达并纯化的融合蛋白在加入细胞培养液以后3h在显微镜下观察，可见细胞浆中有绿色荧光聚集形成粗颗粒(如图16)，核区则形成暗区。

序列表

<110>南方医科大学

<120>一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法

<160>10

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>797

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：基因片断

<400>1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac    60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc    720

ggccggactc agatctcgag ctcaagcttc gaattctgca gtcgacggta ccgcgggccc    780

gggatccacc ggatcta                                                   797

<210>2

<211>853

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：基因片断

<400>2

tataccatgg gcagcagcca tcatcatcat catcacagca gcggcctggt gccgcgcggc    60

agccatatgg ggcccggtac cgtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc    120

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc    180

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg    240

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc    300

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc    360

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag      420

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac      480

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg      540

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac      600

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg      660

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag      720

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg      780

gacgagctgt acaagtccgg ccggactcag atctcgagga tcctagataa ctgaggctgc      840

taacaaagcc cga                                                         853

<210>3

<211>104

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：基因片断

<400>3

tataccatgg gcagcagcca tcatcatcat catcacagca gcggcctggt gccgcgcggc      60

agccatatgg ggcccggtac ccccgggcgg ccgctcgagg atcc                       104

<210>4

<211>124

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：基因片断

<400>4

tataccatgg gcagcagcca tcatcatcat catcacagca gcggcctggt gccgcgcggc     60

agccatatgg ggcccggtac ccccgggcgg ccgctcgagg atcctagata actgaggctg     120

ctaa                                                                  124

<210>5

<211>853

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：基因片断

<400>5

tataccatgg gcagcagcca tcatcatcat  catcacagca gcggcctggt  gccgcgcggc   60

agccatatgg ggcccggtac cgtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc      120

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc      180

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg      240

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc      300

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc      360

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag      420

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac      480

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg      540

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac      600

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg      660

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag      720

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg      780

gacgagctgt acaagtccgg ccggactcag atctcgagga tcctagataa ctgaggctgc      840

taacaaagcc cga                                                         853

<210>6

<211>95

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：基因片断

<400>6

tacaagtccg gccggactca gatctcgagt aggaaaaaag agtgtcatgt acatgccctt      60

taggatccta gataactgag gctgctaaca aagcc                                 95

<210>7

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：基因片断

<400>7

tacaagtccg gccggactca gatctcgagg cacaggcgaa gggacctgcg ttagattccc      60

cctcggatcc tagataactg aggctgctaa caaagcc                               97

<210>8

<211>87

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：基因片断

<400>8

tacaagtccg gccggactca gatctcgaag gtatggagtg ctatacgctg ccttggatcc    60

tagataactg aggctgctaa caaagcc                                        87

<210>9

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：基因片断

<400>9

tacaagtccg gccggactca gatctcgagg cacgtgaagg gttgcatctt ggaacatatc    60

cggatcctag ataactgagg ctgctaacaa agcc                                94