纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法

摘要

本发明公开了一种纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法，首先制备茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力为0.32～0.34；再依次进行纳米固定化酶制备和茶多酚的定向氧化这两大步骤。测得本发明的方法生产的茶黄素混合液中四种主要茶黄素单体的浓度之和为64.5％，TF2A含量为43.3％。本发明的制备方法中，纳米固定化酶的制备方法简单，氧化后易回收，所用材料成本低；氧化条件简单，氧化时间短；制备的产品具有良好的定向性，含量较高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米固定化酶体外定向生产茶黄素-3-没食子酸酯的方法。

技术背景

茶黄素是茶色素中生物学活性较强的物质，其保健功效、提取和分离技术等受到中外学者的高度重视。实验证明，茶黄素具有高抗癌、抗心脑血管疾病、抗菌、抗病毒等多种活性，其作用效果明显优于茶多酚、茶色素。茶黄素被广泛认定为茶叶中活性利用潜力最大的物质之一，而其含量低、难于实现工厂化生产是当前存在的主要难题。茶黄素中含有多种单体，由于单体间的结构差异，每种单体的生物学活性也不同。从红茶中提取的茶黄素粗提物，其各茶黄素单体的含量较平均，目前有针对性的定向生产以某种茶黄素单体为主要成分的茶黄素混合物的技术未见相关专利和报道。茶黄素-3-没食子酸酯，简称TF2A(theaflavin-3-gallate)是活性较强的茶黄素单体，具有强的抗氧化活性及其他生物学活性；制备以TF2A为主体的茶黄素混合物具有良好的应用前景。

体外酶促氧化制取茶黄素，是利用多酚氧化酶的氧化特性有目的地定向生产茶黄素。纳米技术是20世纪80年代末诞生的新兴技术，其广泛的应用推动了传统生物学研究进入全新发展阶段。2002年《美国化学学会会刊》报道，美国西北太平洋国家实验室的研究人员成功利用纳米材料将酶固定化，而且能够同时保留它的活性、稳定性，这顶成就为纳米材料酶学应用开启了可能性，也为酶固定化带来了技术突破。至今，纳米材料在茶多酚氧化酶固定化方面的应用未见相关专利和报道。

发明内容

针对以上研究中的空白，本发明提供了一种工艺简单，能提供高含量的TF2A的纳米固定化酶体外定向生产茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A)粗提物的方法。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法，包括首先制备茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力为0.32～0.34，此方法还依次进行以下步骤：

1)、纳米固定化酶制备：按照0.70～0.75g/70～75ml的比例在上述茶多酚氧化酶粗提液中加入纳米碳酸钙粉末，在2～8℃下搅拌1.5～2小时；将上述混和物全部放入离心容器中，3500～4500转，2～8℃离心15～20分钟，弃上清；再用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液洗涤2～3次，所得沉淀物即为纳米固定化酶；

2)、茶多酚的定向氧化：取儿茶素含量大于98％、表没食子酸儿茶素没食子酸酯含量大于45％的茶多酚，用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液配制成浓度为0.4～0.6mg/ml的溶液，并用1mol/L的HCl调节所述溶液的pH至4.9～5.1，形成茶多酚溶液；将上述步骤1)中所得的纳米固定化酶按照重量体积比为0.008～0.012g/0.8～1.2ml的比例悬浮于pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中，充分搅拌使其悬浮均匀，形成纳米固定化酶悬浮液；在所述茶多酚溶液中加入纳米固定化酶悬浮液形成混合液，所述纳米固定化酶悬浮液与茶多酚溶液的体积比0.25～0.3/3.8～4.2；将所述混合液于35-38℃的温度下，加热10～12分钟；将上述加热后的混合液倒入离心容器，7500～8500转2～8℃离心15～20分钟，收集上清液，进行萃取、真空干燥。

作为本发明的纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法的一种改进：步骤2)的萃取步骤中，使用的乙酸乙酯体积为所述上清液体积1/4～1/6，然后收集乙酸乙酯层；真空干燥步骤中，干燥温度为35～45℃。

作为本发明的纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法的进一步改进：纳米碳酸钙粉末的颗粒大小为70nm、形状为纺锤状。

作为本发明的纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法的进一步改进：首先制备茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力为0.34，再依次进行以下步骤：

1)、纳米固定化酶制备：按照0.75g/75ml的比例在上述茶多酚氧化酶粗提液中加入纳米碳酸钙粉末，在4℃下搅拌2小时；将上述混和物全部放入离心容器中，4000转，4℃离心15分钟，弃上清；再用pH为5.6的柠檬酸磷酸缓冲液洗涤3次，所得沉淀物即为纳米固定化酶；

2)、茶多酚的定向氧化：取儿茶素含量大于98％，表没食子酸儿茶素没食子酸酯含量大于45％的茶多酚，用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，并用1mol/L的HCl调节pH至5.0，形成茶多酚溶液；所述体积比为0.3/4.0的纳米固定化酶悬浮液与茶多酚溶液所形成的混合液于37℃的温度下，加热10分钟；将上述加热后的混合液倒入离心容器，8000转4℃离心15分钟，收集上清液，使用体积为上清液体积1/5的乙酸乙酯进行萃取、真空干燥。

本发明的方法制备而成的茶黄素混合物，四种主要茶黄素单体：TF1(theaflavin)，TF2A，TF2B(theaflavin-39-gallate)，TF3(theaflavin-3，39-digallate)的总含量较高；其中TF2A含量占绝对优势。具体的方法及数据如下：用重蒸水准确配制TF1，TF2A，TF2B，TF3浓度各为0.1mg/ml的茶黄素单体标样溶液和浓度为0.4mg/ml的本方法制备的茶黄素溶液，进行HPLC分析。

HPLC分析条件：ODS C-18柱，柱温35℃，检测波长：280nm，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，流动相：A泵：水-乙睛-乙酸：96.5-3-0.5(v/v/v)，B泵：水-乙睛-乙酸：69.5-30-0.5(v/v/v)；线性梯度洗脱，0-55min为0-100％B；55-60min为100％A。

计算公式为：

测得本发明的方法生产的茶黄素混合液中四种主要茶黄素单体的浓度之和为64.5％，TF2A含量为43.3％。

用本发明的制备方法，纳米固定化酶的制备方法简单，氧化后易回收，所用材料成本低；氧化条件简单，氧化时间短；制备的产品具有良好的定向性，含量较高。

附图说明

图1是茶黄素-3-没食子酸酯，即TF2A的结构图。

具体实施方式

实施例1：一种纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法，其制备步骤如下：

1)、制备茶多酚氧化酶粗提液：制备方法见钟萝著《茶叶品质理化分析》(上海科学技术出版社，1989年出版)，通过调整浓度来调节酶溶液的酶活力(测定方法见黄意欢著《茶学实验技术》，北京农业出版社，1995年出版)(以下酶活力数值用吸光度表示)，使粗提液中酶活力达到0.32。具体操作步骤为，称洗净茶鲜叶100.00g，置于组织捣碎机内，加入800ml冷丙酮，20g聚乙烯吡咯烷酮，捣碎5min，或用研钵快速磨成浆，然后抽滤，滤渣用80％冷丙酮反复淋洗，洗至滤出液无色为止。所得的滤渣即丙酮粉，置冰箱备用。将丙酮粉置于研钵中，加入1∶3(重量体积比)的pH5.6柠檬酸缓冲液和少量石英砂，在冰上研磨匀浆20min，然后用积压法和抽滤得粗酶液，4000rpm离心15min，得清酶液，调至一定体积，进行活性测定。取酶液1ml，加反应混合液3ml[反应混合液按pH5.6柠檬酸-磷酸缓冲液：0.1％脯氨酸：1％邻苯二酚(10∶2∶3)配制]于离心管中，在37℃下温浴10min，立即加6mol/L尿素溶液3ml，终止反应，4000rpm离心10min，取上清夜，在460nm处比色。空白对照反应液中的邻苯二酚用缓冲液代替，其他条件相同。酶活性计算公式进行了改进，具体为：

式中：E₄₆₀：反应终止时以空白为对照在460nm处的吸光度；

t：反应时间(min)。

2)、纳米固定化酶制备：按照每72ml的茶多酚氧化酶粗提液中加入0.70g纳米CaCO₃粉末的比例，将茶多酚氧化酶粗提液和纳米CaCO₃粉末混合后，在2℃下搅拌1.5小时；将所得的混合物全部放入离心管中，3500转，4℃离心15分钟，弃上清。再用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液洗涤3次，得到的沉淀即为纳米固定化酶。选用的纳米碳酸钙粉末的颗粒大小为70nm、形状为纺锤状。

3)、茶多酚的定向氧化：取儿茶素含量大于98％、EGCG含量大于45％的茶多酚，按照每1ml的pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液加入0.4mg上述茶多酚的比例，将上述茶多酚和上述柠檬酸磷酸缓冲液混合后形成溶液，并用1mol/L的HCl调节此溶液pH至4.9，形成茶多酚溶液。将步骤2)中所得的纳米固定化酶按照重量体积比为0.008g/1ml的比例悬浮于pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中(即每1ml的pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中放入0.008g的纳米固定化酶)，充分搅拌使其悬浮均匀，形成纳米固定化酶悬浮液。按照0.25/3.8(纳米固定化酶悬浮液/茶多酚溶液的体积比)的比例在茶多酚溶液中加入纳米固定化酶悬浮液，形成混合液；将此混合液倒入烧杯，放于35℃水浴锅中加热12分钟，然后取出，倒入离心管，7500转，8℃离心15分钟；收集上清液，将上清液倒入分液漏斗中，加入体积为上清液体积1/5的乙酸乙酯，萃取，收集乙酸乙酯层，45℃真空干燥，得亮黄色粉末，即为主要成分为TF2A的茶黄素粗提物。

用此种方法制备的茶黄素混合物，四种茶黄素单体的浓度之和为67％，TF2A含量为48％。

实施例2：一种纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法，其制备步骤如下：

1)、制备茶多酚氧化酶粗提液：如实施例1所述的方法制作茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力达到0.34。

2)、纳米固定化酶制备：按照每75ml的茶多酚氧化酶粗提液中加入0.73g纳米CaCO₃粉末的比例，将茶多酚氧化酶粗提液和纳米CaCO₃粉末混合后，在8℃下搅拌2小时；将所得的混合物全部放入离心管中，4000转，2℃离心20分钟，弃上清。再用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液洗涤2次，得到的沉淀即为纳米固定化酶。选用的纳米碳酸钙粉末的颗粒大小为70nm、形状为纺锤状。

3)、茶多酚的定向氧化：取儿茶素含量大于98％、EGCG含量大于45％的茶多酚，按照每1ml的pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液加入0.6mg上述茶多酚的比例，将上述茶多酚和上述柠檬酸磷酸缓冲液混合后形成溶液，并用1mol/L的HCl调节此溶液pH至5.1，形成茶多酚溶液。将步骤2)中所得的纳米固定化酶按照重量体积比为0.01g/1.2ml的比例悬浮于pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中(即每1.2ml的pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中放入0.01g的纳米固定化酶)，充分搅拌使其悬浮均匀，形成纳米固定化酶悬浮液。按照0.3/4.2(纳米固定化酶悬浮液/茶多酚溶液的体积比)的比例在茶多酚溶液中加入纳米固定化酶悬浮液，形成混合液；将此混合液倒入烧杯，放于37℃水浴锅中加热11分钟，然后取出，倒入离心管，8000转，2℃离心15分钟；收集上清液，将上清液倒入分液漏斗中，加入体积为上清液体积1/6的乙酸乙酯，萃取，收集乙酸乙酯层，40℃真空干燥，得亮黄色粉末，即为主要成分为TF2A的茶黄素粗提物。

用此种方法制备的茶黄素混合物，四种茶黄素单体的浓度之和为65.9％，TF2A含量为47％。

实施例3：一种纳米固定化酶体外定向生产TF2A粗提物的方法，其制备步骤如下：

1)、制备茶多酚氧化酶粗提液：如实施例1所述的方法制作茶多酚氧化酶粗提液，粗提液中酶活力达到0.33。

2)、纳米固定化酶制备：按照每74ml的茶多酚氧化酶粗提液中加入0.75g纳米CaCO₃粉末的比例，将茶多酚氧化酶粗提液和纳米CaCO₃粉末混合后，在4℃下搅拌1.8小时；将所得的混合物全部放入离心管中，4500转，8℃离心18分钟，弃上清。再用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液洗涤3次，得到的沉淀即为纳米固定化酶。选用的纳米碳酸钙粉末的颗粒大小为70nm、形状为纺锤状。

3)、茶多酚的定向氧化：取儿茶素含量大于98％、EGCG含量大于45％的茶多酚，按照每1ml的pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液加入0.5mg上述茶多酚的比例，将上述茶多酚和上述柠檬酸磷酸缓冲液混合后形成溶液，并用1mol/L的HCl调节此溶液pH至5.0，形成茶多酚溶液。将步骤2)中所得的纳米固定化酶按照重量体积比为0.012g/0.8ml的比例悬浮于pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中(即每0.8ml的pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液中放入0.012g的纳米固定化酶)，充分搅拌使其悬浮均匀，形成纳米固定化酶悬浮液。按照0.28/4.0(纳米固定化酶悬浮液/茶多酚溶液的体积比)的比例在茶多酚溶液中加入纳米固定化酶悬浮液，形成混合液；将此混合液倒入烧杯，放于38℃水浴锅中加热10分钟，然后取出，倒入离心管，8500转，4℃离心20分钟；收集上清液，将上清液倒入分液漏斗中，加入体积为上清液体积1/4的乙酸乙酯，萃取，收集乙酸乙酯层，35℃真空干燥，得亮黄色粉末，即为主要成分为TF2A的茶黄素粗提物。

用此种方法制备的茶黄素混合物，四种茶黄素单体的浓度之和为66.8％，TF2A含量为46.3％。

以上所述仅为本发明的若干个实施案例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来讲，还可以作出许多变型和改进，例如搅拌时间，所有变型及改进均应视为本发明的保护范围。