法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2009-01-28
授权
授权
2006-04-19
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-02-22
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种通过评价生物培养基的切除(excision)/再合成的能力，从而对所述培养基的总的和特定的DNA修复能力进行定量评价的方法，本发明也涉及该方法的应用。
背景技术
DNA连续的受到内在和外在的攻击，从而引起基(base)的形成或糖的损坏。
这些损坏包括：
-嘌呤或嘧啶基的损坏：细胞代谢光敏作用诱导的氧化损坏；通过化学加成物的损坏，该损坏由许多基因毒性(genotoxic)试剂的有害反应产生的，如燃烧产物中的多环烃；以及通过次甲撑(metheno)基或艾塞诺(etheno)基的形成引起的损坏；
-DNA双螺旋结构的损坏：链内(同一链上两个相邻基之间)或链间(设置在同源链上的两个基之间)桥的形成通常由紫外线(形成二聚的嘧啶间的桥的形成)或双功能抗癌抗菌剂引起，如顺铂(Cisplatin)和嵌入试剂，它们在对应链携带的基之间形成稳定的共价键；
-由于DNA是部分不稳定分子所引起的自发的损坏：自发的去胺基作用(deaminations)或嘌呤丢失作用(depurinations)；
-单链或双链裂解引起的损坏：由试剂如致电离辐射试剂产生和通过自由基反应产生；
-糖损坏：去氧核糖的破坏导致损坏位置的磷酸双酯键(phosphodiester bond)的裂解，随后发生链的裂解。
诱导损坏的多样性通过分析UVC照射后检测到的稳定的光化产物进行说明：由于环丁烷环的形成，嘧啶(6-4)嘧啶酮和嘧啶二聚物在两个相邻嘧啶间形成。嘧啶二聚物和(6-4)产物的相对比例范围为10：4～1。它们各自在紫外线辐射中的致命效应(lethal effect)和诱变效应(mutagenic effect)也是不同的：和(6-4)产物相比，二聚物具有较大的细胞毒素作用，而对于诱变效应事实上却相反。同样的，致电离辐射(例如，钴60的γ-射线)同时会产生单链或双链的裂解(比例约为9∶1)、许多基的加成物、基消除以及DNA和邻近蛋白质(如染色体)之间大剂量的桥。平均来说，一个链的裂解以每个改性基来计算。在辐射的细胞毒素效应中，双链裂解的主要作用伴随着由于基取代引起的诱变效应。
在孤立的DNA中可以产生不同类型的损坏。例如，(6-4)光化产物的损坏和环丁烷型的嘧啶二聚物是由UVC照射诱导的(Hoei jmakeret al.，Mutation Res.，1990，236，223-238)；氧化型的损坏是由铁和过氧化氢参加的芬同反应(Fenton’s reaction)诱导的(Elliotet al.，Free Rad.Biol.Med.，2000，1438-1446)。制备改性DNA的另一种方法是通过分子生物技术处理质粒，插入化学合成得到的、并包含有益的损坏寡核糖核酸(Biade et al.，J.Biol.Chem.，1997，273，898-902)。
所有活的有机体具有DNA的修复系统，以保持其基因组的完整性。
在这些修复系统中，有两个系统具有从DNA上消除改性基的功能：它们是基的切除修复(BER)系统和核苷切除修复(NER)系统：
·BER系统主要是用于DNA中小损坏的修复，如氧化损坏、脱碱基位点(abasic sites)、基的分裂、基的甲基化和艾塞诺-基等。
·NER系统用于大的、诱导DNA双螺旋扭曲的损坏，如乙酰胺氟(acetylaminofluorine)-DNA、顺铂-DNA和补骨脂素-DNA加合物、源于UVB和UVC照射DNA的二聚物、DNA基和其它分子间形成的共价损坏等(Sancar et al.，Annu.Rev.Genetics，1995，29，69-105)。
这些不同的修复系统具有共同的特征，特别是在下述步骤中：
-通过属于修复系统的蛋白质识别损坏；
-损坏的切除，和可选择的，邻近核苷的切除；
-通过培养基中的聚合酶对消失的核苷进行再合成；
-一般修复结束时伴随着赘生链(neoformed strand)和存在的DNA链的绑定。
在所有的这些情况下，该方法包括改性核苷的消除和作为DNA链的取代、在修复培养基中出现的至少一个核苷三磷酸盐的合并。
然而需要注意的是，特别是在真核细胞中，修复系统是很复杂的，这种过分简单的结构存在很多变化(全部的修复、涉及DNA转录的修复、以及涉及DNA复制的修复等等)。一些蛋白质同时也包含在几种修复系统中；对于单一系统，其它的是特定的，一些可以通过细胞或外界因素进行诱导，另一些具有普遍存在和稳定的表达。
其它情况的说明：
术语“培养基”指的是可以在细胞提取液和延伸的DNA损坏中发生修复反应的DNA。
术语“生物培养基”或“细胞提取液(cell extract)”指的是通过未提纯的生物制剂的提纯制剂，该制剂可包含至少一种和DNA修复相关的酶活性。
通常，损坏与决定DNA修复的特定蛋白质相关。有机生物体之间存在差异；在原核生物如埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)中，酶不很明显，而在人体中，可以观察到一个非常完整的损坏-明显的修复酶的缔合(association)，特别是在BER系统中。例如，Lindahl和Wood(Science，1999，286，1897-1905)公开了BER系统中人体最重要的酶和与之相关的损坏。例如，在人体中，属于BER系统的修补糖(glycosylase)的OGG1蛋白质和8-氧-2’-脱氧鸟苷(deoxyguanosine)的修复相关。在埃希氏大肠杆菌中，氨基甲肟嘧啶(formamidopyrimidine)-DNA-N-修补糖修复了同样的损坏，但通常更多的也是氧化的嘌呤基(Seeberg et al.，TIBS，1995，20，391-397)。人类蛋白质ANPG是细菌蛋白质ALKA的等同物。然而，这些酶和它们的培养基没有相同的亲和力，并具有不同的切除比率常数(Laval et al.，Mut.Res.，1998，402，93-102)。如果损坏没有修复，BER系统修复的超过大约40个不同的损坏具有巨大的阴性生物重要性。一般认为决定它们修复的酶具有很大的抗癌作用。可以看到，了解它们培养基的特性是非常重要的。
细胞修复能力的分析已经发展成熟，并可以分为两类：活性细胞提取液的体外分析与活细胞体内或半体内分析。
I.以切除/再合成活性为基础的方法
A.大部分的体外分析已经在Wood et al.(Cell，1988，53，97-106and Biochemistly，1989，26，8287-8292)的基础上发展成熟，该分析是评价修复的切除/再合成步骤。
更明确的，这种分析包括应用引入损坏的质粒DNA(通过UV照射：嘧啶二聚物和桥的形成；通过脱氧核糖核酸酶I的反应：单链的裂解或分裂)；改性的DNA在修复制剂中、在30℃下进行培育(incubate)，该制剂至少包括：要评价的细胞提取液、在α位标记32P和ATP的核苷三磷酸盐。提取液中的酶切割质粒DNA并消除损坏。DNA通过取代消除的核苷重新合成。引入到培养基内的放射性核苷在合成的过程中和DNA接合。通过琼脂糖胶体的电泳将修复的质粒分离后，对和培养基修复比率成比例的结合的放射量进行了测试。制备细胞提取液的方法和反应条件影响修复的质量。特别是，获得最好的修复效果是来自于全部用体外转录获得的细胞提取液，而那些用于改善源于SV40复制起点的质粒复制的细胞质(cytosolic)提取液和其它的天然细胞提取液显示了核酸酶活性，这些核酸酶活性不能对修复进行正确的译码。
在Wood et al.等确定的条件下，关于照射DNA反应的特异性在KCL的浓度位40-100mM时更明显。除此以外，修复过程中发生的照射DNA的复制很大程度上取决于ATP和ATP-再生系统(磷酸肌酸+肌氨酸磷酸激酶)的存在，为了保持ATP的恒量，这种水平的维持和修复切割步骤更加特别相关。例如，在链裂解修复时，这种依赖不会发生。同时在反应混合物中使用了一个含有没有被改性的质粒的对照试样。
Wood et al.的分析需要使用放射性标记，这限制了常规分析中应用这种方法；除此以外，这种分析在常规使用时不容易、而且不具有很好的实用性。
Wood et al.的方法建议在来自于经受着色性干皮病(xerodermapigmentosum)的病人的提取液为特征的分析中使用(Satoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，6335-6339；Jones et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，991-995；Robins et al.，EMBO J.，1991，10，3913-3921)。着色性干皮病是一种多基因的、多等位基因的(multiallelic)、常染色体的隐性疾病。经受这种疾病的病人的细胞对紫外线的辐射非常敏感，并显示出DNA修复缺陷。8个基因涉及到这种疾病的不同的互补群：XPA～XPG和变异群XPV。每个群相对于DNA修复、特别是不同的NER子类具有不同的特点。DNA损坏，无论是属于小损坏的类别还是大损坏的类别，都根据互补群(complementationgroup)进行不同的修复。
其它的修复疾病(柯凯因氏症候群(Cockayne Syndrome)，毛细管扩张失调症(Ataxia Telangectasia))也具有特定的修复特点，Woodet al.的方法已经研究过。
B.在许多公开出版物中，B.Salles和P.Calsou团队(Biochimie1995，77，796-802；Anal.Biochem.1995，232，37-42)公开了一种通过负载在微盘(microplate)井(well)上的质粒切除/再合成反应探测DNA损坏的方法。质粒吸附在微盘井(microplate wells)内，然后用化学试剂(posteriori)进行改性。细胞提取液和地高辛(Digoxigenin)标记的核苷三磷酸盐一起加入到井中。在再合成的步骤中，如果发生了损坏切除，标记就和DNA结合。然后标记通过偶联到碱性磷酸酶的抗体在每个井中显现。在碱性磷酸酶的去磷作用后，发光的培养基加到每个井中。在每个井中发光信号被检测到。这和标记结合的比率是成比例的。
这种方法也在国际申请WO96/28571中有叙述，该发明人也属于B.Salles和P.Calsou团队，其公开的方法是定性和定量探测DNA的损坏，含有损坏的DNA与载体和含有细胞提取液的成分连接，其中的标记和所述的含有损坏的DNA相关联(在所述载体负载物的前面或后面)。他们认为他们的方法可以同时处理大量的样品；如果将该方法应用到实例中，细胞提取液中进行的修复反应介质为50ul，所用的提取液含有150ug的蛋白质、50mM的KCL、5mM的氯化镁、DDT、磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶和多种dNTPs，这些组分中的一个用地高辛(digoxigenin)标记。在30℃下培育3小时后完成修复，井用洗液进行清洗，洗液中含有磷酸盐缓冲液，非离子表面活性剂(Tween20)加入的比例为0.05～0.15％(优选的组成为：10mM磷酸缓冲液、137mMNaCl和0.1％的Tween20)。很明显，这种分析是非常灵敏的，在分析液中，其检测范围为40ng的DNA，而不是200或300ng。
B.Salles和P.Calsou团队的分析方法在负载在载体后必须进行质粒的改性。现在公知的是，包括许多化学或物理试剂引起的损坏是链的裂解。现在，这些裂解可以通过活性细胞提取液有效而快速的进行修复。因此，通过这种分析方法不可能区分裂解修复和其它损坏的修复之间的差别。裂解修复甚至掩盖了其它损坏的修复，并和其它DNA的损坏修复的信号发生干扰。因此，这是一种检测总的效果的方法，而不能区分由修复系统鉴别的损坏；除此以外，该发明的目的不是检测和定量分析DNA修复中的蛋白质的活性，而是鉴别处理后的DNA上的损坏的存在。
II.以评价切割/切除(incision/excision)步骤为基础的方法
Wood et al等提出的不同方法已经应用，特别是在仅仅测试损坏切割活性上的应用。
A.Redaelli et al.(Terat.Carcinog.Mut.，1998，18，17-26)公开了一种方法，该方法中的质粒直接用提取液进行培育，而不用核苷三磷酸盐。超螺旋质粒中的分裂在电泳时对琼脂糖凝胶的移动速率产生了影响。由于超螺旋质粒的形成，超螺旋质粒比切割的质粒的移动速度快。相对于质粒不同形式的数量被确定；切割形式的数量和质粒损坏的切割活性相关，包括提取液。
更进一步，该论文研究了AP-核酸内切酶的切割反应，该反应发生在脱碱基位点上，该反应是在特别用于要修复的改性反应糖苷酶的反应后(烷化、水解去氨、氧化和不匹配(mismatching))，通过分裂定位在脱碱基位点上的3’或5’上的去氧核糖磷酸双酯(phosphodiester)的连接获得的。
在这篇论文中，AP-核酸内切酶的活性进一步在人类淋巴细胞的天然提取液上进行了研究。提取液(80ul)首先和未破坏的质粒(对照物)一起进行培育，然后和德帕耐悌(depurinated)质粒一起进行培育。于是在发现切割活性的范围内定量AP-核酸内切酶的活性取决于破坏和对EDTA的灵敏度。
B. P.Calsou和B.Salles的团队(Biochem.Biophys.Res.Com.，1994，202，788-795)提出了另一种进一步测定质粒的损坏切割活性的方法。在第一切除步骤后，为了防止正常DNA片段通过内生的聚合酶进行再合成，他们在修复介质中引进了特别用于真核状态聚合酶、蚜黄素(aphidicolin)的抑制剂。外生的原核聚合酶核在所有的试管中和反应介质等量混合。得到了反映损坏切除步骤中的结果差异，而不是切除的DNA片段的再合成。
C.另一种方法：以彗星试验Comet assay)(碱性介质中单一细胞的凝胶电泳现象)的改性为基础的另一种方法也可以用于测定切割的活性。该方法由Collins et al.(Mutagenesis，2001，16，297-301)发展成熟。氧化的损坏在可见光存在下，通过海拉细胞的光敏作用引入到染色体组DNA中。然后将这些细胞和放在显微镜载片上的琼脂糖胶体结合，细胞膜和蛋白质以控制的融解来消除。胶体中分离的核苷在细胞提取液中培育，这些细胞提取液在第一损坏切割步骤中是活性的。然后将这些载片在碱性介质中进行电泳。分裂的出现使DNA的移动和核苷整体移动得更快。于是，DNA的发射物形成彗星的外观，完好的DNA在头部，而含有分裂的DNA在彗星的尾部。取决于特殊软件的彗星尾部DNA的比例直接和包含在提取液中的、用于研究中的损坏的切割活性相关。这些方法已经用于人体淋巴细胞提取液的氧化破坏的切除活性的测定。和Redaelli et al.，1998公开的测定质粒分裂的方法相比，Collins et al.的方法采用了彗星方法来估计链分裂，该方法认为：首先这种变化更加灵敏(能够探测约每109道尔顿的0.2～2的分裂)，其次，更加经济(根据所用材料的节约)，这是因为反应混合物(胶体中的DNA)的量仅为50ul，10ml血液(可以进行几次培育)中就含有足够的要分析的材料的量。
D.国际申请WO 01/90408公开了一种探测和确定DNA损坏修复中涉及的蛋白质的活性的方法。
更进一步，该方法包括至少一个被破坏的DNA的载体的连接，该DNA含有至少一个公知的损坏；然后该被破坏的DNA经过修复成分的修复，该修复成分含有或不含有至少一种涉及该被破坏DNA修复的蛋白质，并且，在前述步骤的过程中，是通过测定连接到载体或自己从载体上移走的标记所释放的不同信号对修复蛋白质的活性进行测定。
这个方法和被破坏DNA一起使用，被破坏DNA为15～100个基的寡核苷酸形式或100～20000基的多核苷酸的形式，从而该方法有可能比其它的方法获得了更多的信息，从而几种培养基的切除能够同时监测。
然而，这种方法涉及到DNA损坏切割活性的演示。因而限制了确定可以引入到合成寡核苷酸的损坏切除的步骤。而且，尽管该方法提供了大量关于切除活性的信息，但是，它不适合对酶在DNA的切除/再合成中的活性进行精确定量。
而且，除了上述报道的各种技术的特定缺陷外，这些不同的方法也具有下述缺陷：
-上述的所有方法都需要使用一定量的生物材料，特别是超过10ul的细胞提取液：对于约100ug的蛋白质，通常用的反应体积为50ul，含有10～40ul的提取液。提取液需要花很长时间制备，可用的细胞量通常很小，这限制了上述方法使用的次数。
-无论使用的探测方法和分析方法是否在溶液或载体上进行，上述所有的方法提供的信息是关于点对点(point-by-point)修复信息，这些信息限于针对提取液一整部分的给定的培养基；这是因为：在测定由Wood et al.提出的修复能力时，例如，每种方法单独在一个试管中，即反应在给定的质粒和给定的提取液中进行。对于每种要测试的提取液，标记和质粒结合的比率与在对照提取液(control extract)存在下、以相同方式制备的培养基中获得的标记的结合比率相比较。所使用的对照提取液通常从和EBV或SV40一起转化的特征细胞中制备。在上述的Wood et al.不同方法中大体是相同的。
-由于分析方法操作相对繁琐，并需要获得大量的生物材料，试验限制了使用的培养基的数量和测试的生物提取液的数量。
-引入质粒的损坏既不能测试也不能定量。为了排除含有链裂解的DNA，使用由Wood et al.发展的方法的作者仅仅排除了失去其超螺旋结构的质粒。对于精确定义和确定给定的生物培养基的修复能力，所获得的信息也是非常片面和不充分的。
因此，申请人确定的目的就是克服现有技术的缺陷，特别提出了一种可以确定和定量针对DNA修复的切除/再合成的酶的活性的方法，该方法在生物提取液中以快速、精确、小型化和有效的方式进行，并且不需要使用对照修复溶液。
发明内容
本发明的主题是一种定量分析至少一种生物培养基的总的和特定DNA修复能力，其特征在于该方法包括以下步骤：
(a)制备一定范围的质粒，每个质粒含有明显的DNA损坏，通过对所述的不同质粒和至少一种物理和/或化学试剂一起进行单独的处理，并对所述的每种质粒的超螺旋部分进行恢复，从而排除了链的裂解，并进而避免了核酸酶的反应，
(b)确定出现在每个所述范围内的质粒的损坏；
(c)根据预设的构型A，将所述质粒范围内的多种质粒和没有损坏的至少一个超螺旋对照质粒沉积到一个载体上，从而形成一个划分有不同区域A1～Ax的功能载体，x指的是等于需要同时测试的生物培养基数目的整数，每个从而形成一个划分有不同区域A1～Ax含有所述范围的质粒；因而，所述范围内的改性的质粒的不同制备沉积在相同载体上的指定的精细的位置上。由没有DNA损坏的超螺旋质粒组成的至少一个对照物共同沉积下来。
(d)用多种修复溶液对步骤(c)中得到的功能载体进行培育，含有至少一种生物培养基的每种溶液可能具有修复、ATP、ATP-再生系统的酶活性，标记的核苷三磷酸盐和任何其它对修复酶活性的必要组分在所述生物培养基中存在，优选在30℃下进行1～5小时，优选为3小时，在所述的培育前，每种所述的修复溶液沉积在所述功能载体的所述的不同和预设的区域A1～Ax。
(e)至少清洗所述功能载体一次，
(f)直接或间接测定标记产生的信号，该标记在步骤(d)的修复反应过程中和所述不同和预设区域A1～Ax和DNA结合为一体，
(g)记录和定量对应于在每个区域A1～Ax的质粒沉积的信号，以及
(h)测定含有相对于直接沉积的对照质粒的损坏的质粒信号的比率。
根据本发明，这种方法具有一定的优点：
-由于同时平均阿不同类型损坏的修复成为可能，该方法在鉴别多种损坏时可以用于探测整体效果。
-本发明使得测定生物提取液的切除和/或切除/再合成能力不需和对照的生物培养基进行对比。这是因为通过实现该方法获得的结果和生物提取液的单一标本足以使提取液的修复效果精确和定量损坏。
-特别适合研究不同生物培养基，对于体内状态是一个好的反映。
-根据本发明的方法，该方法根据给定生物培养基在DNA修复中的酶活性“绘制”给定的生物培养基。该发明根据得到的绘制的图对生物提取液进行鉴别。
-本发明可测定在给定生物培养基中缺失或部分缺失的修复蛋白质，从而作为诊断测试。
-根据本发明，该方法也能够根据DNA损坏修复比较不同生物培养基的性能水平。
-本方面不使用任何放射性的同位素。
-由于本发明的小型化，所以其能够用很小量的生物材料获得大量的信息。
-本发明可以是自动化的。
根据所述方法的优选实施例，步骤(a)中制备的质粒从具有双链超螺旋形态(pBR322、M13、pUC等)中选择。
对照质粒的超螺旋形态是通过用公知的技术进行提纯得到的，例如，恰根(Qiagen)质粒提纯组合体。也优选用其它的提纯步骤限制不想要的质粒形态的生成，如氯化铯离心和/或蔗糖梯度离心。
根据本发明步骤(a)中的另一优选实施例，不同的能够引入DNA损坏的物理、生物或化学试剂从更适宜进行诱导中选出：单一损坏的形成、限制数目的损坏或属于同一族的不同损坏的形成。
例如，对于提到的损坏的种类可能包括：氧化损坏、由紫外线B或C辐射诱导的光化产物、化学加合物、艾塞诺-基、脱碱基位点和DNA裂解。
例如，物理和化学试剂选自那些功能主要为：
-通过II型光敏作用机理：纯态氧主要是靶向鸟嘌呤；在这种情况下，形成的大量的损坏是8-羟鸟嘌呤(8-oxoguanine)(Ravanatet al.，Chem.Res.Tox.，1995，8，379-388)；
-通过I型光敏作用机理或通过释放羟基自由基的机理；在这种情况下，得到的DNA损坏是氧化性的损坏；这些损坏以等同的方式影响嘌呤基和嘧啶基。在上述提到的这些损坏中，可能由8-羟鸟嘌呤、乙二醇、胸腺嘧啶、法批-鸟嘌呤(fapy-guanine)、法批-腺嘌呤(fapy-adenine)、羟甲基尿嘧啶(hydroxymethyluracil)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)和甲酸尿嘧啶(formyluracil)组成(Cadet et al.，Rev.Physiol.Biochem.Pharm.，1997，31，1，87)；
-通过三重态-三重态能量迁移(triplet-triplet energytransfer)；在这种情况下，形成的主要损坏是环丁烷嘧啶二聚物(Costalat et al.，Photochem，Photobiol.，1990，51，255-262)；
-通过释放由DNA基直接吸收的能量，如紫外线B或C的辐射。形成的连接(linkages)是环丁烷嘧啶二聚物，(6-4)光化产物和德瓦价异构体(Douki et al.，J.Biol.Chem.，2000，275，11678-11685)；
-通过释放纯态氧。这些试剂例如属于内过氧化物族。这种情况下形成的损坏是8-羟鸟嘌呤(Ravanat et al.，J.Biol.Chem.，2001，276，40601-40604)。
化学试剂选自那些诱导公知基的改性、属于致癌物质的一类。例如，提到的试剂包括：乙酰胺基芴(acetylaminofluorene)(Hess et al.，1996，Nucleic Acid Res.24，824-828)、顺铂(Pasheva et al.，2002，Int.J.Biochem.Cell Biol.，34，87-92)、苯并芘(Laws et al.，2001，Mut.Res.；484，3-18)、补骨脂素(Zhang et al.，Mol.Cell.Biol.，2002，22，2388-2397)、氯乙醛(Chloroacetaldehyde)(CAA-Wang et al.，2002，13，1149-1157)、三苯氧胺(Dasaradhi et al.，1997，Chem.Res.Tox.，10，189-196)和反、反2.4-癸二烯醛(DDE-Carvalho et al.，1998，Chem.Res.Tox.，11，1042-1047)。
仍然根据所述方法的另一优选实施例的步骤(a)，不同试剂用在所述质粒范围的每个质粒上。
根据所述方法的另一优选实施例的步骤(b)，损坏的确定包括(i)取出每种具有损坏的一部分质粒，(ii)用从DNA中释放出核苷的酶分解所述的一部分质粒，以及(iii)用和定量分析技术匹配的分离技术的组合对分解的结果进行分析。
根据本实施例的优选方案，用至少一种下述的酶进行分解：牛脾磷酸二酯酶、P1核酸酶、蛇毒磷酸二脂酶和碱性磷酸酶(Douki et al.，J.Biol.Chem.，2000，275，11678-11685)。
根据本实施例的另一优选方案，酶分解的结果用下述一种方法进行分析：前后偶联质谱的高性能液体色谱(HPLC)(Douki et al.，2000，J.Biol.Chem.，275，11678-11685；Sauvaigo et al.，2001，Photochem.Photobiol.，73，230-237；Frelon et al.，Chem.Res.Tox.，2000，13，1002-1010)，与气相色谱偶联的HPLC(Wang et al.，2000，13，1149-1157；Pouget et al.，2000，Chem.Res.Tox.，13，541-549)或者与电化学检测偶联的HPLC(Pouget et al.，2000，Chem.Res.Tox.，13，541-549)。
根据所述方法的另一优选实施例，在步骤(c)之前，步骤(a)中得到的质粒的超螺旋形态优选用蔗糖梯度离心和/或氯化铯梯度离心法进行提纯。
根据所述方法的另一优选实施例，也是在步骤(c)之前，质粒范围内的每种质粒浓度在稀释的缓冲溶液中稀释为5～100ug/ml，优选的缓冲液的PH值为6.5～8.0，可选择含有盐和非离子表面活性剂；优选的，所述缓冲液是含有0.05M～0.05M的NaCl的10mM磷酸盐缓冲液或SSC缓冲液。
不同的质粒优选用生成微阵列(microarrays)的自动设备进行沉积，即，沉积的量优选为100～1000微微升(picoliters)。
根据所述方法的另一优选实施例的步骤(c)，所述载体被激活，以增加其相对DNA的亲和力，载体选择由有机或无机材料组成，这些材料选自玻璃、硅和其类似物，以及合成或非合成高分子(尼龙或硝化纤维膜)，载体的表面可选择的进行功能化；优选的，所述载体由涂有多聚赖氨酸的玻璃载片以吸附DNA，或用环氧基对玻璃载片进行功能化，以和DNA形成共价键。
如有必要，通过处理增加DNA和其载体之间的连接。这些处理必须不能在沉积的DNA上产生附加的损坏。
根据本发明，标准的载体含有区域A1～Ax，含有全部范围质粒的每个区域在每个所述区域内包括：
-至少对比质粒的一个沉积，和
-含有光化产物的质粒的一个沉积，和/或
-含有氧化性破坏的质粒的一个沉积，和/或
-含有艾塞诺基的质粒的一个沉积，和/或
-含有DNA裂解的质粒的一个沉积，和/或
含有致癌试剂加合物的质粒的一个沉积。
根据本发明方法的步骤(d)：
-根据Manley et al.，1983，Methods Enzymol.101，568-582的方法或根据Biade et al.，J.Biol.Chem.，1998，273，898-902的方法或根据任何其它能够提供含有修复蛋白质的培养基的方法，生物提取液可以用生物培养基制备。
-标记选自亲和力分子、荧光物质、抗体或生物素；优选的，标记或用于肉眼观察标记的试剂特别选自由具有直接的荧光(Cy-3或Cy-5)的荧光物质或间接的荧光物质(生物素或地高辛)组成。
-然后载体在一定温度下培育1～5小时以改善修复反应，温度优选为30℃，时间优选为3小时。
根据本发明优选实施例的步骤(e)，载体用含有非离子表面活性剂的盐溶液至少清洗一次，特别是在含有Tween 20的10mM磷酸缓冲液中，然后用清水至少漂洗一次。
根据本发明方法的步骤(f)，用适合标记的方法对信号进行测定；例如，如果标记是荧光的，直接测定由载体上的不同沉积释放出来的荧光信号。
根据本发明优选实施例的步骤(g)，所述信号用能够激活标记的方法进行定量分析，优选为荧光团(fluorophore)，以及用能够测定激活后释放出来的信号的方法进行分析。
信号用适合载体和标记用的仪器进行测定。扫描器可以用作荧光成像分析，优选为标记用的特殊波长的激光发生器。
根据本发明优选实施例的步骤(h)，含有损坏的质粒获得的信号和设置在同一载体上的对照质粒获得的信号的数量比例是确定的。
根据本发明，因而获得了给定生物培养基的修复情况(repairprofile)。
这个修复情况可以用于测试培养基总的和特定的修复能力，用于诊断修复相关的疾病，或用来评价物理或化学处理(例如，基因毒性产品)对给定培养基的修复能力的影响。
因此，本发明的一个主题是上述方法的应用：
-用于确定生物培养基的修复情况；
-用于诊断修复相关的疾病；
-用于评价物理或化学处理(例如，基因毒性产品)对给定培养基的修复能力的影响；
-用于筛选能够调节生物培养基修复系统的物质。
附图说明
图1显示的是载体形状的实施例；可以看到9个区域沉积的平面图；
图2表示的是每个区域的沉积平面图；以及
图3表示的是修复流程图-与细胞系的修复关系，该细胞系用于制备修复反应的提取液。
具体实施方式
除了上述方案外，本发明也包括下文中提到的其它方案，此处所述的实现所述方法的实例是本发明的主题，然而，显而易见的是这些实例仅仅是为了演示本发明的主题而示出，而不应是对本发明的一个限制。
实例1：质粒的制备和损坏的分析
根据Stratagene提供的方案，质粒pBluescript II通过来自Stratagene的XL1-蓝色MRF超能力细胞(supercompetent cells)的变形所生成。
然后，根据推荐的方案，质粒用恰根质粒组合体(midi kit)提纯质粒。
质粒的附加提纯
质粒放置在10ml、蔗糖梯度为5～20％、PH为7.5、25mM Tris HCl缓冲液中；1M NaCl；5mM EDTA；并在4℃和25000rpm下用SW-41转子的贝克曼超高速离心器进行分离。取出1ml在琼脂糖胶体上进行分析。仅仅保留含有至少90％的旋绕形态的质粒部分。质粒和溶解在PBS中的乙醇一起沉淀。
质粒改性
-UVC照射-环丁烷嘧啶二聚物(CPDs)和(6-4)光化产物的形成
在PBS中稀释至20ug/ml的质粒，用带有两个15W氖灯的生物砖(Bioblock)杀菌灯照射。三个质粒制剂分别用0.06、0.12和0.2J/cm2进行照射。
-用氯乙醛(CCA-Signa)处理-丙二醛-脱氧鸟嘌呤(MDA-dG)的形成
质粒在1mg/ml的PBS中制备，加入等量的CAA(水中为50％)。溶液在37℃下培育过夜。质粒通过沉淀恢复，并在蔗糖梯度上提纯。
-用反，反-2，4-癸二烯醛(DDE-Sigma)-艾塞诺-鸟苷和艾塞诺-腺苷的形成
PH为9.2的200ul的0.2M碳酸盐/重碳酸盐缓冲液和等量的THF以1mg/ml的量加入到200ul水中制备的质粒中。然后加入4ul的DDE和12ul、30％的双氧水。溶液在黑暗的情况、50℃下培育2小时。DDE通过用二氯甲两次萃取消除。DNA被沉淀，然后在蔗糖梯度上提纯。
-用内过氧化物DHPNO2处理-8-氧-2’-脱氧鸟苷的形成
20ul的内过氧化物溶液在37℃的情况下在质粒中培育2小时，该质粒为200ul，在PBS中稀释为1mg/ml。然后质粒沉淀并在蔗糖梯度上进行提纯。
质粒中的损坏分析
在同一条件下处理的一部分质粒DNA或一部分牛胸腺DNA用于分析改性基成分。
DNA和Douki et al.，J.Biol.Chem.，275，11678-11685描述的一样进行分解，并用HPLC-前后质谱进行分析。
得到下述每104正常基损坏的量。
需要注意的是，处理使损坏以不同的比例形成：
-UVC照射在很大范围的内形成环丁烷嘧啶二聚物(CPs)，在较小的范围内形成(6-4)光化产物，
-DDE主要形成艾塞诺-脱氧鸟苷，
-内过氧化物主要形成8-氧-2’脱氧鸟苷。
可以看到，这些试剂诱导了特定损坏的主要形成，该损坏靶向合适的不同的修复酶族。
实例2：根据本发明，在实例1制备的质粒范围实现本方法
质粒在载体上沉积
质粒在PBS中稀释为20ug/ml。在涂有商业用的多聚赖氨酸的玻璃载片上(VWR)用GESIM自动设备制备500微微升的沉淀。载片在4℃下保藏。
根据图1中的构型A，每个载片(载体S)含有设置的9个相同的区域(A1至A9)。
根据图2所述，在每个区域中的质粒范围被沉积，如所示的区域A1。
每个区域可以测试不同的生物培养基。
修复反应
制备含有生物培养基或要测试的提取液的溶液；对于5ul的溶液，成分如下：
-提取液 0.5ul
-5x修复缓冲液 1ul
-CY5-dUTP(AmershamPharmaciaBiotech)
(0.1nmol/μl) 0.2ul
-2M KCL 0.2ul
-ATP(Roche-100) 0.1ul
用水将体积补充为5ul。
5x修复缓冲液的成分
Hepes/KOH，200mM，PH7.8；35mM的MgCl2；2.5mM的DTT；2uM的dATP，2uM的dGTP；2uM的dCTP；50mM的磷酸肌酸；250ug/ml的肌氨酸磷酸激酶；0.5mg/ml的BSA；17％的甘油。
使用的细胞系
实例中使用的是源自三种不同细胞系的三种不同提取液。
■细胞系1：其为海拉(Hela)细胞。提取液使商业用和提取液，来自4C生物科技公司(比利时)。它们通过Dignam et al.(Nucl.Ac.Res.，1983，11，1475-1489)提出的方法进行制备。其蛋白质的含量为24mg/ml。
■细胞系2：该细胞系是来自经受着色性干皮病病人的AS203细胞，互补基团D。根据Manley et al.方案制备提取液。用微BCA组合体分析蛋白质可以测定44mg/ml的蛋白质的量。
■细胞系3：其为XP12RO细胞。该细胞系是来自经受着色性干皮病病人的AS203细胞，互补基团A。根据Manley et al.(Methods Enzymol.，1983，101，568-582)方案制备提取液。获得的提取液含有36mg/ml的蛋白质(微BCA分析组合体，Interchim)。
3ul的每种修复溶液沉积在载片单一区域的所有沉淀上。载片在30℃、湿润条件下培育3小时。载片用含有0.1％的Tween 20的PBS缓冲液清洗3次、清洗10分钟。然后用水漂洗15分钟。干燥后，可以看到荧光。
修复信号的分析
修复反应后，每个区域上的不同沉淀的荧光用635nm的Axon扫描器和GenePix Pro分析软件进行分析。然后测试三个一样点的平均值。于是得到每种类型改性的值。对每种细胞系绘制图表。这个图表和修复系统的绘制相对应，该修复系统和载体或切片上的损坏相关，并且特别适合所用的提取液。得到的结果如图3所示。荧光水平用任意的单位(AU)表示。
可以看到，每个图表是独一无二的，对于用于制备所用的细胞提取液的细胞系来说是特定的。因此，可以用于精确定量给定细胞提取液的总的修复活性，以及表示靶向系统的功能。
可以看到，海拉细胞两次修复DDE(主要是艾塞诺-dG)诱导的损坏的效果和修复由UV辐射(主要微CPD和(6-4))诱导的损坏的效果一样。可以看到，氧化性破坏(主要是8-氧-dG)修复的程度更弱。
对于AS203细胞系，最高的修复水平尽管很低，也可以看到UV-诱导的损坏。
关于XP12RO细胞系，可以看到，DDE-诱导的损伤(主要是艾塞诺-dG)被最有效的修复，释放出的信号比UVC辐射高三倍。一般都知道，XPA细胞系不修复CPDs；UVC-照射DNA获得的信号是(6-4)光化产物的修复产生的。
本发明意料外的优点是：对于给定的提取液，即使提取液之间的蛋白质的量不同，得到的含有损坏的DNAs的信号和对照DNA的信号的比率可以用于比较不同提取液彼此间的修复能力。
机译： 至少一种生物介质的全局和特定DNA修复能力的定量评估方法及其应用
机译： 至少一种生物介质的全局和特定DNA修复能力的定量评估方法及其应用
机译： 至少一种生物介质的全局和特定DNA修复能力的定量评估方法及其应用
