血红蛋白为基础的微囊型血液代用品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种以血红蛋白为基础的微囊型血液代用品及其制备方法。首先将壳材溶于有机溶剂形成有机相(O)，同时将血红蛋白、过氧化氢酶、过氧化物歧化酶、高铁血红蛋白还原反应催化剂和氯化钠溶解于水中形成水相(W

说明书

技术领域

本发明涉及一种血液代用品及其制备方法，属生物医学领域。特别涉及一种以具有良好生物相容性的可降解聚合物材料为壳材的微囊型血液代用品及其制备方法。

技术背景

近年来，临床用血量迅速增加，世界范围内频繁出现的血荒频频使得血液短缺已达到危机的程度。而血液交叉感染又使得这一供求矛盾日益加剧。国内外的研究表明血液代用品是解决这一临床危机的唯一出路。与常规血液相比，血液代用品具有无红细胞表面抗原决定簇，可排除适配血型之麻烦，避免输血反应；避免了病原微生物污染血源和进一步交叉感染；保质期长、易储存、运输方便；血源不用依赖稳定供血人群，来源广泛，取材方便，可保障充足供应等优点。为此，安全、有效、可大量生产的血液代用品的研究与开发已成为国际生物技术领域的研究热点之一。

作为人红细胞代用品的血液代用品应具有以下性能：(1)首先应具有理想的氧传递功能；(2)具有适宜的颗粒大小。大量研究表明，要使粒子不被肝脏和脾脏的窦状小管截留且在体内有足够长的循环时间，其粒径最好介于70～200nm；(3)能够维持血液渗透压和酸碱平衡及扩充容量。

血红蛋白是红细胞携氧—释氧的载体，是其关键的组成部分。血红蛋白分子是由2个α亚基和2个β亚基构成的四聚体，直径5.5nm。当中间位置的Fe的化学位是Fe²⁺时，血红蛋白便具有携氧-释氧功能；当Fe的化学位是Fe³⁺时，血红蛋白便失去了传递氧的能力。血红蛋白结合和释放氧是一个高度协同的变构过程。P₅₀，即血红蛋白中氧达到半饱和程度所需的氧分压是表征血红蛋白携氧—释氧功能的重要指标，人血红蛋白在红细胞中的P₅₀为26mmHg。正是基于其特殊的结构和功能，血红蛋白成为血液代用品研制中非常重要的组成部分。

如果直接以除去细胞膜等杂质的无基质血红蛋白为血液代用品，虽然有很强的氧携带性，但会导致严重的肾毒性。当四聚体的血红蛋白分子从红细胞中分离出来，很容易解离成二聚体α、β。这样小分子在循环系统中很快通过肾小球而被排出体外。血红蛋白从血浆进入肾小管，遇酸性物质变成结晶体，此过程还会对肾小球造成不可逆转的损伤，临床出现急性肾功能衰竭，严重的甚至可能导致死亡。

为此，以人红细胞中血红蛋白的P₅₀为目标，采用物理的、化学的或物理化学的方法对无基质血红蛋白进行改性是目前血液代用品研究开发的关键和核心。改性血红蛋白人工血液代用品通常可分为第一代、第二代和第三代血红蛋白人工血液代用品。第一代改性血红蛋白主要是通过分子内和分子间交联聚合制备交联血红蛋白或通过结合聚合物制备结合血红蛋白。其中，对交联血红蛋白的研究时间较长，也比较成熟，基本已经形成了一套基本上完善的研究方法，目前已有几种产品进入临床试验阶段。如美国Baxter公司研制的diaspirin交联的人血红蛋白，原预计1998年上市，但是由于III期临床试验中出现问题而暂时停止，推迟了其上市时间；美国Biopure公司研制的化学修饰牛血红蛋白己进入III期临床试验。Northfield药厂以人血红蛋白为基础生产的血液代用品PolyHeme，目前还在进行III期临床试验。Northfield获准进行研究的产品在安全性和容量方面均处于领先地位。在北美的一些中心，应用高达6个单位的PolyHeme进行选择性主动脉瘤手术的III期临床试验。加拿大多伦多市的Hemosol公司研制生产的HemoLink，是一种从过期的人血中提取的血红蛋白制成的氧棉子糖聚血红蛋白溶液。在完成了无数次的临床前和期安全性试验之后，Hemosol开始进行4项随机对照外科手术，目标集中在安全性上。目前进入临床期。我国四通天坛生物技术有限公司所研制的人工血液代用品采用血红蛋白的交联聚合方法，目前已进入临床试验阶段。另外，陕西西大北美基因股份有限公司研制的人血液代用品，是以猪血红蛋白为原料，选择戊二醛作为交联剂进行聚合的血红蛋白多聚体等。以酶为特征的第二代修饰血红蛋白，在制备聚合血红蛋白的过程中，交联一定量的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物歧化酶(SOD)，可制成PolyHb-SOD-CAT的修饰人工血液代用品。这个方案的基本目的是：清除由血红蛋白产生的自由基；减少高铁血红蛋白的形成；防止内部氧化反应。分子间聚合克服了天然SOD和CAT循环时间短而在治疗上受限的缺点。抗过氧化酶SOD，CAT酶能够保证血红蛋白细胞的氧化环境，保持其功能和结构的完整性。第一代和第二代的修饰血红蛋白制备方法相对较简单，然而，采用这种交联、聚合等方法使得血红蛋白分子内或分子间结合形成大分子或通过转基因技术在动物中表达并纯化出具有活性的血红蛋白，不存在包膜，虽然在血液循环中能模拟正常红细胞中天然血红蛋白的携氧-释氧的生理功能，但这种模拟的血液代用品没有细胞膜的屏障，对纯度要求极高，游离的血红蛋白易于同血液中的许多活性分子作用，诱发一系列异常的副反应。

为了克服上述缺点，出现了第三代血液代用品，即采用合适的壳材包裹血红蛋白和酶形成类似于红细胞结构的微囊型血液代用品。目前的研究主要集中在脂质体微囊血红蛋白和可降解高分子血红蛋白的纳米微囊两类。关于脂质体微囊型血红蛋白的报道出现于七十年代末。1980年，Djordjevich等成功制备出了粒径为0.2um的脂质体微囊型血红蛋白。之后关于这方面的研究报道频频出现。如WO2004047807、WO02087540、US5688526、US5674528、US5049391、US4911929、US4133874等专利均是采用以磷脂为主的脂质体包埋血红蛋白的方法。另外，为了控制微囊中高铁血红蛋白的含量，US20050025757以类脂为壳材，亚甲基蓝、甲苯基蓝、单核苷酸黄素或腺嘌呤二核苷酸为高铁血红蛋白还原催化剂，采用挤出法包埋血红蛋白和催化剂制备微囊型血液代用品。然后以半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基乙酸、吩嗪硫酸甲酯等为还原剂便可以有效地还原高铁血红蛋白。但所制备的微囊粒径偏大。

尽管对脂质体微囊型血红蛋白的研究取得了许多有意义的结果，但大量的动物和临床试验结果显示其在以下方面存在明显不足：(1)脂质体包囊血红蛋白进入体内后容易被肝和脾的巨噬细胞迅速清除，在血液中循环时间有限；(2)脂质体还存在贮存稳定性差、包埋血红蛋白浓度低等缺点；(3)磷脂材料机械强度差，生成的微囊难以收集和储存；(4)膜较致密，葡萄糖、高铁血红蛋白还原催化剂等不能进行微囊内外物质交换等问题等等。

可降解高分子血红蛋白微囊，即利用具有良好生物相容性的可降解高分子材料作为壳材料包埋血红蛋白及酶，通过控制微胶囊表面的物化状态和微结构、粒径大小等来满足临床对血液代用品的要求。与脂质体包囊血红蛋白相比具有明显的优点：(1)聚合物材料机械强度好、通透性好、膜的用量少、血红蛋白的含量高；(2)微胶囊表面呈多孔性，能够透过葡萄糖和其他小分子能力，因此，可制备成含有整个高铁血红蛋白还原系统的微胶囊。反应系统所需要的葡萄糖、还原剂等能够渗透进入微胶囊，反应产物又能扩散出来，所以不会因为反应物在微胶囊内的蓄积而抑制反应。

对可降解高分子血红蛋白微囊的深入研究始于九十年代。如N.Cedrati等采用复乳法制备得到大小为10～500um的聚乳酸血红蛋白微囊(N.Ccedrati，Art.Cells，Blood Subs.and Immob.Biotech.1994，22(3)：867～873)。之后又以聚乳酸和乙基纤维素为囊材制备粒径为于200um的血红蛋白微囊(N.Ccedrati，Art.Cells，Blood Subs.and Immob.Biotech.1997，25(5)：457～462)。尽管该工艺过程简单，蛋白活性高，但所制备的血红蛋白微囊的粒径偏大，远大于理想血液代用品小于200nm的要求，而且该血代品与氧气之间亲和性太强，P₅₀仅为13.9mmHg。US5670170和US5670173报道了TMS Chang等人分别以聚异丁基丙烯氰酯、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸等为囊材，采用乳液聚合法、聚合物沉聚法、乳化扩散法等制备70～200nm的微囊血液代用品。但过程存在血红蛋白易变性，包封率低(10～17％)、成本高等缺点。国内CN1419936A报道了以聚乳酸单甲氧基聚乙二醇共聚物包埋血红蛋白制备血液代用品，尽管该制备方法过程简单、耗时短，但制备的产物粒径小于4um，粒径偏大。

除此之外，上述可降解高分子血红蛋白微囊的研究过程均没有考虑产物中高铁血红蛋白的含量。而高铁血红蛋白是影响血液代用品携氧性能的重要因素。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种以血红蛋白为基础的微囊型血液代用品及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的技术构思是这样的：

以具有良好生物相容性的可降解聚合物为壳材，采用复乳法包裹血红蛋白、酶、高铁血红蛋白还原反应催化剂等，制备粒径大小为70～200nm、包封率高、高铁血红蛋白含量易控、功能和结构更接近于天然红细胞的第三代微胶囊血液代用品。聚合物微胶囊表面的多孔性使得其具有透过葡萄糖、还原剂和其他小分子的能力，满足反应系统的要求。同时反应产物又能扩散出来，不会因为反应物在微囊内的蓄积而抑制反应，从而有效地控制血液代用品中高铁血红蛋白的含量。

本发明的血液代用品，是一种以生物降解聚合物为壳材，血红蛋白、过氧化氢酶、过氧化物歧化酶和高铁血红蛋白还原反应催化剂为芯材的微胶囊，粒径为70～200nm；

所说的壳材是由聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物中的一种或其混合物与卵磷脂和胆固醇组合而成的，其中：聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚己内酯聚乙二醇共聚物等高分子材料已获美国FDA许可，用作注射用微囊和医用手术缝合线、埋植剂等；

壳材∶卵磷脂∶胆固醇＝1∶0～0.7∶0～0.3，质量比；

所用的壳材聚合物的分子量在1.5万～30.0万。聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物的组成为：

聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯∶聚乙二醇＝40∶60～90∶10，质量比；

所说的血红蛋白选自牛血红蛋白、羊血红蛋白、猪血红蛋白或人血红蛋白等；

所说的高铁血红蛋白还原反应催化剂为亚甲基蓝、甲苯基蓝或单核苷酸黄素；

壳材同芯材质量比为1∶1～5；

微囊内血红蛋白∶过氧化氢酶∶过氧化物歧化酶∶高铁血红蛋白还原反应催化剂＝1∶0～0.2∶0～0.2∶0～0.05，质量比。

本发明的制备方法包括如下步骤：

(1)将壳材溶解在有机溶剂中，获得有机溶液O₁。在有机溶液O₁中，壳材的质量浓度以0.5％～5％为适宜；

(2)将卵磷脂和胆固醇溶解在有机溶剂中，获得有机溶液O₂。在有机溶液O₂中，卵磷脂的质量浓度以0～10％为适宜，胆固醇的质量浓度以0～10％为适宜；有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯等中的一种或其混合物；

(3)将有机溶液O₁和有机溶液O₂混合，获得有机相O，或者单独使用步骤(1)配制的有机溶液O₁；

(4)将溶液W₁加入步骤(3)所得的O或O₁中，匀浆分散或超声波分散，获得W₁/O或W₁/O₁初乳液；

所说的溶液W₁为血红蛋白、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和氯化钠的水溶液，血红蛋白的质量浓度为15％～35％，超氧化物歧化酶的质量浓度为0.015％～3％，过氧化氢酶的质量浓度为0.0075％～3％，氯化钠的质量浓度为0.5％～5.0％，高铁血红蛋白还原反应催化剂的质量浓度为0.01～0.9％；

(5)将步骤(4)所得的W₁/O或W₁/O₁初乳液倾入W₂外水相中，经高速匀浆分散或超声波分散，制成W₁/O/W₂或W₁/O₁/W₂复乳液；

所说的W₂外水相为含有表面活性剂的氯化钠水溶液，表面活性剂的质量浓度为0.5％～10％，氯化钠的质量浓度为0.5％～5.0％，所用的表面活性剂选自Tween60、Tween80、Tween85、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407等中的一种或其混合物；

(6)将步骤(5)所得的复乳液加入聚乙烯醇或明胶的水分散液或等渗溶液，挥去有机溶剂，获得表面硬化成型的微囊；

(7)从步骤(6)所得的分散液中收集纳米微囊；

(8)将上述纳米微囊分散到生理盐水或等渗溶液中；

(9)在纳米微囊分散液中直接加入高铁血红蛋白还原剂溶液或待纳米微囊输注体内后加入适量高铁血红蛋白还原剂溶液进行还原。

本发明制备纳米血红蛋白微囊的过程中，外水相多采用生理盐水、等渗溶液等，最好采用等渗溶液，防止微囊静脉输注后，由于微囊内外环境渗透压的差别在注射部位附近就迅速破坏。

所说的等渗溶液的组分和质量浓度为：NaCl 6.8g/L；CaCl₂ 0.2g/L；KCl 0.4g/L；MgSO₄ 0.1g/L；NaHCO₃ 2.2g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 0.126g/L；NaH₂PO₄·2H₂O 0.26g/L。

所说的高铁血红蛋白还原剂为半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基乙酸或吩嗪硫酸甲酯中的一种。所说的高铁血红蛋白还原剂的溶液为高铁血红蛋白还原剂的水、生理盐水或模拟体液溶液。

本发明制备的纳米血红蛋白微囊的粒径范围在70～200nm之间，粒径分布较窄，微囊表面形貌为球形或椭球形。采用本发明的方法制备的纳米血红蛋白微囊的包封率为50～95％，P₅₀为23～30mmHg，并可将微囊中高铁血红蛋白的含量控制在1～5％。因此本发明制备的血红蛋白微囊具有良好的携氧、释氧的功能，粒径小且分布均匀、包封率高、高铁血红蛋白的含量低，因而有望成为理想的血液代用品。采用本发明制备的血红蛋白微囊型血液代用品在临床上的使用方法包括：(1)在体外事先将高铁血红蛋白还原，然后通过常规的方法输注给需要输血的患者；(2)首先通过常规的方法直接将制备的血液代用品输注给需要输血的患者，然后通过口服或注射高铁血红蛋白还原剂进行体内还原。

附图说明

图1为纳米血红蛋白微囊的电镜照片。

图2为纳米血红蛋白微囊的激光粒度分布图。

具体实施方式

                           实施例1

将1克20％(质量浓度)的牛血红蛋白溶液加入到2克5％(质量浓度)聚己内酯的二氯甲烷溶液中，高速乳化15000rpm或超声50W乳化30s，将制成的初乳液加入到100克外水相生理盐水中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，加入500克分散液PVA水溶液中，室温常压下连续搅拌8小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。其包封率为85％，粒径范围在80～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形，粒径分布较窄，见图1。P₅₀为28mmHg，高铁血红蛋白的含量为20％。

                           实施例2

将1克含18％(质量浓度)猪血红蛋白加入到3.6克1％(质量浓度)聚乳酸的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂的溶液中，15000rpm高速乳化或50W超声乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由生理盐水配制而成的外水相中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，加入500克分散液明胶水溶液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。包封率为87％，粒径范围为70～200nm，如图2。P₅₀为23mmHg。

                           实施例3

将1克含15％(质量浓度)牛血红蛋白，3％(质量浓度)超氧化物歧化酶、3％(质量浓度)过氧化氢酶及0.1％(质量浓度)高铁血红蛋白还原催化剂的溶液加入到7.6克质量浓度为2％的PLGA-PEG的二氯甲烷和丙酮的混合溶剂的溶液中，15000rpm高速乳化或50W超声乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由生理盐水配制而成的外水相中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，再进一步分散在500克PVA水分散溶液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。微囊再分散至等渗溶液中，加入2mL 0.5％半胱氨酸的水溶液还原30分钟。微囊中血红蛋白的包封率为73％，粒径范围为70～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形。高铁血红蛋白的含量为4％，P₅₀为26mmHg。

                          实施例4

将3克1％(质量浓度)聚乳酸的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂的溶液和1克含0.6％卵磷脂、0.9％胆固醇的二氯甲烷溶液均匀混合，再将1克18％(质量浓度)人血红蛋白和2，3-DPG的复合物及0.9％(质量浓度)高铁血红蛋白还原催化剂的水溶液加入到上述混合溶液中，15000rpm高速乳化或50W超声乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由等渗缓冲溶液配制而成的外水相中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，再进一步分散在等渗缓冲溶液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。微囊再分散至等渗溶液中，加入2mL 0.5％(质量浓度)高半胱氨酸的水溶液还原30分钟。微囊中血红蛋白的包封率为80％，粒径范围为70～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形。高铁血红蛋白的含量为1％，P₅₀为27mmHg。

                         实施例5

将5克质量浓度为2％的PLGA-PEG的二氯甲烷溶液与10克含0.7％卵磷脂、0.1％胆固醇的乙酸乙酯溶液均匀混合，然后再将1克含17％(质量浓度)牛血红蛋白，0.3％(质量浓度)超氧化物歧化酶、0.1％(质量浓度)过氧化氢酶及0.1％(质量浓度)高铁血红蛋白还原催化剂的水溶液加入到上述有机溶液中，15000rpm高速乳化或50W超声乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由生理盐水配制而成的外水相中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，再进一步分散在500克PVA水分散溶液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。微囊再分散至等渗溶液中，加入2mL 0.5％半胱氨酸的水溶液还原30分钟。微囊中血红蛋白的包封率为82％，粒径范围为70～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形。高铁血红蛋白的含量为3.5％，P₅₀为26mmHg。

                              实施例6

将1克35％(质量浓度)羊血红蛋白、0.015％(质量浓度)超氧化物歧化酶、0.0075％(质量浓度)过氧化氢酶和0.05％(质量浓度)高铁血红蛋白还原催化剂加入到3.5克5％(质量浓度)聚己内酯聚乙二醇共聚物的二氯甲烷溶液中，15000rpm高速乳化或50W超声乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由等渗缓冲溶液配制而成的外水相中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，再进一步分散在500克等渗缓冲溶液配制的分散液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。微囊再分散至等渗溶液中，加入2mL 0.5％(质量浓度)吩嗪硫酸甲酯水溶液还原30分钟。微囊中血红蛋白的包封率为50％，粒径范围为70～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形。高铁血红蛋白的含量为4％，P₅₀为26mmHg。

                             实施例7

将1克18％(质量浓度)牛血红蛋白和0.5％(质量浓度)高铁血红蛋白还原催化剂加入到4.5克1％(质量浓度)聚乳酸聚乙二醇共聚物的二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂的溶液中，15000rpm高速乳化或50W超声乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由等渗缓冲溶液配制而成的外水相中，经高速乳化10000rpm或超声400W乳化1min后，再进一步分散在等渗缓冲溶液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。微囊再分散至20mL等渗溶液中。微囊中血红蛋白的包封率为80％，粒径范围为70～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形。

Wister大鼠体重200～280g，麻醉。分别通过颈动脉输注10mL上述微囊等渗溶液和吩嗪硫酸甲酯水溶液。6小时后，从颈动脉处抽出1mL血液于血液收集试管中，离心(2000g，10min)，收集上清。紫外-可见分光光度计分析高铁血红蛋白含量为4％。

                             实施例8

将1克35％(质量浓度)羊血红蛋白和0.05％(质量浓度)高铁血红蛋白还原催化剂加入到3.5克5％(质量浓度)聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物的二氯甲烷溶液中，高速乳化15000rpm或超声50W乳化30s，将制成的初乳液加入到100克由等渗缓冲溶液配制而成的外水相中，经10000rpm高速乳化或400W超声乳化1min后，再进一步分散在500克等渗缓冲溶液配制的分散液中，旋转蒸发去除有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。微囊再分散至等渗溶液中。微囊中血红蛋白的包封率为50％，粒径范围为70～200nm。微囊表面形貌为球形或椭球形。

Wister大鼠体重200～280g，麻醉。分别通过颈动脉输注10mL上述微囊等渗溶液和高半胱氨酸水溶液。6小时后，从颈动脉处抽出1mL血液于血液收集试管中，离心(2000g，10min)，收集上清。紫外-可见分光光度计分析高铁血红蛋白含量为2％。

                             实施例9

Wister大鼠体重200～280g随机分为3组，I组为治疗组，II组为生理盐水治疗组，III组为对照组，建立Wister大鼠缺血-再灌注模型，具体做法将Wister大鼠饲养3天左右，测正常血相，按每只大鼠全血量的30％放血，可造成失血模型。I组治疗注射补充全血剂量的30％的实施例4所制备的血代品，II组为注射同剂量的生理盐水，III对照组不做任何治疗，实验结果如下：

  动物分组  24小时存活率  I组为治疗组  80％  II组为生理盐水治疗组  20％  III组为对照组  0％。

结果表明，采用本发明制备的包埋血红蛋白的纳米微囊型血液代用品可以有效地用于缺血动物模型，是一种较理想的血液代用品。