具有降低血清葡萄糖和降低血清脂质活性的α－苯硫基羧酸和α－苯氧基羧酸的用途

摘要

本发明描述了式(I)的α－苯硫基羧酸和α－苯氧基羧酸的衍生物的用途：其中的取代基具有正文中描述的含义，用于制备预防和治疗糖尿病，特别是2型糖尿病，其并发症，各种形式的胰岛素抵抗和高脂血症的药物。

说明书

本发明涉及α-苯硫基羧酸和α-苯氧基羧酸的衍生物用于制备具有降低血清葡萄糖和/或降低血清脂质活性的通式(I)药物的用途。

                    发明背景

糖尿病是一种全世界分布广泛的疾病并且与严重的临床并发症有关，其中包括微血管并发症如糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病和糖尿病性肾病，和大血管并发症如动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗塞和中风。

表征糖尿病的胰岛素抵抗还涉及综合征X、多囊性卵巢综合征、肥胖、高血压、高脂血症和高胆固醇血症(J.Am Osteopath Assoc 2000Oct；100(10)：621-34；JAMA 2002 Nov 27；288(20)：2579-88)。

已知高脂血症、高胆固醇血症和高血压在冠心病(CHD)发作方面起决定性作用。

蛋白糖基化的提高涉及上述糖尿病并发症也是已知的(Diabetologia 2001 Feb；44(2)：129-46)。

所述并发症对个体的健康和安宁构成严重威胁。

糖尿病的不同临床形式是已知的，最普遍的是2型和1型糖尿病。2型糖尿病的特征在于对胰岛素作用的敏感性降低(胰岛素抵抗)并且为了补偿这种缺陷导致体内胰岛素水平增加及随后葡萄糖水平增加。许多报道已证实除2型糖尿病本身外，胰岛素抵抗还牵涉多种疾病如血脂异常、肥胖、动脉高血压、脂肪肝和糖尿病本身的某些大血管和微血管表现。胰岛素抵抗和肥胖、高血压和血脂异常合称为综合征X。

为治疗2型糖尿病，许多药物如双胍类和磺酰脲类药物已上市一段时间。最著名的双胍类药物是二甲双胍，但它的作用机制仍不清楚并且它存在副作用如胃肠功能紊乱和在肾脏、心脏、肝脏和肺功能不全等的情况下发生酸中毒的危险。磺酰脲类药物促进β-细胞分泌胰岛素，并且可能存在低血糖发作的副作用。此外，所有使用磺酰脲类药物或二甲双胍的单一疗法长期使用均注定失败(UKPDS研究)。

最近引进市场的药物是噻唑烷二酮类，即胰岛素敏化的抗糖尿病药剂如曲格列酮(J.Med.Chem.，1989，32，421-428)，吡格列酮(Arzneim，Forsch./Drug Res.，1990，40(1)，37-42)和罗格列酮(Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4，1181-1184)，它们能够降低糖尿病性高血糖和胰岛素水平。使用曲格列酮已确认的并且担心属于此类的其他化合物也存在的副作用是：肝脏毒性(其已经导致曲格列酮从美国市场撤出)、LDL-胆固醇增加、体重增加和水肿。

这些化合物是对过氧化物酶体增殖物激活性受体γ(PPARγ)具有高亲和性的合成配体(J.Biol.Chem.，1995，270，12953-12956)。

过氧化物酶体增殖物激活性受体(PPARs)是属于核受体超家族的受体，其功能是控制涉及碳水化合物和脂质代谢的基因的表达(J.Med.Chem.，2000，43，527-550)。PPARs的各种亚型已确认：PPARγ、PPARα和PPARβ(也称为δ)。γ同种型(PPARγ)涉及调节脂肪细胞的分化和能量稳态，而α同种型(PPARα)控制脂肪酸氧化，导致调节血浆中的脂质水平。值得注意的是，在用PPARγ激动剂如罗格列酮治疗的啮齿动物中获得的脂质水平降低在人类受治疗者中很难发现，而由贝特类引起的啮齿动物脂质水平降低则在人类中被证实。在旨在确定可能具有抗糖尿病作用的新分子的结构-活性关系研究中，已证明在PPAR_γ受体活化和降低血清葡萄糖活性间存在对应性(J.Med.，Chem.，1996，39，665-668；J.Med.Chem.，1998，41，5020-5036；5037-5054；5055-5069)。胰岛素敏化作用似乎与激活的PPARγ受体调节的脂肪酸募集作用有关，据认为这通过改善血糖水平并降低胰岛素水平而导致组织的胰岛素抵抗改善(Diabetes，1998，47，507-514)。

近年来具有混合特征的分子，即PPARγ和PPARα的配体已出现(KRP297，Diabetes，1998，47，1841-1847；DRF 2725，Diabetes，2001，50，suppl.2，A108；AZ 242，Diabetes，2001，50，suppl.2，A121-A122；WO01/16120)。在此情况下我们应看看最近公开的Smithkline Beecham专利(2002年9月6日公开的WO 02/067912)，其提到一类被定义为“PPAR全-激动剂”的新化合物，即能够激活所有三种PPAR同种型，从而使PPARγ激活的有害副作用最小化的激动剂。特别是，这类新的抗糖尿病药剂，虽然维持PPARγ激活的典型特征，但被认为导致体重增加较少和水肿较轻。这些化合物可能施加对糖尿病的良好控制，表现出具有降低血清葡萄糖和血清脂质的作用，而较少噻唑烷二酮类中第一系列化合物典型的副作用，所述噻唑烷二酮类中的第一系列化合物仅为PPARγ受体的配体。专利WO01/16120和WO02/067912中要求保护的结构具有共同特征，即它们具有贝特样部分。

但并非科学界全都同意上面描述的内容。事实上，近来对新一代化合物，无论是噻唑烷二酮衍生物还是其它化合物的研究(MC555，J.Biol.Chem.，1998，vol.273(49)，32679-32684；NC2100 Diabetes，2000，49，759-767，YM440，Metabolism，2000，49，411-417)，在基因反式激活试验、肌肉组织的体外葡萄糖摄取实验和PPARγ受体表达缺陷的转基因动物体内实验方面，已提出在PPARγ受体激活和这些化合物降低血清葡萄糖和血清脂质的活性间可能无直接关系(Toxicology Letters，2001，120，9-19)。

通过这一点的证明，很多研究者选择使用糖尿病动物(db/db小鼠，ob/ob小鼠)体内筛选以识别不必是良好PPAR配体的可能的胰岛素敏化剂。根据这些实验，选择了许多具有有希望的抗糖尿病活性的化合物，且它们仍然处于动物模型的研究过程中(DRF 2189，J.Med.Chem.，1998，41，1619-1630；JTT-501，J.Med.Chem.，1998，41，1927-1933)。

科学界现在似乎转向寻找具有不同作用机制的新化合物，所述新化合物对胰岛素敏感性和葡萄糖体内稳态具有相似或更好的作用，而无毒性作用(J.Med.Chem.，2001，44，2601-2611)且它们所具有的降低血清脂质的活性要优于目前使用的旧的和新的抗糖尿病药剂。

高脂血症是糖尿病的一个严重方面，与常常存在的高血压一起构成动脉粥样硬化和心血管病的危险因素，后者是导致糖尿病患者死亡的首要原因。

降低血液中脂质水平的需要常常使用贝特类药物达到，其尽管在胰岛素抵抗方面获得阳性结果，但从未被证实作为降低血清葡萄糖的药剂是成功的。

                    发明概述

现已发现下面描述的式(I)化合物作为降低血清葡萄糖和/或血清脂质的药剂是有效的，特别是能够提高HDL-胆固醇水平。

式(I)化合物具有较低毒性且因此用于治疗高血糖症和/或高脂血症并提高HDL-胆固醇水平。

优选的应用是预防和治疗糖尿病，特别是2型糖尿病、糖尿病的微血管并发症如糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病和糖尿病性肾病、糖尿病的大血管并发症如动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗塞、中风、综合征X、多囊性卵巢综合征、肥胖、高脂血症、高胆固醇血症、高血压、各种形式的胰岛素抵抗、脂肪肝、特别是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)和NASH(非酒精性脂肪肝炎(steatohepatitis))和冠心病(CHD)的一级和二级预防。

因此，本发明其中一个目的是式(I)化合物：

(I)

其中：

R是-H；可能被一个或多个卤素基团、硝基、羟基、烷基和烷氧基取代的单环、双环或三环的芳基或杂芳基，其中所述烷基和烷氧基可能被一个或多个卤素基团取代；

n是0-3；

p是0-1；

X是-OH、-O-C₁-C₄烷基；

R1和R2，其可以相同或不同，选自-H；C₁-C₅烷基，-COX；

Q选自NH、O、S、-NHC(O)O-、-NHC(O)NH-、-NHC(O)S-、-OC(O)NH-、-NHC(S)O-、-NHC(S)NH-、-C(O)NH-；

且Y是O、S；

及其药学上可接受的盐、外消旋混合物、各对映异构体、立体异构体或几何异构体和互变异构体用于制备预防和治疗糖尿病，特别是2型糖尿病；糖尿病的微血管并发症如糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病和糖尿病性肾病；糖尿病的大血管并发症如动脉粥样硬化、外周血管病、心肌梗塞和中风；综合征X、多囊性卵巢综合征、肥胖、高脂血症、高胆固醇血症、高血压、和各种形式的胰岛素抵抗；脂肪肝，特别是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)和NASH(非酒精性脂肪肝炎)；和用于冠心病(CHD)的一级和二级预防，以及用于增加HDL-胆固醇水平的药物的用途。

本发明另一目的是含有一种或多种式(I)化合物作为活性成分以及至少一种药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。

                    发明详述

在式(I)化合物中，第一组优选化合物由下述化合物组成，其中R是芳基，可能被一个或多个卤素原子、烷基、烷氧基或卤代烷基优选甲基、甲氧基或三氟甲基、硝基、单-或二-烷基胺取代。

在该第一组的范围内，优选p是1，n是0、1或2，且Q是氧。

第二组优选化合物由下述化合物组成，其中R是杂芳基，优选含有氮作为杂原子，例如，吲哚和咔唑，经由所有容许的位置与分子的其余部分结合；这些之中特别优选1-吲哚基和1-咔唑基。

在该第二组的范围内，优选p是1，n是0、1或2，且Q是氧。

特别优选的是按照下面描述的一般方法及合成过程制备的下列化合物，它们只是举例说明，而不是对本发明应用性的限制：

i.2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2195)；

ii.2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2518)；

iii.2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1929)；

iv.2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2534)；

v.2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2531)；

vi.2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2365)；

vii.2-[4-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2387)；

viii.2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1983)；

ix.2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2394)；

x.2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2167)；

xi.2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2011)；

xii.2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2505)；

xiii.2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2653)；

xiv.2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2652)；

xv.2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2618)；

xvi.2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2622)；

xvii.2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2651)；

xviii.2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2609)；

xix.2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2036)；

xx.2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2577)；

xxi.2-[4-[2-(1-(5-苄氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2562)；

xxii.2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2501)；

xxiii.2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸(ST2733)；

xxiv.2-[4-[2-(1-(5-苄氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2740)；

xxv.2-甲基-2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]丙酸(ST2753)。

特别优选的是化合物ST2518和ST2195。

式(I)化合物是使用一般方法A-C描述的反应制备的。

                     一般合成方法

下列简图举例说明用于合成式(I)化合物的方法。

除非另有说明，各种符号的含义与通式(I)中给出的一致。方法A中描述的水解过程还可用于其它方法。

方法A

通式(I)化合物的制备是通过使通式II化合物与碱，优选无机碱，优选氢化钠反应，形成相应的阴离子，然后其与含离去基团，如氯、溴、碘、甲磺酰基、甲苯磺酰基和重氮基(在重氮基的情况下，代替无机碱使用二价乙酸铑二聚物作为催化剂)的通式III化合物，例如2-甲基-α-溴异丁酸酯在极性溶剂如乙腈、甲苯、或优选二甲基甲酰胺中，在10-50℃，优选25℃的温度下反应18-48小时进行的。由此获得的产物经过碱或酸水解，使用例如NaOH或例如HCl/乙酸混合物，温度为10-100℃，优选25℃，时间为1-72小时，优选3小时，得到相应的酸IA。

方法B

通式(I)化合物的制备是从通式IV的化合物开始进行的，其与通式V的醇在经典Mitsunobu反应条件下反应，如Synthesis 1981，1-28所述，其中使用无水和质子惰性溶剂如苯、甲苯、醚或优选四氢呋喃，时间为30分钟-72小时，优选48小时，温度为10-40℃，优选25℃。

方法C

W＝O，NH，S

K＝-NCS，-NCO，-OC(O)Cl，-COOH

Q≠N，O，S

用该方法制备的化合物是从溶于质子惰性溶剂，例如甲苯、醚、苯、优选四氢呋喃中的VI开始获得的，然后加入相关的异氰酸酯、异硫氰酸酯(thioisocyanate)或氯甲酸酯VII，可能在有催化或化学计量用量的无机或有机碱，优选三乙胺存在的条件下进行，并使其在10-40℃，优选25℃下反应6-72小时，优选48小时。在K＝COOH的情况下，使用与底物的比例为1∶3当量，优选1∶1.5当量的缩合剂如二乙基偶磷氰化物(diethylphosphorocyanidate)、EEDQ、DCC或CDI等，或通过酰基氯形成的过程，在有机溶剂如DMF、CH₃CN、CHCl₃、THF等中，在20-80℃，优选25℃的温度下，进行缩合反应18小时-3天，优选24小时。

下列实施例进一步举例说明本发明，然而并不排除其它：

实施例1

2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2195)的制备

中间产物2-(3-羟基-苯硫基)异丁酸甲酯的制备

方法A(步骤1)

产物是0℃下，从3-巯基苯酚(2.00g，15.9mmol)在40mL无水CH₃CN、NaH 80％(0.572g 19.1mmol)中开始制备的。5分钟后，向混悬液中加入甲基-2-溴异丁酸酯(2.88g，15.9mmol)。室温下，磁搅拌由此获得的反应混合物过夜。之后将混合物倒在H₂O中并用乙酸乙酯萃取。在无水硫酸钠上干燥有机相并蒸发至干。所得残余物通过使用CHCl₃/CH₃OH 98/2作为洗脱剂的硅胶色谱纯化。得到2.900g产物(产率：81％)；Mp(熔点)：41.5-42.5℃；TLC：硅胶，洗脱剂CHCl₃/CH₃OH98/2，Fr(前沿比)：0.23；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.19(t，1H)，7.00(d，1H)，6.95(brt，1H)，6.81(dd，1H)，3.69(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相CH₃CN/H₂O 50/50(v/v)，pH：按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间13.82分；KF：0.3％ H₂O；E.A.符合C₁₁H₁₄O₃S。

2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2195)的制备

方法B

产物是从将2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照上述制备的)(1.00g，4.42mmol)和4-氯苯乙醇(0.692g，4.42mmol)溶于15mL无水THF中，分小部分向其中加入DIAD(1.16g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)开始制备的，保持温度低于30℃。室温下磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 9/1作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到1.146g油状产物(产率：71％)；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 9/1，Fr＝0.28；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.25(m，6H)，7.00(m，1H)，6.90(d，1H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.08(t，2H)，1.55(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS3(5μm)4.6×250mm，T：30℃，流动相CH₃CN/H₂O 80/20(v/v)，pH：按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间19.34分；KF：1.7％H₂O；E.A.符合C₁₉H₂₁ClO₃S。

实施例2

2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2518)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2195(按照实施例1所述制备的)(0.150g，0.41mmol)于9mL甲醇中的溶液，并向其中加入4mL NaOH 1N开始制备的。室温下，磁搅拌由此获得的溶液48小时。之后，用水稀释溶液，用HCl 1N酸化并用AcOEt萃取水相。在无水Na₂SO₄上干燥有机相并过滤，真空蒸去溶剂。得到0.128g产物(产率：88％)；Mp：105-106℃；TLC：硅胶，洗脱剂CHCl₃/CH₃OH 9.4/0.6，Fr：0.42；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.45(m，5H)，7.10(m，2H)，6.80(dd，1H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱子：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×250mm，T：30℃，流动相：CH₃CN/乙酸铵10mM 35/65(v/v)，pH：按现状，流速：0.80mL/分，205nm UV检测器，保留时间4.66分；E.A.符合C₁₈H₁₉ClO₃S。

实施例3

2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1929)的制备

中间产物2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(ST 1923)的制备

标题产物是按照方法A(步骤1)中描述的过程，将4-巯基苯酚(0.500g，4.0mmol)溶于10mL无水CH₃CN中，并向其中加入NaH80％(0.144g，4.8mmol)开始制备的。将混合物冷却至0℃，5分钟后加入甲基-α-溴异丁酸酯(0.724g，4.0mmol)。室温下，磁搅拌反应2天。之后，将混合物倒入H₂O中并用乙酸乙酯萃取；用HCl 1N酸化水相并再次用乙酸乙酯萃取。将收集合并的有机相在Na₂SO₄上干燥、过滤并蒸发。通过使用CHCl₃作为洗脱剂的硅胶色谱纯化所得残余物。得到0.760g产物(产率：84％)；Mp：110-112℃；TLC：硅胶，洗脱剂CHCl₃，Fr：0.11；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.30(d，2H)，6.73(d，2H)，5.57(brm，1H)，3.70(s，3H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(5μm)4.6×250mm，T：30℃，流动相CH₃CN/H₂O 50/50(v/v)，pH：按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间10.14分；E.A.(元素分析)符合C₁₁H₁₄O₃S。

2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1929)的制备

标题产物是按照方法B中描述的过程，将2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照上面所述制备的)(0.800g，3.54mmol)和4-氯苯乙醇(0.554g，3.54mmol)溶于20mL无水THF中开始制备的。分小部分逐渐加入DEAD(0.801g，4.6mmol)和三苯膦(1.205g，4.6mmol)，维持温度低于30℃。室温下，磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/乙酸乙酯9/1作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到0.416g油状产物(产率：32％)；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/乙酸乙酯9/1，Fr：0.32；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.40-7.19(m，6H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.08(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(5μm)4.6×250mm，T：30℃，流动相CH₃CN/H₂O70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间：31.40分；KF：0.4％H₂O；E.A.符合C₁₉H₂₁ClO₃S。

实施例4

2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2534)的制备

标题产物是按照方法B中描述的过程，从2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例1所述制备的)(0.280g，1.24mmol)和DIAD(0.325g，1.61mmol)溶于3mL无水THF中并在0℃下滴加到2，4-二氯苯乙醇(0.260g，1.36mmol)和三苯膦(0.422g，1.61mmol)溶于4mL无水THF的溶液中开始制备的。室温下，磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 9.6/0.4作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到0.327g油状产物(产率：66％)；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 9/1，Fr：0.34；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.40(d，1H)，7.20(m，3H)，7.00(m，2H)，6.90(dd，1H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.20(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相CH₃CN/H₂O 90/10(v/v)，pH：按现状，流速：0.8mL/分，205nm UV检测器，保留时间：12.40分；KF：0.2％H₂O；E.A.符合C₁₉H₂₀Cl₂O₃S。

实施例5

2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2531)的制备

标题产物是按照方法B中描述的过程，自2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例3所述制备的)(0.280g，1.24mmol)和DIAD(0.325g，1.61mmol)溶于3mL无水THF中并在0℃下滴加到2，4-二氯苯乙醇(0.260g，1.36mmol)和三苯膦(0.422g，1.61mmol)溶于4mL无水THF的溶液中开始制备的。室温下，磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 9.6/0.4作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到0.346g产物(产率：70％)；Mp：73-74℃；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 9/1，Fr：0.26；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.35(m，3H)，7.22(m，2H)，6.83(d，2H)，4.18(t，2H)，3.65(s，3H)，3.20(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/H₂O 85/15(v/v)，pH：按现状，流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：12.58分；KF：0.4％H₂O；E.A.符合C₁₉H₂₀Cl₂O₃S。

实施例6

2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2365)的制备

标题产物是按照方法B中描述的过程，自2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例1所述制备的)(0.609g，2.7mmol)、9H-咔唑-9-乙醇(0.570g，2.7mmol)、DIAD(0.708g，3.5mmol)和三苯膦(0.917g，3.5mmol)分小部分逐渐加入到14mL无水THF中，并维持温度低于30℃开始制备的。室温下，磁搅拌反应18小时。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 9/1作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到0.510g产物(产率：45％)；Mp：101-103℃；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt8/2，Fr：0.38；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.15(m，2H)，7.08(t，1H)，7.00(d，1H)，6.90(s，1H)，6.80(m，1H)，4.75(t，2H)，4.35(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(5μm)4.6×150mm，T：室温，流动相CH₃CN/H₂O65/35(v/v)，pH：按现状，流速：0.80mL/分，205nm UV检测器，保留时间：11.45分；E.A.符合C₂₅H₂₅NO₃S。

实施例7

2-[4-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]异丁酸甲酯(ST2387)的制备

产物是按照方法B中描述的过程，自2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例3所述制备的)(0.609g，2.7mmol)、9H-咔唑-9-乙醇(0.570g，2.7mmol)、DIAD(0.708g，3.5mmol)和三苯膦(0.917g，3.5mmol)分小部分逐渐加入到14mL无水THF中，并维持温度低于30℃开始制备的。室温下，磁搅拌反应18小时。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 9/1作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到0.702g产物(产率：62％)；Mp：72-74℃；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 8/2，Fr：0.30；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.15(m，4H)，6.75(d，2H)，4.75(t，2H)，4.35(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(5μm)4.6×150mm，T：室温，流动相：CH₃CN/H₂O 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.80mL/分，205nm UV检测器，保留时间：11.60分；E.A.符合C₂₅H₂₅NO₃S。

实施例8

2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1983)的制备

中间产物1-(2-羟乙基)吲哚的制备

在J.Med.Chem.，1998，41/10，1619-1639中报道的中间产物是按照其中描述的过程制备的，区别在于反应持续时间(等于30小时代替30分钟)，自吲哚(5.0g，42.7mmol)、KOH(3.6g，64.1mmol)和溴乙醇(6.4g，51.3mmol)溶于50ml无水DMSO中的溶液开始，温度为25-30℃，得到5g油状产物(产率：73％)。

2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST1983)的制备

产物是按照方法B中描述的过程自2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例3所述制备的)(0.671g，2.97mmol)、1-(2-羟乙基)吲哚(0.478g，2.97mmol)、DEAD(0.672g，3.86mmol)和三苯膦(1.011g，3.86mmol)分小部分逐渐加入到15mL无水THF中，并维持温度低于30℃开始制备的。室温下，磁搅拌反应48小时。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/乙酸乙酯8/2作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。总共得到0.500g还不纯的产物，将其溶于乙酸乙酯中并用NaOH 1N溶液洗涤。干燥有机相并蒸发得到0.230g残余物，其通过硅胶色谱、用CHCl₃洗脱而被再次纯化。得到0.184g油状产物(产率：17％)；TLC：硅胶，洗脱剂己烷/乙酸乙酯8/2，Fr：0.29；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.62(d，1H)，7.40-7.10(m，6H)，6.78(d，2H)，6.50(d，1H)，4.50(m，2H)，4.24(m，2H)，3.61(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈，(3.5μm)4.6×75mm，T：室温，流动相CH₃CN/H₂O60/40(v/v)，pH：按现状，流速：0.90mL/分，205nm UV检测器，保留时间，10.70分；KF：1.7％H₂O；E.A.符合C₂₁H₂₃NO₃S。

实施例9

2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2394)的制备

标题产物是按照方法B中描述的过程，自甲基2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例1所述制备的)(1.00g，4.42mmol)和1-(2-羟乙基)吲哚(按照实施例8所述制备的)(0.711g，4.42mmol)溶于20mL无水THF中，并向其中分小部分逐渐加入DIAD(1.16g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)，维持温度低于30℃而开始制备的。室温下，磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 8/2作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到0.581g油状产物(产率：35％)；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 9/1，Fr：0.22；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.62(d，1H)，7.42(d，1H)，7.30-6.80(m，7H)，6.52(d，1H)，4.55(m，2H)，4.30(m，2H)，3.61(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Supelco-C₁₈(5μm)4.6×150mm，T：30℃，流动相：CH₃CN/H₂O70/30(v/v)，pH：按现状，流速：0.90mL/分，205nm UV检测器，保留时间：6.36分；E.A.符合C₂₁H₂₃NO₃S。

实施例10

2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2167)的制备

产物是按照方法B中描述的过程(区别在于用DIAD代替DEAD)从2-(3-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例1所述制备的)(1.110g，4.9mmol)、2-(2-萘基)乙醇(0.842g，4.9mmol)、DIAD(1.290g，6.37mmol)和三苯膦(1.670g，6.37mmol)溶于20mL无水THF中开始制备的。室温下，磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 7/3作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。通过将该产物溶于乙酸乙酯中并用Na₂CO₃溶液洗涤有机相而进一步纯化它。在硫酸钠上干燥有机相并真空蒸去溶剂。得到1.14g产物(产率：61.2％)；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 9/1，Fr：0.20；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.80(m，3H)，7.75(s，1H)，7.45(m，3H)，7.25(t，1H)，7.05(m，2H)，6.90(d，1H)，4.25(t，2H)，3.65(s，3H)，3.30(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/H₂O 80/20(v/v)，pH：按现状，流速：0.9mL/分，205nm UV检测器，保留时间：18.91分；KF：1.0％H₂O；E.A.符合C₂₃H₂₄O₃S。

实施例11

2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2011)的制备

产物是按照方法B中描述的过程，从2-(4-羟基苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例3所述制备的)(1.000g，4.42mmol)、2-(2-萘基)乙醇(0.760g、4.42mmol)、DEAD(1.000g、5.75mmol)和三苯膦(1.500g、5.75mmol)分小部分逐渐加入到30mL无水THF中，并维持温度低于30℃开始制备的。室温下，磁搅拌反应过夜。之后，蒸去溶剂并通过使用己烷/AcOEt 9/1作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物。得到1.262g产物(产率：75％)；Mp：56-57℃；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 9/1，Fr：0.23；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.85-7.70(m，4H)，7.45-7.28(m，5H)，6.83(d，2H)，4.27(t，2H)，3.65(s，3H)，3.26(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/H₂O 80/20(v/v)，pH：按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间：23.51分；KF：0.16％H₂O；E.A.符合C₂₃H₂₄O₃S。

实施例12

2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2505)的制备方法A(步骤2)

产物是从ST1929(按照实施例3所述制备的)(0.572g，1.57mmol)于36mL甲醇中的溶液，并向其中加入15.7mL NaOH 1N开始制备的。回流温度下，磁搅拌所得溶液过夜。之后，用HCl 1N酸化该溶液并用AcOEt萃取水相。将有机相在无水Na₂SO₄上干燥并过滤，真空蒸去溶剂。产物是通过硅胶柱色谱，使用己烷/AcOEt 7∶3洗脱而被纯化的。得到0.448g产物(产率：81.5％)；Mp：87-88℃；TLC：硅胶；洗脱剂：己烷/AcOEt 6/4，Fr：0.3；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.40(d，2H)，7.25(d，2H)，7.20(d，2H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry-C₁₈(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/乙酸铵10mM 45/55(v/v)，pH：按现状；流速：0.70mL/分，205nm UV检测器；保留时间：4.73分；E.A.符合C₁₈H₁₉ClO₃S。

实施例13

2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2653)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2534(按照实施例4所述制备的)(0.700g，1.75mmol)于11mL CH₃OH中的溶液，向其中加入21mL NaOH 1N开始制备的。40℃下，磁搅拌所得溶液2天。之后，真空蒸去CH₃OH并用HCl 1N酸化水相，用AcOEt萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并真空蒸去溶剂。得到0.486g产物(产率：72％)；Mp：86-88℃；TLC：硅胶，洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4，Fr：0.18；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.40(s，1H)，7.20(m，3H)，7.05(m，2H)，6.90(d，1H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30(v/v)，pH：约3(H₃PO₄)，流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：16.78分；E.A.符合C₁₈H₁₈Cl₂O₃S。

实施例14

2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2652)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2531(按照实施例5所述制备的)(0.130g，0.32mmol)于3mL四氢呋喃中的溶液，向其中加入3mL LiOH水溶液(0.040g，1.67mmol)开始制备的。室温下，磁搅拌所得混悬液过夜。之后，真空蒸去四氢呋喃，用HCl 1N酸化水相并用AcOEt萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并真空蒸去溶剂。用硅胶色谱柱纯化所得残余物，其中用CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4洗脱。得到0.044g产物(产率：36％)；TLC：硅胶，洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4，Fr：0.20；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.40(m，3H)，7.20(m，2H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.15(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 65/35(v/v)，pH：约3(H₃PO₄)，流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：27.20分；E.A.符合C₁₈H₁₈Cl₂O₃S。

实施例15

2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2618)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2365(按照实施例6所述制备的)(0.120g，0.286mmol)于3mL四氢呋喃中的溶液，向其中加入1mL LiOH水溶液(0.014g，0.5mmol)开始制备的。室温下，磁搅拌由此获得的混悬液过夜。之后，真空蒸去四氢呋喃，用HCl 1N酸化水相并在无水Na₂SO₄上萃取，过滤，真空蒸去溶剂。得到0.042g产物(产率：36％)；TLC：硅胶；洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4，Fr：0.24；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.10-7.00(m，5H)，6.80(d，1H)，4.70(t，2H)，4.30(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30(v/v)，pH：按现状；流速：1mL/分，205nm UV检测器；保留时间：11.92分；E.A.符合C₂₄H₂₃NO₃S。

实施例16

2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2622)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST1983(按照实施例8所述制备的)(1g，2.71mmol)于15mL CH₃OH中的溶液，向其中加入30mL NaOH 1N开始制备的。40℃下，磁搅拌所得溶液48小时。之后，真空蒸去CH₃OH，用HCl 1N酸化水相并用AcOEt萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并真空蒸去溶剂。用硅胶色谱柱纯化所得残余物，其中用CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4洗脱。得到0.679g产物(产率：70％)；TLC：硅胶，洗脱剂CHCl₃/CH₃OH9.6/0.4，Fr：0.27；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.60(d，1H)，7.40(d，3H)，7.20(m，3H)，6.80(d，2H)，6.50(d，1H)，4.50(t，2H)，4.25(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisili ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30(v/v)，pH：按现状；流速：1mL/分，205nm UV检测器；保留时间：8.30分；E.A.符合C₂₀H₂₁NO₃S。

实施例17

2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2651)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2394(按照实施例9所述制备的)(0.140g，0.38mmol)于3mL四氢呋喃中的溶液，向其中加入2mL LiOH水溶液(0.040g，1.67mmol)开始制备的。室温下，磁搅拌所得混悬液过夜。之后，真空蒸去四氢呋喃，用HCl 1N酸化水相并用AcOEt萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并真空蒸去溶剂。用硅胶色谱柱纯化所得残余物，其中用CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4洗脱。得到0.086g产物(产率：63％)；TLC：硅胶；洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9.6/0.4，Fr：0.19；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.60(d，1H)，7.40(d，1H)，7.20-7.00(m，6H)，6.80(d，1H)，6.50(d，1H)，4.50(t，2H)，4.20(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温；流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 65/35(v/v)，pH：按现状；流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：8.77分；E.A.符合C₂₀H₂₁NO₃S。

实施例18

2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2609)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2167(按照实施例10所述制备的)(0.270g，0.71mmol)于18mL CH₃OH中的溶液，向其中加入15mL NaOH 2N开始制备的。回流温度下，磁搅拌所得溶液48小时。之后，冷却反应混合物，用HCl1N酸化并用AcOEt萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并真空蒸去溶剂。使用硅胶色谱柱纯化所得残余物，其中用己烷/AcOEt 7/3洗脱。得到0.030g产物(产率：14％)；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 6/4，Fr：0.24；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.80(m，3H)，7.70(s，1H)，7.40(m，3H)，7.20(m，1H)，7.10(s，2H)，6.90(d，1H)，4.20(t，2H)，3.20(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30(v/v)，pH：按现状，流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：11.77分；E.A.符合C₂₂H₂₂O₃S。

实施例19

2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2036)的制备

方法A(步骤2)

产物是从ST2011(按照实施例11所述制备的)(0.498g；1.29mmol)于30mL CH₃OH中的溶液，向其中加入12.9mL di NaOH 1N开始制备的。回流温度下，磁搅拌所得溶液过夜。之后，冷却反应混合物，用HCl 1N酸化并用AcOEt萃取。在无水Na₂SO₄上干燥有机相、过滤并真空蒸去溶剂。得到0.450g产物(产率：95％)；Mp：103-104℃；TLC：硅胶，洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9.8/0.2，Fr：0.13；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：7.80(m，3H)，7.70(s，1H)，7.40(m，5H)，6.80(d，2H)，4.20(t，2H)，3.20(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T：室温，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 75/25(v/v)，pH：按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间：13.10分；E.A.符合C₂₂H₂₂O₃S。

实施例20

2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2577)的制备

方法B

向ST1923(按照实施例3所述制备的)(0.2g，0.88mmol)的无水THF(6mL)溶液中分小部分加入2-(5-甲氧基-吲哚-1-基)-乙醇(按照实施例8所述，自5-甲氧基吲哚和2-溴-乙醇开始制备的)(0.185g，0.97mmol)、DIAD(0.230g，1.14mmol)和三苯膦(0.299g，1.14mmol)。室温下，磁搅拌反应混合物过夜，然后真空除去溶剂并将残余物溶于AcOEt中，用NaOH 1N洗涤。在Na₂SO₄上干燥有机相、过滤并蒸发。通过使用己烷/AcOEt 87/13作为洗脱剂的硅胶色谱纯化所得残余物，得到0.180g终产物(产率：51％)。TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 7/3，Fr：0.39；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：7.30(m，3H)，7.15(d，1H)，7.10(d，1H)，6.90(dd，1H)，6.78(d，2H)，6.40(d，1H)，4.50(t，2H)，4.25(t，2H)，3.85(s，3H)，3.65(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相：CH₃CN/H₂O 85/15v/v，pH按现状，流速：0.75mL/分，205nm UV检测器，保留时间：7.80分；A.E.：符合C₂₂H₂₅NO₄S预期值。

实施例21

2-[4-[2-(1-(5-苄氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2562)的制备

方法B

向ST1923(按照实施例3所述制备的)(0.2g，0.88mmol)的无水THF(6mL)溶液中分小部分加入2-(5-苄氧基-吲哚-1-基)乙醇(按照实施例8所述，自5-苄氧基吲哚和2-溴-乙醇开始制备的)(0.26g，0.97mmol)、DIAD(0.230g，1.14mmol)和三苯膦(0.299g，1.14mmol)。室温下，磁搅拌反应混合物过夜，然后真空除去溶剂，并将残余物溶于AcOEt中，用NaOH 1N洗涤。在Na₂SO₄上干燥有机层，过滤并真空蒸发。通过使用己烷/AcOEt 85/15作为洗脱剂的硅胶色谱纯化所得残余物，得到0.240g终产物(产率57％)。MP：87-88℃；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 7/3，Fr：0.41；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.45-7.2(m，10H)，7.00(dd，1H)，6.80(d，2H)，6.40(d，1H)，5.10(s，2H)，4.50(t，2H)，4.25(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相：CH₃CN/H₂O90/10v/v，pH：按现状，流速：0.80mL/分，205nm UV检测器，保留时间：8.21分；A.E.：符合C₂₈H₂₉NO₄S预期值。

实施例22

2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]异丁酸甲酯(ST2501)的制备

方法B

向2-(3-羟基-苯硫基)异丁酸甲酯(按照实施例1所述制备的)(1.02g，4.5mmol)的无水THF(23mL)溶液中分小部分加入5-硝基糠醇(0.986g，4.5mmol)、DIAD(1.18g，5.85mmol)和三苯膦(1.53g，5.85mmol)。室温下磁搅拌反应混合物过夜，然后真空除去溶剂并将残余物溶于AcOEt中，用NaOH 1N洗涤。在Na₂SO₄上干燥有机层，过滤并真空除去。通过使用己烷/AcOEt 9.4/0.6作为洗脱剂的硅胶色谱纯化所得残余物，得到0.380g终产物(产率：20％)。MP：81-82℃；TLC：硅胶，洗脱剂：己烷/AcOEt 7/3，Fr 0.45；¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：8.22(d，2H)，7.80(d，2H)，7.22(m，2H)，7.10-7.00(m，3H)，6.80(d，1H)，6.60(d，1H)，5.10(s，2H)，370(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC：柱：Symmetry C₁₈(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相：CH₃CN/H₂O 85/15v/v，pH按现状，流速：0.85mL/分，205nm UV检测器，保留时间：6.24分；A.E.：符合C₂₂H₂₁NO₆S预期值。

实施例23

2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]异丁酸(ST2733)的制备

方法A(步骤2)

向ST2577(按照实施例20所述制备的)(0.2g，0.50mmol)的CH₃OH(3.2mL)溶液中加入NaOH 1N溶液(6mL)。40℃下，磁搅拌反应混合物过夜，然后真空除去有机相，用AcOEt萃取水相。分离水相并用HCl 1N酸化，然后再次用AcOEt萃取。用水洗涤该第二有机萃取物，在Na₂SO₄上干燥，过滤并真空蒸发，得到0.138g终产物(产率72％)。MP：100-102℃；TLC：硅胶，洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 8/2，Fr：0.62；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ：7.40(d，2H)，7.25(s，1H)，7.10(d，2H)，6.90(d，1H)，6.78(d，2H)，6.40(d，1H)，4.50(t，2H)，4.20(t，2H)，3.80(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30，pH按现状，流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：7.32分，A.E.：符合C₂₁H₂₃NO₄S预期值。

实施例24

2-[4-[2-(1-(5-苄氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2740)的制备

方法A(步骤2)

向ST2562(按照实施例21所述制备的)(0.430g，0.90mmol)的CH₃OH(10mL)溶液中加入NaOH 1N溶液(15mL)。40℃下磁搅拌反应混合物48小时，然后真空除去有机相并用AcOEt萃取含水残余物。分离水相并用HCl 1N酸化，然后再次用AcOEt萃取。用水洗涤该第二有机萃取物，在Na₂SO₄上干燥并真空蒸发，得到0.310g终产物(产率74％)。MP：160-162℃；TLC：硅胶，洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9/1，Fr.：0.57；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ：7.40-7.15(m，10H)，7.20(s，2H)，7.00(d，1H)，6.90(d，2H)，6.40(s，1H)，5.15(s，2H)，4.50(t，2H)，4.20(t，2H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30，pH按现状，流速1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：11.60分；A.E.符合C₂₇H₂₇NO₄S预期值。

实施例25

2-甲基-2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]丙酸(ST2753)的制备

方法A(步骤2)

向ST2501(按照实施例22所述制备的)(0.4g，0.93mmol)的CH₃OH(10mL)溶液中加入NaOH 1N溶液(25mL)。40℃下磁搅拌反应混合物4天，然后真空除去有机相并用AcOEt萃取含水残余物。分离水相并用HCl 1N酸化，然后再次用AcOEt萃取。用水洗涤该第二有机萃取物，在Na₂SO₄上干燥并真空蒸发。通过硅胶色谱纯化残余物，其中用CHCl₃/CH₃OH 9.4/0.6洗脱，得到0.215g终产物(产率56％)。MP：137-138℃；TLC：硅胶，洗脱剂：CHCl₃/CH₃OH 9/1，Fr 0.53；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：8.30(d，2H)，8.00(d，2H)，7.40(m，2H)，7.10(d，3H)，6.80(s，1H)，4.20(s，2H)，1.40(s，6H)；HPLC：柱：Inertisil ODS3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流动相：CH₃CN/KH₂PO₄ 50mM 70/30，pH按现状，流速：1mL/分，205nm UV检测器，保留时间：11.38分；A.E.：符合C₂₁H₁₉NO₆S预期值。

实施例26

db/db小鼠中的抗糖尿病和降低血清脂质的活性

实验动物的突变使得可能开发出呈现伴有肥胖、高脂血症和胰岛素抵抗的非胰岛素依赖型糖尿病的模型，并且该模型能使我们测试新的抗糖尿病化合物的效力(Reed和Scribner，Diabetes，obesity andmetabolism 1：75-86，1999)。

广泛使用的遗传性糖尿病小鼠模型是C57BL/KsJ db/db小鼠。

此模型的遗传基础是苗条蛋白受体基因缺陷(db/db小鼠)，导致苗条蛋白抗性和引起饮食过多、肥胖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗，随后产生胰岛素分泌不足和高血糖症状(Kodama等，Diabetologia37：739-744，1994；Zhang等，Nature 372：425-432，1994；Chen等，Cell 84：491-495，1996)。

由于高血糖伴有肥胖和胰岛素抵抗，db/db小鼠具有类似人类2型糖尿病的特征，可用于测定胰岛素敏化化合物。

实验所用C57BL/KsJ db/db小鼠由Jackson Lab(经由Ch.River)提供。在标准条件(22±2℃，55±15％湿度；换气15-20/小时；12小时光-暗循环，光照从上午7.00到下午7.00)下，给予标准4RF21饮食(Mucedola)，适应环境10天后，在吸收后状态下(从上午8.30到下午4.30禁食)，借助于Jelco 22G导管(Johnson and Johnson)从尾静脉取血样。监测葡萄糖、胰岛素、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸和尿素的血浆水平以确保处理组中小鼠的良好匹配分布。

处理开始时，检查小鼠体重，进行监测水和食物消耗的准备。

使用本发明的化合物每天两次(8.30a.m.和6.30p.m.)口服处理小鼠25天(实验I)或12天(实验II)，使用罗格列酮、苯扎贝特和非诺贝特(实验I)或实施例1中的化合物(实验II)作为参照化合物。

以10ml/kg载体(含0.5％吐温80去离子水溶液的1％CMC)中含25mg/kg本发明实施例1化合物ST2195的相当剂量给予所述化合物。具体而言，以5mg/kg的剂量给予罗格列酮(Lohray等，J.Med Chem41，1619-1630，1998)，苯扎贝特为24.8mg/kg和非诺贝特为24.7mg/kg。

在实验过程中，监测血清葡萄糖水平、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果、多种脂质状态参数和体重增加。

本发明化合物证实能够降低进食(表1)、吸收后(表2、2a、5和5a)以及禁食状况(表3和3a)的血清葡萄糖水平。

它们还证实能够改善葡萄糖耐量(表4和4a)并减少果糖胺，其是蛋白糖基化的一个指标(表5)，如上所述，蛋白糖基化在糖尿病的微-和大-血管并发症的发生中起重要作用。

本发明的化合物还显示出良好的降低血清甘油三酯水平的能力，与罗格列酮和非诺贝特类似(表6和6a)。

此外，与罗格列酮不同，本发明的化合物可增加HDL-胆固醇水平(表6和6a)并且其所致的体重增加比由罗格列酮引起的要低，且与贝特类诱导的接近(表7和7a)。

HDL-胆固醇值的增加构成PPARα激动作用和动脉粥样硬化危险降低的指示。事实上，PPARα激动作用增加组织中的脂肪酸氧化，减少胞内甘油三酯的积聚，而胞内甘油三酯会促进胰岛素抵抗(Virkamki等，Diabetes 50，2337-2343，2001；Mensink等，Diabetes 50，2545-2554，2001；Kelley和Goodpaster，Diabetes Care 24，933-941，2001)。

                         表1(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理12天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。在最后一次处理后大约15小时，采集进食状态下的样品。

         平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  对照  487±25  罗格列酮  5.0  365±64  -25  苯扎贝特  24.8  503±21  +3  非诺贝特  24.7  466±8  -4  实施例1  25.0  303±16▲  -38

每组动物数：6只。

Student’s t检验：▲表示与对照相比P＜0.001。

                      表2(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理12天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。

采集吸收后状态(从9a.m.-5p.m.禁食)和最后一次处理后8小时的样品。

       平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  对照  414±11  罗格列酮  5.0  314±33□  -24  苯扎贝特  24.8  421±30  +2  非诺贝特  24.7  409±11  -1  实施例1  25.0  216±16▲  -48

每组动物数：6只。

Student’s t检验：□和▲分别表示与对照相比P＜0.05和P＜0.001。

                 表2a(实验II)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物和实施例2的化合物(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)，处理9天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。

采集吸收后状态(从9a.m.-5p.m.禁食)和最后一次处理后8小时的样品。

         平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  对照  351±23 实施例1  25.0  223±20△  -36 实施例2  24.0  155±21▲  -66

每组动物数：6只。

Student’s t检验：△和▲分别表示与对照相比P＜0.01和P＜0.001。

                   表3(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理18天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。

采集禁食18小时和最后一次处理后6小时的样品。

         平均值+S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  对照  344±35  罗格列酮  5.0  225±27■  -35  苯扎贝特  24.8  298±21  -13  非诺贝特  24.7  384±20  +12  实施例1  25.0  144±3△  -58

每组动物数：6只。

Student’s t检验：■和△分别表示与对照相比P＜0.02和P＜0.01。

                    表3a(实验II)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物和实施例2的化合物(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)，处理11天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。

采集禁食18小时和最后一次处理后5小时的样品。

      平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  对照  248±18  实施例1  25.0  158±7▲  -36  实施例2  24.0  128±8▲  -48

每组动物数：6只。

Student’s t检验：▲表示与对照相比P＜0.001。

                   表4(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理18天后，小鼠血液中OGTT葡萄糖的曲线下面积(AUC)。

禁食18小时和最后一次处理后5小时的小鼠OGTT(葡萄糖3g/kg)。

       平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  AUC葡萄糖  a.u.  变化  ％  对照  51182±2392  罗格列酮  5.0  38174±3555△  -25  苯扎贝特  24.8  44476±1827  -13  非诺贝特  24.7  45192±1546  -12  实施例1  25.0  24527±889▲  -52

每组动物数：6只。

Student’s t检验：△和▲分别表示与对照相比P＜0.01和P＜0.001。

                  表4a(实验II)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1和实施例2的化合物(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)，处理11天后，小鼠血液中OGTT葡萄糖的曲线下面积(AUC)。

禁食18小时和最后一次处理后5小时的小鼠OGTT(葡萄糖3g/kg)。

         平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  AUC葡萄糖  a.u.  变化  ％  对照  43208±2117  实施例1  25.0  25929±1299▲  -40  实施例2  24.0  24517±2261▲  -43

每组动物数：6只。

Student’s t检验：▲表示与对照相比P＜0.001。

                      表5(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理25天后，小鼠的血浆葡萄糖和果糖胺的水平。

采集吸收后状态(从9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次处理后7.5小时的样品。

            平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  果糖胺  mM  变化  ％  对照  456±45  0.80±0-03  罗格列酮  5.0  296±39■  -35  0.52±0.12  -35  苯扎贝特  24.8  536±22  +18  1.01±0.04△  +26  非诺贝特  24.7  553±30  +21  0.92±0.02△  +15  实施例1  25.0  206±8△  -55  0.41±0.04▲  -49

每组动物数：6只。

Student’s t检验：■、△和σ分别表示与对照相比P＜0.02、P＜0.01和P＜0.001。

                  表5a(实验II)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1和实施例2的化合物(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)，处理12天后，小鼠的血浆葡萄糖水平。

采集吸收后状态(从9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次处理后7.5小时的样品。

        平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  葡萄糖  mg/dl  变化  ％  对照  576±27  实施例1  25.0  356±30▲  -38  实施例2  24.0  263±30▲  -54

每组动物数：6只。

Student’s t检验：▲表示与对照相比P＜0.001。

                    表6(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理25天后，小鼠的血浆甘油三酯和HDL-胆固醇的水平。

采集吸收后状态(从9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次处理后7.5小时的样品。

                   平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  甘油三酯  mg/dl  变化  ％  HDL-胆固醇  mg/dl  变化  ％  对照  95.4±7.2  82.0±6.1  罗格列酮  5.0  43.7±4.1▲  -54  65.4±3.6□  -20  苯扎贝特  24.8  88.3±12.7  -7  93.8±3.8  +14  非诺贝特  24.7  66.5±3.5△  -30  96.4±4.2  +18  实施例1  25.0  45.3±2.3▲  -53  98.0±3.5□  +20

每组动物数：6只。

Student’s t检验：□、△和σ分别表示与对照相比P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001。

                   表6a(实验II)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1和实施例2的化合物(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)，处理12天后，小鼠的血浆甘油三酯和HDL-胆固醇水平。

采集吸收后状态(从9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次处理后7.5小时的样品。

            平均值+S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  甘油三酯  mg/dl  变化  ％  HDL-胆固醇  mg/dl  变化  ％  对照  87.0±3.1  86.4±2.3  实施例1  25.0  45.1±1.4▲  -48  L23.7±1.9▲  +43  实施例2  24.0  48.6±2.5▲  -44  102.5±4.7△  +19

每组动物数：6只。

Student’s t检验：△和▲分别表示与对照相比P＜0.01和P＜0.001。

                      表7(实验I)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1的化合物、贝特类(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)和罗格列酮(5mg/kg)，处理25天后，小鼠最初和最终的体重。

吸收后状态(从9a.m.-4.30p.m.禁食)的测量值。

                平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

   化合物   剂量  mg/kg   最初的体重  g   变化  ％   最终的体重  g   变化  ％  对照  31.7±0.9  28.3±0.8  罗格列酮  5.0  32.6±1.4  +3  42.1±2.5△  +49  苯扎贝特  24.8  33.7±0.7  +6  35.2±1.3▲  +24  非诺贝特  24.7  33.3±0.7  +5  34.5±1.0▲  +22  实施例1  25.0  32.3±0.3  +2  35.9±0.6▲  +27

每组动物数：6只。

Student’s t检验：△和σ分别表示与对照相比P＜0.01和P＜0.001。

                   表7a(实验II)

每天两次口服给予db/db小鼠实施例1和实施例2的化合物(剂量相当于25mg/kg实施例1的化合物)，处理12天后，小鼠最初和最终的体重。

吸收后状态(从9a.m.-4.30p.m.禁食)的测量值。

                  平均值±S.E.和与对照相比的变化(％)

  化合物  剂量  mg/kg  最初的体重  g  变化  ％  最终的体重  g  变化  ％  对照  38.8±0.7  37.5±0.6  实施例1  25.0  38.6±0.4  -1  40.3±0.8□  +7  实施例2  24.0  37.8±0.5  -3  39.4±0.9  +5

每组动物数：6只。

Student’s t检验：□表示与对照相比P＜0.05。

实施例27

瞬时转染真核细胞以评价PPARα配体的激动剂活性

在该实施例中，证实本发明的化合物也具有PPARα激动剂活性。

PPARα激动剂的鉴定是通过基于细胞生物学技术的体外筛选进行的。

真核细胞的反式激活测定法可定量评价假设配体帮助转录因子与其特有的在启动子内的反应元件相互作用的能力[Sladek R.等，Nuclear Receptors：A Practical Approach，Oxford Presspp.63-68(1999)]。

因为过氧化物酶体增殖物激活性受体α(PPARα)发挥其转录调节功能，因此它与9-顺式-视黄酸受体(RXR)的二聚是必需的。所形成的二聚物能够结合位于靶基因启动子中的过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)，仅在因两个受体中至少一个的配体存在而被激活时[BergerJ.和Moller D.E.，Annu.Rev.Med.53，409-35(2002)]。

反式激活测定法因此要求在预选细胞系中同时存在下列：

a)足量PPARα；

b)足量9顺式-视黄酸受体(RXR)；

c)包含受位于病毒异源启动子上游的PPRE控制的报道基因的嵌合质粒。在我们的实例中，报道基因是氯霉素-乙酰基转移酶(CAT)。

每当PPARα和RXR的内源水平不足时，可通过含所涉及受体基因的表达载体转染而从外部补充[Kersten S.和Wahli W.NuclearReceptors：A Practical Approach，Oxford Press 74-76页(1999)]。

质粒pCH110包含β-半乳糖苷酶基因且与受体基因CAT一起共-转染，为转染效率和结果的标准化提供内部对照。

然而，使用该转染和报道基因系统，不能完全消除由所用细胞系组成型表达的内源受体导致的干扰。

因此使用选择性方法，其能使我们避开可能的内源受体导致的干扰问题。

在该模型中，使用反式激活测定法，其中表达载体mPPARαLBD/Ga14DBD容许转染细胞合成嵌合蛋白，其中PPARα的配体结合域(LBD)与酵母转录因子GAL4的DNA结合域(DBD)融合[Luckow B.等，Nucleic Acids Res.15，5490(1987)]。同时，质粒(pG5CAT)被转染，其包含5个拷贝的GAL4高亲和性结合位点(也称作UAS，上游激活序列)，在与CAT报道基因融合的病毒启动子Elb的上游[Moya-Camarena S.Y.等，J.Lipid Res.40(8)，1426-33(1999)]。该模型消除了由可能的内源受体所致的干扰。

这是由于Elb的激活和CAT的产生将仅仅由于GAL4DBD与其特有的反应元件(UAS)的相互作用而发生。因为转录因子GAL4不在真核细胞中表达，因此报道基因的反式激活仅当由于配体与PPARα的LBD相互作用，嵌合蛋白PPARα/GAL4识别质粒pG5CAT上的UAS序列时才能发生。连同表达载体和报道载体，还用质粒pCH110转染细胞，其提供转染效率和结果标准化的内部对照。

实验过程

使用猴肾成纤维细胞系(COS-7)[Elbrecht A.等，J.Biol.Chem.274(12)，7913-22(1999)]。用报道载体、编码融合蛋白Ga14DBD/PPARαLBD的表达质粒和对照载体pCH110共转染该细胞。使细胞与浓度逐渐增加的研究化合物接触并评价CAT活性。使用未处理过的细胞作为对照。

细胞培养

按照通常的细胞培养技术培养猴肾成纤维细胞(COS-7)，37℃，5％v/v二氧化碳气氛，使用3.7g/l碳酸氢钠、4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1mM丙酮酸钠和10％v/v胎牛血清修饰的DMEM(Dulbecco′s修饰的Eagle′s培养基)作为生长培养基，在有链霉素100μg/ml和青霉素100U/ml(终浓度)存在的条件下。

COS-7细胞的瞬时转染

使用由能够复合DNA并把它转运到细胞中的脂类的限定混合物组成的转染试剂FuGENE6(Roche)将细胞共-转染。转染之前24小时，以1.2×10⁵个细胞/孔的密度将细胞平板接种在12-孔平板中并在37℃、5％v/v CO₂气氛下维持。转染之前2小时，更换没有血清的培养基，然后按照供应商建议的说明用转染试剂FuGENE6处理细胞。简单地说，在没有血清的培养基存在的条件下，将含有0.8μg表达载体、1.6μg报道载体、0.8μg对照载体和9μl FuGENE6试剂/孔的转染混合物直接加入到细胞中。5小时后，在有或没有3种不同浓度(2、20和100μM)待测分子存在的条件下，用1ml含血清和抗生素的完全培养基更换转染培养基。Wy-14，643(2μM)，一种已知的PPARα配体，用作阳性参照化合物。

细胞蛋白提取物的制备和CAT活性的测定

在37℃、5％v/v CO₂气氛中培养48小时后，用1ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤该细胞2次并从孔中通过机械方法取出移入TEN缓冲液(三[羟甲基]氨基甲烷10mM pH8，乙二胺-四乙酸1mM pH8、氯化钠0.1M)中。1000rpm离心3分钟后，将细胞重悬于65μl溶胞缓冲液(Tris-HCl0.25M，pH8)中，然后经过3次快速的冻-融循环进行溶胞。4℃、15,000rpm离心15分钟除去不溶性细胞物质(碎片)，回收上清液并用于CAT和β-半乳糖苷酶活性测定。

将细胞提取物在-80℃贮存，直到在75μl终体积中加入甘油(终浓度10％v/v)和β-巯基乙醇(终浓度5mM)后进行测定。

评价CAT活性的测定法是通过运用Sleigh描述的方法[Sleigh M.J.Annal Biochem.，156(1)，251-6(1986)]的变体进行的。简单地说，将20μl蛋白细胞提取物(预热至65℃达10分钟，从而使内部脱乙酰酶活性灭活)加入到含10μl正丁酰基-辅酶A(3.5mg/ml)，5μl[¹⁴C]-氯霉素(0.25μCi)和65μl蒸馏H₂O的溶液中。37℃培养2小时后，用200μl二甲苯/2，6，10，14-四甲基-十五烷(1∶2v/v)的溶液阻断反应。

剧烈搅拌并以最大速度离心5分钟后，将150μl上清液加入到5ml闪烁液中，在β-计数器(闪烁器)下分析，确定酶促反应形成的[¹⁴C]丁酰基-氯霉素含量。

测定β-半乳糖苷酶活性的试验

作为相对于转染效率CAT活性标准化的内部对照，使用由共-转染质粒pCH110中相应基因编码的β-半乳糖苷酶活性。

β-半乳糖苷酶活性是按照Sambrook描述的方法[Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press编(1989)]的变体测量的。简单地说，将20μl蛋白提取物加入到750μl含1体积的2mg/ml ONPG(O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)和3体积的“Z缓冲液”(10mM氯化钾、1mM氯化镁、50mMβ-巯基乙醇的磷酸盐缓冲液)的反应缓冲液中。37℃下进行反应并在典型的黄色外观清晰可见时，通过加入200μl碳酸钠1M溶液中断反应。室温培养样品10分钟，然后通过在分光光度计下测量420nm波长处的吸光度(A₄₂₀)而分析。

下列公式用于CAT测定结果相对于β-半乳糖苷酶活性的标准化：

CAT样品计数/分钟(cpm)-空白计数/分钟(cpm)

             β-半乳糖苷酶单位^*

β-半乳糖苷酶单位^*＝A₄₂₀×稀释倍数/培养时间(分钟)

表8举例给出实施例1、2、4、10、13和18中化合物的PPARα激动剂活性。

                      表8

mPPARαLBD/Ga14DBD在COS-7细胞中介导的反式激活测定。结果以报道基因CAT的激活百分比表示，通常把在有参照化合物(WY-14，643 2μM)存在的条件下测量的值假定为100％。

  化合物                浓度   2μM   20μM   100μM  实施例1  44.9％  129.9％  232.1％  实施例2  69.7％  103.6％  280.9％  实施例4  113.1％  284.9％  421％  实施例13  132.3％  199.3％  203.8％  实施例10  98.1％  360％  462.7％  实施例18  85％  96.4％  151.9％

实施例28

瞬时转染真核细胞以评价PPARγ配体的激动剂活性

在该实施例中，证实本发明的多种化合物也具有PPARγ激动剂活性。

PPARγ激动剂的鉴定是通过真核细胞中的特异性反式激活测定法进行的。

因为过氧化物酶体增殖物激活性受体γ(PPARγ)发挥其转录调节功能，因此它与9-顺式-视黄酸受体(RXR)的二聚是必需的。所形成的二聚物能够结合位于靶基因启动子中的过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)，仅在因两个受体中至少一个的配体存在而被激活时[Berger J.和Moller D.E.，Annu.Rev.Med.53，409-35(2002)]。

对PPARγ特异性的反式激活测定法因此要求在预选细胞系中同时存在下列：

a)足量PPARγ；

b)足量9顺式-视黄酸受体(RXR)；

c)包含受位于病毒异源启动子上游的PPRE控制的报道基因的嵌合质粒。在我们的实例中，报道基因是氯霉素-乙酰基转移酶(CAT)。

在所用反式激活测定法中，用表达载体pSG5 Stop-mPPARg1转染预选细胞，其容许转染细胞合成PPARγ受体。同时，转染报道质粒(pBLCAT2-PPRE)，其包含由酰基-CoA氧化酶的基因启动子分离的过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)，在与报道基因CAT融合的病毒胸苷激酶(TK)的异源启动子的上游。因为RXR受体的内源细胞水平足够高，无需转染RXR特异性表达载体。编码CAT的基因的表达受TK启动子的控制，其不合任何PPRE。因此，CAT水平的任何增加将是由于基因转录的增加，其依赖于PPARγ与RXR的二聚和与过氧化物酶体增殖物反应元件形成的异二聚物键。连同表达载体和报道载体，还用质粒pCH110转染细胞，其提供转染效率和结果标准化的内部对照。

实验过程

使用小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3)[Hogan J.C.等，BiochemBiophys Res Commun.287(2)，484-92(2001)]。用报道质粒、编码PPARγ受体的表达质粒和对照载体pCH110转染该细胞。使细胞与浓度逐渐增加的试验化合物接触并评价CAT活性。使用未处理过的细胞作为对照。

细胞培养

按照通常的细胞培养技术培养小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)，37℃，5％v/v二氧化碳气氛，使用3.7g/l碳酸氢钠、4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1mM丙酮酸钠和10％v/v小牛血清修饰的DMEM(Dulbeceo′s修饰的Eagle′s培养基)作为生长培养基，在有链霉素100μg/ml和青霉素100U/ml(终浓度)存在的条件下。

NIH-3T3细胞的瞬时转染

使用已在先前实施例中描述过的转染试剂FuGENE6(Roche)对细胞进行共转染。转染之前24小时，以8.0×10⁴个细胞/孔的密度将细胞平板接种在12-孔平板中并在37℃、5％v/v CO₂气氛下维持。转染之前2小时，更换没有血清的培养基，然后按照先前实施例所述用转染试剂FuGENE6处理细胞。5小时后，在有或没有3种不同浓度(2、20和100μM)待测分子存在的条件下，用1ml含血清和抗生素的完全培养基更换转染培养基。罗格列酮，一种已知的PPARγ配体，用作阳性参照化合物。

细胞蛋白提取物的制备和CAT活性的测定

完全按先前实施例所述制备细胞蛋白提取物并进行CAT活性测定。

测定β-半乳糖苷酶活性的试验

作为CAT活性相对于转染效率标准化的内部对照，使用由共-转染质粒pCH110中相应基因编码的β-半乳糖苷酶活性。

完全按照先前实施例所述测量β-半乳糖苷酶活性。

为了使CAT测定结果相对于β-半乳糖苷酶活性标准化，使用先前

实施例中描述的公式。

表9举例给出多种化合物的PPARγ激动剂活性。

                       表9

PPARγ在NIH-3T3细胞中介导的反式激活测定。

结果以报道基因CAT的激活百分比表示，通常把有参照化合物(罗格列酮，2μM)存在条件下的测量值假定为100％。

  化合物                浓度  2μM  20μM  100μM  实施例2  28.6％  61.2％  114.3％  实施例13  61.6％  91.6％  101％  实施例18  25％  67％  82.2％

在表1-7a中给出的所得结果表明本发明的化合物是用于治疗糖尿病和高脂血症、用于增加HDL-胆固醇水平、和用于预防和治疗与糖尿病和胰岛素抵抗有关的并发症、用于CHD的一级和二级预防的有效药剂，且可用于脂肪肝的治疗。

本发明的目的是药物组合物，它含有作为其活性成分的至少一种式(I)化合物，单独或与一种或多种式(I)化合物联合，或者所述一种或多种式(I)化合物与用于治疗本发明所述疾病的其它活性成分，例如具有降低血清葡萄糖和血清脂质活性的其他产品联合；为分开的剂量形式或适于联合疗法的形式。本发明活性成分将是与药剂学常规使用的适宜载体和/或赋形剂(如最新版的“Remington’sPharmaceutical Sciences Handbook”中所述的那些)的混合物。本发明组合物含治疗有效量的活性成分。剂量由本部门专家例如临床医生或初级保健护理医生根据待治疗的疾病类型和患者的状况确定，或伴随服用其他活性成分。例如可给予0.01-400mg/天，优选0.1-200mg/天的剂量。

药物组合物的实施例是允许口服或非肠道—静脉内、肌内、皮下、经皮给药的那些。适用于此目的的适宜药物组合物是片剂、硬胶囊或软胶囊、粉剂、溶液、混悬液、糖浆剂和用于当场配成液体药剂的固体形式。非肠道给药的组合物是，例如，所有的肌内、静脉内、皮下可注射形式，或其形式为溶液、混悬液或乳液。还可提及脂质体制剂。其它形式是用于控释活性成分或用于口服给药的片剂，用适宜涂层包衣的片剂、微囊化粉剂、环糊精复合物，和长效制剂，例如，皮下长效制剂，如长效注射剂或植入制剂。